酶工程考点总结.doc

第一章1， 什么是酶？试述酶的化学本质？酶是生物体内普遍存在的一种具生物催化活性的蛋白质（或核酸）,能在不改变化学反映平衡点的条件下大大减少反映的活化能,从而使化学反映可以在常温常压下迅速高效地进行. 2， 酶促反映速度的概念，表达方法（底物消耗，产物生成），影响酶促反映的因素（至少4种）？酶催化反映的速率称作酶速度；酶促反映速度就是用一定期间内底物减少或产物生成的量来表达反映的进程。影响酶促反映的因素：pH、温度、激活剂、克制剂3， 写出米氏酶促反映动力学方程并说明其含义.Km值有何物理意义? 如何测量Km值和Vmax值?vo=Vmax SKm + SKm值物理意义：（1） km是酶的一个基本的特性常数。其大小与酶的浓度无关，而与具体的底物有关，且随着温度、pH和离子强度而改变。（2）从km可判断酶的专一性和天然底物。 Km最小的底物，通常就是该酶的最适底物，也就是天然底物。（3）当k2k3时， km的大小可以表达酶与底物的亲和性。（4）从km的大小，可以知道对的测定酶活力时所需的底物浓度。（5）km还可以推断某一代谢物在体内也许的代谢途径。测量Km值和Vmax值的方法：米氏常数可根据实验数据作图法直接求得：先测定不同底物浓度的反映初速度，从v与S的关系曲线求得V，然后再从1/2V求得相应的S即为Km（近似值）。4， 充足理解酶的不可逆克制,可逆克制(竞争性、非竞争性、反竞争性），理解在上述克制过程中Km和Vmax的变化不可逆克制作用：克制剂与酶的结合（共价键）是不可逆的。通常是与靠近活性部位的氨基酸残基形成共价键，永久地使酶失活。可逆克制作用：克制剂与酶的结合是可逆的。克制限度是由酶与克制剂之间的亲和力大小、克制剂的浓度以及底物的浓度决定。竞争性克制作用：克制剂和底物竞争与酶结合。特点：1）克制剂和底物竞争酶的结合部位2）克制限度取决于I和S的浓度以及与酶结合的亲和力大小。3）竞争性克制剂的结构与底物结构十分相似。（第一幅图）非竞争性克制作用：底物和克制剂同时与酶结合，但形成的EIS不能进一步转变为产物。 图一 图二5， 结合物质代谢过程中举例说明别构酶的概念？有些酶具有类似血红蛋白那样的别构效应，称为别构酶。6， 对的理解酶活性单位的概念。什么是酶的国际单位及其定义？(不能用考马斯亮蓝，由于不能测量目的蛋白的含量)酶活力是指酶催化某一化学反映的能力。酶（活力）单位：在一定条件下，一定期间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。（U/g，U/ml） 国际单位: 在最适的反映条件（25）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即 1IU=1mol/min7， 酶的纯度的概念及测量酶的纯度的方法？酶的纯度：单位蛋白中所含的活力单位数， 比活力 = 活力单位数/ 毫克蛋白（氮）酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法8， 分离提纯技术手段？在酶的分离提纯过程中重要技术指标是什么？（理解）纯化技术：凝胶过滤、离子互换、色谱聚焦、疏水作用、亲和分离、反相等书本20页，这题的知识有点散乱，所以大家有爱好在看看，这题答案不拟定9， 酶活性中心,必需氨基酸,反映活化能,单纯酶,全酶(结合酶),辅酶,辅基,单体酶,寡聚酶 ,多酶复合体,同工酶,酶原激活酶活性中心：存在于酶分子表面的具有结合和催化底物形成产物的空间区域；涉及结合基团和催化基团。必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。(必需氨基酸?)必需氨基酸：反映活化能：分子由常态转变为活化状态所需的能量。是指在一定温度下，1mol 反映物所有进入活化状态所需的自由能。单纯酶：全酶：（结合酶）= 酶蛋白 + 辅因子辅酶：与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。辅基：与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。单体酶（monomeric enzyme)：仅有一条具有活性部位的多肽链，所有参与水解反映。寡聚酶 (oligomeric enzyme)：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。多酶复合物 (multienzyme system)：几个酶镶嵌而成的复合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反映。