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分子生物学常用实验技术课堂练习题 参考答案学号： 姓名： 一、填空题。1. 在用SDS分离DNA时，要注意SDS浓度，0.1%和1%的SDS作用是不同的，前者 ，后者 。2. SDS是一种提取DNA时常用的阴离子去污剂，它可以溶解膜蛋白和脂肪，使细胞膜和核膜破裂，使核小体和核糖体解聚，释放出 。它还可以使蛋白质变性沉淀，也能克制 。3. 在分离DNA时，需要带手套操作，是由于 。4. 用酚-氯仿抽提DNA时，通常在氯仿或酚-氯仿中加入少许异戊醇，这是由于有机溶剂异戊醇可以 。此外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白质相和下层有机溶剂相维持稳定。5. 在分离DNA时，要用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸等，其目的是： 。6. 在DNA分离过程中，导致DNA分子断裂的因素很多，重要有： 、 和 。7. 在分离DNA时，常用酸变性、碱变性、热变性和 来去除蛋白质。8. 用乙醇沉淀DNA的原理是： 。9. 用乙醇沉淀DNA时，通常在DNA溶液中加入单价阳离子，如氯化钠和乙酸钠，其目的是 。10. 通常可在3种温度下保存DNA：45、-20和-70，其中以 为好。11. 浓缩DNA的方法通常有：包埋吸水法、蒸发法、膜过滤法和 。12. 碱裂解法和清亮裂解法是分离质粒的两种常用方法，两者的原理不同，前者是根据 ，后者是根据 。13. 在 技术中，DNA限制性酶切片段经凝胶电泳分离后，被转移到硝酸纤维素薄膜上，然后与放射性标记的DNA探针杂交。14. SSC是氯化钠和柠檬酸钠组成的试剂，其中前者作用是： ，后者的作用是： 。15. 在southern杂交中，DNA转移的速度取决于 、 和 。16. 在重蒸酚中加入1%的8-羟基喹啉及少量-巯基乙醇，不仅可以防止酚氧化，还可以克制 活性以及 。17. RNA分子经凝胶电泳后按大小不同分开，然后被转移到一张硝酸纤维素膜（尼龙膜）上，同一放射性DNA探针杂交的技术称 _ _。18. 根据Northern杂交结果可以说明 _ _。19. cDNA技术是进行真核基因克隆的一种通用方法，由于它可以用 为模板。20. 将具有一个mRNA的DNA拷贝的克隆称为一个 ，源于同一批RNA制备物的克隆群则构建成了一个 。21. 受体细胞的感受态是 的生理状态。22. 感受态细胞是可以诱导的，诱导方法有 、 和 等。23. 人工感受态细胞的大肠杆菌在温度为 时吸附DNA，在 时摄入DNA。24. 为了提高重组DNA分子对E . coli的转化效率，通常可采用 和 。25. 环状质粒的转化效率很低，通常是线性双链DNA转化效率的 。26. Sal是辨认6个核苷酸的酶，其辨认切割的理论值是每 个碱基就有一个切点，但在哺乳动物中大约300Kb个碱基才有一个切点。27. 重组DNA技术常用的限制性内切核酸酶可辨认某些特异碱基序列，具有 结构。28. 产生平末端的方法通常有： 、 和 。29. 在酶切反映管加完各种反映物后，要离心2秒，其目的是： 和 。30. 连接酶是一类用于核酸分子连接形成 的核酸合成酶，有DNA连接酶和RNA连接酶之分。31. 为了防止载体DNA自身环化，可用 脱去双链DNA的 。32. 用于克隆的DNA片段，在质量上规定：1）稳定性，保持其分子构型；2）低蛋白质含量；3）纯度要高，不含 ；4）不含可透析的小分子，如酒精等。33. 构建基因组文库时连接方法重要是 ；而构建cDNA 文库，可用 或 。34. 克隆一个编码某种蛋白质的基因必须考虑其表达的三个基本条件： 、 和 。二、判断题。1. 氯霉素扩增DNA 时，加氯霉素的时间是重要的，由于加得太早，菌数不够，加人时间过迟，菌龄过老，容易自溶。（ ）2. 在DNA 贮存液中加一滴三氯甲烷，可防止真茵的污染。（ ）3. DNA、RNA在pH8.5的TAE缓冲夜中电泳时，由正极向负极移动。（ ）4. 作为一个基因克隆的载体，重要由药物抗性基因、供插入外源DNA片段的多克隆位点和外源片段插入筛选标志这3大部分构成。（ ）5. 用pUC质粒作克隆载体克隆DNA时，人们用显色法筛选重组质粒，即在有IPTG和X-gal的平板上，显示白色的菌落具有原始质粒，而显示蓝色的菌落具有重组质粒。（ ）6. 在克隆载体pUC系列中，完整的lacZ基因提供了一个外源基因插入的筛选标记，蓝色的转化菌落通常表白克隆是失败的。（ ）7. 在克隆载体pBSK质粒中，运用完整的lacZ基因作为筛选标记，白色的转化菌落表白重组质粒肯定插入外源片段。（ ）8. X-gal显色反映的基本原理是使载体与受体互补的失活。（ ）9. 碱法和煮沸法分离质粒DNA的原理是不同的。（ ）10. 