双向电泳.pptx

双向电泳双向电泳姓名：梁XX专业：动物遗传育种与繁殖由于基因表达水平与蛋白质水平之间并不完全相关，我们仍然得不到完整的信息.其解决办法之一是直接研究基因的产物蛋白质1994年Wilkin和Williams提出蛋白质组这一概念后，蛋白质组在生物学界得到了充分关注，而蛋白质组的开门技术 双向电泳，双向电泳由OFarrell于1975年首次建立的。双向电泳(2DE/DIGE)实验组和对照组样品制备提出生物学问题凝胶图像分析差异蛋白点选取蛋白酶解及质谱分析差异蛋白点的成功鉴定生物学问题的解释技术流程技术流程 双向电泳（DIGE）示意图样品1：Cy3标记样品2：Cy5标记将标记的样品混合双向电泳分离荧光扫描仪扫描图像重叠分析样品制备一般性原则一般性原则尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失减少对蛋白质的人为修饰破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态双向电泳双向电泳第一向：等电点聚焦（第一向：等电点聚焦（IEF）第二向：第二向：SDS聚丙酰胺凝胶电泳（聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)第一向：等电点聚焦（第一向：等电点聚焦（IEF）原理：是根据蛋白质等电点的不同进行分离，蛋白质是两性分子，根据其周围环境PH可以带正电荷，负电荷或静电荷为零。等电点（PI）是蛋白质所带静电荷为零时的PH，周围PH小于其PI时，蛋白质带正电荷，大于PI时带负电荷。IEF对蛋白质处于一个PH梯度中，在电场的作用下，蛋白质将移向正极，直至到达等电点，如果蛋白质在其等电点，附近扩散，那么它将带上电荷重新移回等电点。等等电电聚聚焦焦电电泳泳进进行行过过程程中中等等电电聚聚焦焦电电泳泳结结束束后后（）（）（）（）（）（）（）（）高高pH高高pH低低pH低低pH第二向：第二向：SDS聚丙酰胺凝胶电泳（聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)原理：低离子强度时，SDS主要以单体形式存在，此时它可以与蛋白质结合生成蛋白质-SDS复合物。当SDS单体浓度大于1mmol/L时，它与多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/g蛋白质。由于SDS带有大量负电荷，从而掩盖了不同蛋白质间电荷的差异，使所有蛋白质都带有相同密度的负电荷，于是蛋白质间不存在电荷密度的差别。而SDS蛋白质复合物都是椭圆棒形，无形状差别，棒的长度与蛋白质亚基分子量有关，所以在SDS-PAGE中蛋白质仅存在分子大小的差别，于是可利用分子量差异将各种蛋白质分开（分子筛效应）因此SDS-PAGE正常用于测定蛋白质亚基的分子量及鉴定纯度。双向电泳（2DE）示意图提取的总蛋白溶液等电聚焦，实现蛋白质按等电点进行分离SDS-PAGE分离，使得蛋白质按分子量大小排序分子量大小通过双向电泳使得不同等电点和分子量的蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同位置从而实现蛋白质的双向分离蛋白检测蛋白检测硝酸银染色硝酸银染色 优点：灵敏度高，缺点：重复性差，质谱兼容性低考马斯亮兰染色：考马斯亮兰染色：优点：重复性好，质谱兼容性高 缺点：灵敏度低荧光染色：荧光染色：优点：重复性好，质谱兼容性高、灵敏度高 缺点：价格贵其它染色方法：其它染色方法：胺基黑染色、印度墨水染色、金属盐负染等上海博苑生物科技有限公司上海博苑生物科技有限公司http:/http:/SYPRO Ruby 蛋白染色 (荧光)Bio-Safe 考马斯蓝染(可见光)银染(可见光)背景信息背景信息不同的染色方法不同的染色方法2D-PAGE问题与原因问题与原因 染色的问题染色的问题问题与现象问题与现象可能原因与解决措施可能原因与解决措施水平条纹水平条纹聚焦时间太短聚焦时间太短(尤其对于相对分子质量较高的蛋白质尤其对于相对分子质量较高的蛋白质)或太长或太长(蛋白质会分解蛋白质会分解)；优化聚焦时间优化聚焦时间去垢剂浓度太低或使用了不合适的去垢剂；去垢剂浓度太低或使用了不合适的去垢剂；检查去垢剂浓度检查去垢剂浓度,测试不同的去垢剂测试不同的去垢剂尿素浓度太低；尿素浓度太低；重泡涨液的浓度不低于重泡涨液的浓度不低于8mol/LIPG胶条时间太短，没有重泡涨到其原始厚度；胶条时间太短，没有重泡涨到其原始厚度；重泡涨胶条至重泡涨胶条至0.5mm厚，时间大于厚，时间大于6h或过夜或过夜裂解液或重泡涨液的裂解液或重泡涨液的DTT浓度不够；浓度不够；裂解液的裂解液的DTT浓度为浓度为65mmol/L或重泡涨液的或重泡涨液的DTT浓度为浓度为18mmol/L单个蛋白质的多重氧化；单个蛋白质的多重氧化；加足够量加足够量DTT，等电聚焦时加上矿物油，矿物油脱气或充上惰性气体，等电聚焦时加上矿物油，矿物油脱气或充上惰性气体由于由于DTT朝阳极移动，碱性端朝阳极移动，碱性端DTT消耗；消耗；在阴极加上在阴极加上20mmol/L