同工酶：能催化相同的化学反映，但在蛋白质分子的结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。酶原的激活：没有活性的酶的前体称为酶原。酶原转变成有活性的酶的过程称为酶原的激活。10， 试述国际酶学委员会关于酶的分类及命名的原则,国际酶编号的含义及表述.分几大类?分6大类：1。氧化还原酶类；2.转移酶；3.水解酶；4.裂合酶；5.异构酶；6.连接酶（合成酶）酶的编号(每种酶都有其唯一的独特的编号, 可以看出酶的基本性质)：统一表达为：(EC 数字1.数字2.数字3.数字4)，其中EC: Enzyme Commission(酶学委员会)如: 乳酸脱氢酶(乳酸:NAD:氧化还原酶 (EC 1.1.1.27),表达该酶为第一大类(氧化还原酶类),属其中的第一亚类(作用于CH-OH基团), 同时表达该酶属第一亚-亚类(表达其受体是NAD+或NADP+) 第二章11， 固定化酶活力概念（注：限制酶的活动空间，不是固体化）固定化酶的概念：在一定空间内呈闭锁状态存在的酶,能连续地进行反映,反映后的酶可以回收使用.(不一定是固体)固定化：运用一定措施将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反映，并可回收及反复使用的一类技术。12， 固定化酶与游离酶相比较的优势?固定化酶的优势：极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；可以在较长时间内进行反复分批反映和装柱连续反映酶反映过程可以加以严格控制；较游离酶更适合于多酶反映；在大多数情况下，可以提高酶的稳定性；可以增长产物的收率，提高产物的质量；酶的使用效率提高、成本减少。固定化酶的缺陷：固定化时，酶的活力有损失；只能用于可溶性底物，并且较合用于小分子底物，对大分子底物不适宜；增长了生产的成本，工厂初始投资大；与完整菌体相比不适宜于多酶反映，特别是需要辅助因子的反映；胞内酶必须通过酶的分离手续 13， 评价固定化好坏的指标（偶联率，相对活力，活力回收，半衰期）偶联率，是中间指标，表达酶被固定化的限度的高低相对活力，实际体现出的酶活占理论酶活的比例活力回收，终端指标，可以体现固定化工艺的好坏。半衰期，是评估固定化酶稳定性的指标。14， 为什么固定化酶在一般情况下会比游离酶更加稳定？ 固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子的伸展变形（空间自由度受限，刚性增长，空间结构不易变-稳定） 酶活力的缓慢释放 当酶与固态载体结合后，失去了分子间互相作用的机会，从而克制了酶的降解15， 固定化酶的性质发生变化体现在？米氏常数值的变化（见课本）。性质变化体现：酶活力一般都下降，稳定性一般上升，最适pH改变（附：最适温度提高）固定化酶的表观随载体的带电性能变化：（表观Km值指的是测出来的Km值,不一定是实际的.比如包埋后的酶也许性质不变,但Km会由于传质效应而测出来上升,这时由于酶的性质不变,事实上km是不变的.）16， 固定化共价固定的活化基团方法举例?载体上常用的功能基团涉及:芳香氨基,羟基，羧甲基，氨基等可以与载体结合的酶的功能基团涉及：氨基，羧基，巯基，羟基，咪唑基，酚基等17， 酶的固定化方法重要有：共价结合固定法，和非共价结合法。非共价结合法涉及：结晶法；分散法；物理吸附法；离子结合法共价结合法：重要有二种 将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反映；在载体上接上一个双功能基团，然后将酶偶联上去。 活化载体的方法：重氮偶联法;溴化氰法18， 交联法属于共价结合法，但无载体，最常使用的交联剂是：戊二醛。第三章19，化学修饰:凡通过化学基团的引入或除去,而使蛋白质共价结构发生改变,称为蛋白质的化学修饰.选择性化学修饰: 运用化学试剂对肽链特定的基团的专一性修饰, 称为选择性化学修饰。亲和修饰：修饰剂与底物有相类似的结构,对酶活性部位具有高度的专一性,能对活性部位的氨基酸残基进行共价标记,这类专一性化学修饰称为亲和化学修饰。亲和试剂应具有的特性: 在使酶不可逆地失活前,亲和试剂要和酶形成可逆复合物;亲和试剂的修饰限度是有限的;没有反映的竞争性配体的存在应减弱亲和试剂的反映速度;亲和试剂的体积不能太大,否则会产生空间障碍;修饰产物应当稳定,便于表征和定量.20， 如何控制酶修饰反映的专一性？a) 依赖修饰的目的选择合适的化学修饰剂（举一两个例子）一般地要考虑以下问题：i. 