根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、cDNA文库等。（ ）11. 一旦有了一套已知序列的基因组克隆，通过从文库中获得覆盖目的突变基因所在基因组区的所有克隆，就可以进行染色体步移。（ ）12. 核酸杂交的原理是根据分子间杂交。（ ）13. 在Northern杂交中，为了防止RNA形成部分发夹结构，影响迁移率，所以要用变性缓冲液进行电泳。（ ）14. 用限制性内切核酸酶Bgl（辨认位点是AGATCT）酶切载体DNA，用BamH（辨认位点是GGATCC）酶切供体DNA，可以直接通过粘性末端进行连接。（ ）15. 不匹配的粘性末端可以通过部分填补或补平后进行连接。（ ）16. 单克隆抗体是淋巴细胞和瘤细胞杂交后形成的单个杂交瘤细胞经无性繁殖而生特异性抗体。（ ）17. 基因组学强调从基因组的整体而不是单个基因的角度把握生物体遗传变异的规律。（ ）18. 运用足够数量的STS标签，可拟定所有DNA大片段在染色体或基因组中的位置。（ ）19. clone contig法的原理是一方面用酸水解法把待测基因组降解为数10万碱基对以上的片段，再分别对各片段进行测序。（ ）20. 靶标鸟枪法一方面根据染色体上已知基因或遗传标签的位置来拟定部分DNA片段的排列顺序，再逐步拟定各片段在染色体上的相对位置。（ ）三、单项选择题。1. 乙醇沉淀DNA时，下列何种长度的核苷酸不能被沉淀？ _ A、10bp；B、100bp；C、200bp； D、1000bp。2. 用碱法分离质粒DNA的基本原理是：_ A、染色体DNA断裂成碎片； B、染色体DNA 分子量大，不能释放； C、染色体DNA变性后来不及复性；D、染色体DNA未与蛋白质分开而沉淀。3. Southern杂交可检测_： A、目的基因的表达丰度B、基因组中目的基因的存在 C、蛋白质表达 D、目的基因是否表达4. 蛋白质双向电泳中，_决定了SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率。 A、等电点B、相对分子量C、空间结构D、电荷量5. 粘末端连接法，不仅操作简朴，并且 _ A、产生新切点；B、易于回收外源片段；C、载体不易环化；D、影响外源基因表达。6. 下面哪一种不是产生限制性内切酶星号活性的重要因素：_A、酶切反映体系中酶浓度过低；B、甘油含量过高；C、酶切反映体系中具有有机溶剂；D、具有非镁离子的二价阳离子。7. 关于cDNA 的最对的的提法是：( ) A、同mRNA互补的单链DNA ； B、同mRNA 互补的双链DNA；C、以mRNA为模板合成的双链DNA； D、以上都对的。8. 在分离mRNA的溶液中，Mg2+离子的浓度不能低于0.5m mol/L，由于低了_A、mRNA会降解；B、mRNA会沉淀；C、核搪体解体； D、mRNA会变性。9. 关于类限制性内切酶的作用，下列不对的的是：_A、辨认序列长度一般为4-6bp； B、辨认序列通常具有回文结构；C、辨认和切割双链DNA分子； D、只能切割非甲基化序列。10. 有关PCR的描述下列哪项不对的？_A、是一种酶促反映； B、引物决定了扩增的特异性；C、扩增的对象是DNA序列；D、扩增的对象可以是氨基酸。11. PCR实验的特异性重要取决于：_A、DNA聚合酶的种类； B、反映体系中模板DNA的量；C、引物序列的长度和结构； D、PCR buffer中的镁离子浓度12. 蓝白斑实验筛选时，加入IPTG的作用是： _ A、诱导肽的合成； B、作为酶作用的底物； C、诱导肽的合成； D、作为显色反映指示剂。13. 基因敲除（knock out）方法重要用来阐明： _ A、基因的结构；B、基因的调控；C、基因的表达；D、基因的功能。14. _运用单链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。 A、RNA干扰技术；B、原位杂交技术； C、RACE技术； D、点突变技术。四、名词解释。1. 载体：2. 限制性核酸内切酶：3. cDNA：互补DNA，指以mRNA为模板反转录得到的DNA。4. 聚合酶链反映（polymerase chain reaction, PCR）：5. RT-PCR (reverse transcription PCR)：以mRNA为模板先逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行聚合酶链式反映。6. Real-time PCR：7. cDNA文库（cDNA library）：8. 基因文库（gene library）：9. 定点突变技术（site-directed mutagensis）：10. 酵母单杂交系统（yeast one-hybrid system）：提醒：该系统目的：用于鉴定DNA和蛋白质之间的互相作用。