DTT润湿的电极垫片润湿的电极垫片错误的电极加样区域；错误的电极加样区域；检查阳极还是阴极加样比较好，或者使用样品的胶内重泡涨方式加样检查阳极还是阴极加样比较好，或者使用样品的胶内重泡涨方式加样由于样品的内源性水解造成的假象；由于样品的内源性水解造成的假象；用用TCA丙酮法处理失活蛋白酶，加入蛋白酶抑制剂或与丙酮法处理失活蛋白酶，加入蛋白酶抑制剂或与SDS一起煮一起煮空气中的空气中的CO2干扰；干扰；等电聚焦时加矿物油，密封电泳腔或在腔内加上等电聚焦时加矿物油，密封电泳腔或在腔内加上NaOH润湿的纸片去除润湿的纸片去除CO2相对分子质量为相对分子质量为68000或或55000的条纹，可能有角蛋白或白蛋白污染，或者由巯基乙醇造成；的条纹，可能有角蛋白或白蛋白污染，或者由巯基乙醇造成；过滤所有溶液，用过滤所有溶液，用DTT取代巯基乙醇取代巯基乙醇蛋白质加样处产生沉淀；蛋白质加样处产生沉淀；等电聚焦时采用低电压等电聚焦时采用低电压蛋白质抽提时有不溶物在样品中；蛋白质抽提时有不溶物在样品中；高速离心高速离心40000g 1h垂直条纹垂直条纹蛋白质从一向转移到二向时发生沉淀；蛋白质从一向转移到二向时发生沉淀；提高平衡的提高平衡的SDS浓度，适当延长平衡时间浓度，适当延长平衡时间蛋白质上样量过大；蛋白质上样量过大；降低上样量降低上样量水不够纯净，水不够纯净，SDS-PAGE胶配制时没有过滤胶配制时没有过滤(背景有极细的条纹背景有极细的条纹)或者胶条平衡后仍带有额外的或者胶条平衡后仍带有额外的DTT；使用使用Millipore水，过滤胶液。使用水，过滤胶液。使用IAA平衡平衡IPG胶条，去除额外的胶条，去除额外的DTT成对的竖直条纹遍布于胶上；成对的竖直条纹遍布于胶上；可能是有硫脲引起的，原因尚不明可能是有硫脲引起的，原因尚不明图像分析常用软件：常用软件：Image-Master(Image-Master(GE Healthcare)PDquest(PDquest(Bio-Rad)分析步骤：胶点检测和定量、凝胶匹配、比较分析步骤：胶点检测和定量、凝胶匹配、比较分析分析 上海博苑生物科技有限公司上海博苑生物科技有限公司http:/http:/蛋白质的胶内酶切 包括感兴趣蛋白点的挖取、含蛋白质凝胶的脱色、胶内蛋白质的酶切等过程 蛋白质的氨基酸序列确定蛋白质的氨基酸序列确定 每每一一种种蛋蛋白白质质都都具具有有唯唯一一的的氨氨基基酸酸序序列列。实实际际上上蛋蛋白白质的氨基酸序列是由质的氨基酸序列是由DNA决定的。决定的。一级一级结构结构二级二级结构结构三级三级结构结构四级四级结构结构A.蛋白质的氨基酸组成的定量确定蛋白质的氨基酸组成的定量确定酸水解：破坏蛋白质的肽键酸水解：破坏蛋白质的肽键柱层析：进行氨基酸定量分析，每个氨基酸的量与洗脱峰柱层析：进行氨基酸定量分析，每个氨基酸的量与洗脱峰 的面积成比例。的面积成比例。B.Edman降解方法常用于氨基酸序列的测定降解方法常用于氨基酸序列的测定第一轮降解第一轮降解第二轮降解第二轮降解C.大蛋白被水解成肽段后再测序大蛋白被水解成肽段后再测序 Edman降降解解法法测测序序一一次次只只能能连连续续降降解解几几十十个个氨氨基基酸酸残残基基。要要测测定定大大的的蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸序序列列，需需要要将将蛋蛋白白质质降降解解为为一一些些肽肽段段，然然后后再再进进行行Edman降降解解测测序。序。溴化氰（溴化氰（溴化氰（溴化氰（BrCNBrCN）：可以特异与蛋白质中的蛋氨酸残基反应：可以特异与蛋白质中的蛋氨酸残基反应 生成一个生成一个C末端为高丝氨酸内酯的肽和一个带有新的末端为高丝氨酸内酯的肽和一个带有新的N 末端残基的肽。末端残基的肽。胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶：特异地催化赖氨酸（特异地催化赖氨酸（Lys）残基和精氨酸（）残基和精氨酸（Arg）残基羧基侧的肽键的水解，残基羧基侧的肽键的水解，胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶：特异地催化苯丙氨酸（：特异地催化苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸）、酪氨酸 （Tyr）和色氨酸（）和色氨酸（Trp）三种芳香族氨基酸残基羧基一）三种芳香族氨基酸残基羧基一 侧的肽键水解。侧的肽键水解。