11. 酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）：提醒：该系统目的：鉴定反式作用因子之间的互相作用对真核基因转录调控的影响。12. 凝胶阻滞实验（electrophortic mobility shift assay, EMSA; gel retardation）：13. RACE（Rapid amplification of cDNA End）技术：14. RNA干扰（RNA interference，RNAi）：15. 核酸杂交，southern blotting，Northern blotting，western blotting16. 转化17. DNA芯片18. 基因组学19. 功能基因组学20. 比较基因组学（comparative genomics）21. 蛋白质组学22. 转录谱（expression profiling）23. 表达序列标签（expressed sequence tag, EST）五、简答题：1. 在分离DNA过程中，为什么苯酚和氯仿联合使用？即使不联合使用也要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一次？提醒：因素是酚和水有一定限度的互溶，所以单独使用酚抽提DNA，最终不能除去酚，残留的酚会使限制性核酸内切酶、Taq酶和连接酶变性，影响后续实验。氯仿也是蛋白质变性剂，它不与水互溶，但它与苯酚互溶。这样，两者联合使用，可让DNA溶液中没有残留酚。2. 比较说明SDS-PAGE（SDS-聚丙烯胺凝胶电泳）与琼脂糖凝胶电泳的分离原理和特点。提醒：SDS-PAGE：1）SDS作用；2）分子筛；3）重要用于蛋白质的定性分析、分离。琼脂糖凝胶电泳：1）凝胶的孔径；2）用于蛋白质和核酸电泳，双链DNA的电泳迁移率重要与其分子大小有关。3. 简述PCR扩增的原理及过程。提醒：PCR技术的基本原理：在模板、引物、4种dNTP和赖耐热DNA聚合酶存在的条件下，按照碱基互补配对的原则，特异扩增DNA区段。PCR的过程：变性-退火-延伸，三个基本环节循环。4. 什么是蓝白斑筛选？为什么蓝白斑筛选法也会有假阳性？提醒：该法是运用组织化学的方法，通过插入失活来筛选重组体。因素是：-半乳糖苷酶的N端不是必须的，对其修饰不会影响酶的活性或肽的互补性。假如插入的外源片断引起肽ORF的移码，或外源片断具有终止密码使得肽不表达，就会形成白色斑。假如插入的片断不含终止密码、是3的倍数，仍然会形成蓝色斑。5. 酵母单杂交的原理。很多真核转录调控因子有两个互相独立的结构域组成：DNA结合域（DNA binding domain, BD）和转录激活域 (activation domain, AD)。BD能和特定的基因的启动子区结合，但不能接获基因的转录。 酵母单杂交是一种研究DNA和蛋白质互相作用的系统，运用基因重组技术将特定顺式作用元件构建到基本启动子上游，把报告基因连接到基本启动子下游。将待测转录因子cDNA与已知酵母激活域（AD）融合表达载体转入酵母，假如待测转录因子能和顺式作用元件结合，就能激活基本启动子，从而激活报告基因的表达。6. 现已知一种蛋白因子可以与DNA上的一段100bp的专一序列结合，请设计出克隆这种蛋白因子的cDNA的基本技术路线。提醒：酵母单杂方法。7. 从GenBank中查到某一基因的cDNA序列，如何得到该基因的内含子序列？提醒：根据cDNA序列设计引物，以基因组DNA为模板PCR，产物测序后，序列比对。8. 从GenBank中查到某一基因的完整ORF序列，如何得知其mRNA的加帽和加尾信息？提醒：5-RACE和3-RACE。9. 转录因子一般具有转录激活域和DNA结合域，简述它们的作用。DNA辨认或结合域能和特定的基因的启动子区结合，但不能接获基因的转录。对各种转录因子的序列进行比较，可发现其基序(motif)的共同点是都与DNA结合。基序通常很短，仅为蛋白质结构中的一小部分。在蛋白质与转录装置互相作用中，负责激活转录的基序可以被鉴定出来。转录激活结构域可以在适当的空间激活转录。10. 简述凝胶阻滞实验（EMSA）的原理。EMSA 是体外分析DNA与蛋白质互相作用的一种特殊的凝胶电泳技术，用放射性同位素标记待测DNA片段，然后与提取物温育，形成DNA-蛋白质复合物，电泳后用放射性自显影技术可以拟定DNA条带的位置，从而拟定它与蛋白质是否结合。基本原理：蛋白质与DNA结合后，将大大增长DNA分子量，在凝胶电泳中，DNA朝正电极移动的距离与其相对分子量成正比。没有结合蛋白质的DNA移动较快，结合了蛋白质的DNA由于受到阻滞移动较慢。11. 现在已知一个基因的启动子序列（涉及其顺式作用元件和基本启动子），如何找到调控该基因表达的反式作用因子？提醒：有多种方案。EMSA是其一。12. 简述sanger DNA测序法的原理和基本过程。 双脱氧测序法原理：2,3-ddNTP与普通dNTP不同之处在同它们在脱氧核糖的3 位置缺少一个羟基，可以在DNA聚合酶作用下通过其5 三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于没有3羟基，它们不能同后续的dNTP形成磷酸二酯链，因此，正在增长的DNA链不也许继续延伸。核酸模板在核酸聚合酶、引物、4种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，假如在四管独立的酶反映系统中分别按比例引入4种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反映体系中便合成以共同引物为5端，以双脱氧碱基为3端的一系列长度不等的核酸片段，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。反映终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。基本过程： 1）分离待测核酸模板，模板可是DNA，也可是RNA，可是双链，也可是单链。 2）在4只试管中分别加入适当的引物、模板、4种dNTP(涉及放射性标记dATP，例如32P标记的dATP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸)。 3）与单链模板（如以双链作模板，要作变性解决)结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5端向3端进行延伸反映，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。 4）用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反映管中的反映产物，由于每一反映管中只加一种ddNTP(如ddATP)，则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3 末端都为同一种双脱氧碱基。 5）放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。13. 如何用PCR法获得点突变DNA分子？指通过聚合酶链式反映（PCR）等方法向目的DNA片段中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），涉及碱基的添加、删除、点突变等。采用品有互补末端的引物，使产物形成了重叠链从而在随后的扩增反映中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。该技术重要涉及以下几步：设计引物，扩增基因两端，回收两端片段，两端片段退火延伸，扩增全长基因。实验环节：1） 引物设计：引物F及R为基因两端特异引物，其中Fm及Rm为中间引物。其中引物Fm及Rm中间共享一段序列（至少10bp完全匹配，否则后续实验很难成功），突变点可以设计在Fm或Rm，也可以两条引物上都有突变点；2）分别用引物F和Rm及Fm和R进行配对用pfu酶进行PCR；3）分别用胶准确回收第2步所得两条目的PCR产物带；4）将第3步所得两份PCR产物进行混合使其互为模板及引物，加入dNTP及Pfu或Taq酶进行5-10轮PCR。5）取第4步PCR产物做为模板，加入引物F及R进行PCR扩增出具有突变的全基因。14. 什么是RNAi？试述其应用和发展前景。RNAi (RNA interference) 即RNA干涉，是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。或是RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目的的转基因沉默现象。应用：1）RNAi方法在植物遗传及发育等研究领域得到广泛的应用。通过基因敲除来调控某个代谢途径的关键基因，筛选出目的性状改良的个体，如抗病或耐旱植株。Gutterson等敲除了康乃馨的一种激素，使花期延长。多聚半乳糖醛激酶在西红柿成熟时消化细胞壁，Zenera实验室将它敲除后，西红柿可晚一些采摘，味道变得更为鲜美。2）RNAi是研究候选基因功能、信号转导通路的新方法。从大规模数据库中获得全基因组序列，找到感爱好基因的序列，据此设计出使该基因沉默的dsRNA，研究该候选基因沉默或下调后的性状表现，从而探讨该候选基因的功能。Clemens等应用RNAi亦研究了果蝇细胞系中胰岛素的信号转导通路。15. 获得一个功能未知的基因克隆后，如何才干阐述该基因的功能？提醒：对此基因进行定位，运用基因敲除或RNAi技术封闭此基因，寻找蛋白表达的差异和生物体遗传表型的差异，通过研究荧光探针定位此蛋白的分布，通过研究蛋白与蛋白互相作用拟定其在细胞中的功能。16. 假如知道某基因的功能及其相应得蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法克隆该基因？提醒：可以通过合成核苷酸探针或设计兼并PCR引物从基因组文库（或cDNA）文库中筛选。或者运用相应的抗体从cDNA表达文库中筛选相应的克隆。17. 常用的基因表达研究技术有哪些？18. 什么是遗传图谱？答案1：遗传图又称为连锁图，是指标志基因或DNA在染色体上的相对位置与遗传距离，后者通常以基因或DNA 片段在染色体互换过程中的分离频率（厘摩，cM ）来表达，cM 值越大，两者之间距离越远。遗传图的绘制方法是以染色体上某一点为遗传标记，以与之相伴的遗传特性为对象，经连锁分析，测定遗传距离，将编码该特性的基因定位于染色体特定位置。连锁分析的实质是通过度析同一遗传位点在不同个体中档位基因的不同来研究同一染色体上两个位点之间的互相关系，科学上用减数分裂过程中这两个位点之间的互换或重组频率来表达其遗传学距离。答案2：通过遗传重组所得到的基因在具体染色体上线性排列图称为遗传连锁图。它是通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率，拟定他们的相对距离，一般用厘摩(cM，即每次减数分裂的重组频率为1%)来表达。绘制遗传连锁图的方法有很多，但是在DNA多态性技术未开发时，鉴定的连锁图很少，随着DNA多态性的开发，使得可运用的遗传标志数目迅速扩增。初期使用的多态性标志有RFLP(限制性酶切片段长度多态性)、RAPD(随机引物扩增多态性DNA)、AFLP(扩增片段长度多态性)；80年代后出现的有STR(短串联反复序列，又称微卫星)DNA遗传多态性分析和90年代发展的SNP（单个核苷酸的多态性）分析。 19. 什么是物理图谱？答案1：物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段（序列标签位点，即STS；或是一类染色体定位明确且可用PCR扩增的单拷贝序列）为“路标”，以碱基对( bp , kb , Mb ）作为基本测量单位（图距）的基因组图。答案2：物理图谱是运用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠序列拟定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离碱基对(bp) 或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)的图谱。以人类基因组物理图谱为例，它涉及两层含义，一是获得分布于整个基因组30 000个序列标志位点（STS，其定义是染色体定位明确且可用PCR扩增的单拷贝序列）。将获得的目的基因的cDNA克隆，进行测序，拟定两端的cDNA序列，约200bp，设计合成引物，并分别运用cDNA和基因组DNA作模板扩增；比较并纯化特异带；运用STS制备放射性探针与基因组进行原位杂交，使每隔100kb就有一个标志；二是在此基础上构建覆盖每条染色体的大片段：一方面是构建数百kb的YAC(酵母人工染色体)，对YAC进行作图，得到重叠的YAC连续克隆系，被称为低精度物理作图，然后在几十个kb的DNA片段水平上进行，将YAC随机切割后装入粘粒的作图称为高精度物理作图。遗传图表现得是通过连锁分析拟定的各基因间的相对位置；物理图表现的是染色体上每个DNA片段的实际顺序。20. 什么是图位克隆？图位克隆(Map - based cloning) 又称定位克隆(positional cloning)，1986 年一方面由剑桥大学的Alan coulson 提出。用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA 顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息，但应有以下两方面的基本情况：一是有一个根据目的基因的有无建立起来的遗传分离群体,如F、DH、BC、RI 等。二是开展以下几项工作：1) 一方面找到与目的基因紧密连锁的分子标记；2) 用遗传作图和物理作图将目的基因定位在染色体的特定位置；3) 构建具有大插入片段的基因组文库(BAC 库或YAC) ；4) 以与目的基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库；5) 用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群；6) 通过染色体步行、登陆或跳跃获得具有目的基因的大片段克隆；7) 通过亚克隆获得具有目的基因的小片段克隆；8) 通过遗传转化和功能互补验证最终拟定目的基因的碱基序列。