修饰反映要完毕的限度；ii. 对个别氨基酸残基是否专一；iii. 在反映条件下，修饰反映有没有限度；iv. 修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变；v. 是否需要分离修饰后的衍生物；vi. 反映是否需要可逆；vii. 是否适合建立快速方便的分析方法。b) 反映条件的选择（举一两个例子）原则：允许修饰反映能顺利进行，同时不导致蛋白质的不可逆变性，有助于专一性地修饰蛋白质。因此对反映的温度、pH值、反映介质、缓冲液等都要根据以上原则进行考虑。21， 大分子化学修饰的优点：稳定性提高，体内半衰期延长，免疫原性和毒性减少或消除，提高膜渗透性，提高疗效，增长在有机溶剂中的溶解度和耐有机溶剂变性的能力。22， 举例分析为什么要进行酶的化学修饰？适当的化学修饰是提高酶稳定性、解除其抗原性、改变酶学性质（最适pH、最适温度、Km值、催化活性和专一性）的一种重要手段。23， 简述酶的重要功能基团的修饰方法,记住每一种功能基团的修饰方法中的典型的一种,特别是有特性性光谱变化的一些基团修饰剂？（重要类型，重要修饰方法和修饰剂）24， 酶修饰的限度和部位的测定？ 分析方法：光谱法（最简朴，最有效）；间接法（最常用）25， 修饰对酶的性质的影响（是一般，不是一定）？提高生物活性；增强稳定性；减少免疫原性；产生新的催化能力。第四章26， 什么叫蛋白质的稳定性?如何理解蛋白质的稳定性这个概念? 影响蛋白质稳定性的重要因素有哪些?如何理解疏水性与蛋白质稳定性的关系?（疏水键内部规则排列越高，稳定性越高）蛋白质的稳定性: 蛋白质抵抗各种因素的影响,保持其生物活力的能力.维持蛋白结构稳定的重要因素: 金属离子、底物、辅因子和其他相对低分子质量配体的结合作用 蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用 盐桥和氢键 二硫键 对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低 氨基酸残基的坚实装配 疏水互相作用疏水性与蛋白质稳定性的关系 疏水性大小与稳定性没有必然的联系 非极性氨基酸在蛋白质球体内的规则的排列是稳定性的因素之一 增长疏水作用是稳定蛋白质的实用方法:减少蛋白质表面的疏水性,增长蛋白质内部的疏水性27， 蛋白质稳定性的指标?热稳定性的衡量标准和稳定性的最有效指标是什么?（半衰期，熔化温度，变性剂浓度）指标涉及熔化温度Tm、蛋白质自由能、最大稳定性温度、在特定条件下蛋白质功能活性维持的时间；其中最有效指标Tm、变性剂浓度28， 蛋白质失活有哪些也许的因素和机理?蛋白质水解酶和自溶作用：体外蛋白水解作用，催化肽键水解，当蛋白质底物也是蛋白水解酶时就会发生自我降解现象，即自溶；聚合作用：蛋白质一方面发生可逆性伸展,伸展的蛋白质分子彼此缔合,以最大限度减少疏水氨基酸暴露于水溶剂,最后也许发生蛋白质分子间二硫键的形成,从而使蛋白质沉淀析出.蛋白质的聚合作用也许是不可逆的,并不一定是不可逆的.极端pH：pH的变化可以引起蛋白质的伸展,这个过程原则上是可逆的,但这些变化常能导致不可逆的聚合或酶的自溶,引起不可逆失活.氧化作用、表面活性和去污剂、变性剂、重金属离子和巯基试剂、热、机械力、冷冻和脱水，辐射作用29， 从固定化和修饰的角度讨论酶的稳定化策略.固定化通过空间障碍，机械方式两个因素来达成酶的稳定化；空间障碍即由于空间障碍可以防止蛋白水解酶的作用，阻挡酶与化学失活剂的接触，同时阻碍氧向酶的扩散可以保护对氧不稳定的酶。机械方式使酶发生交联或包埋在载体紧密的孔中可以使酶的构象更加坚牢，从而阻止酶构象从折叠态向伸展态过渡。修饰使酶构象坚固化，修饰可增长、中和或改变酶分子上的带电残基，可溶性大分子的连接克制与其他溶质（蛋白酶）的互相作用，从而达成酶的稳定化。第五章27，有机溶剂中酶的催化活性和选择性与什么因素有关?(至少指出4种因素)系统的含水量、有机溶剂性质、酶的状态（固定化、游离、化学修饰、干粉等）、环境pH值等密切相关酶在非水介质中酶结构及功能的关系如何变化?答：酶的结构的改变使酶功能发生相应的改变。酶分子结构动态变化：酶分子在水溶液中以其紧密的空间结构和一定的柔性发挥催化功能；在含微量水（1%）的有机溶剂中,与蛋白质分子形成分子间氢键的水很少,蛋白质分子内氢键起主导作用,导致蛋白质变得“刚硬”，活动的自由度变小，限制了疏水环境下蛋白质构象向热力学稳定状态的变化。导致：酶的活力发生改变：一般可以较好的保持，但部分酶会失活 由于有机溶剂中缺少使酶失活的水分子,由水引起的酶分子中天冬酰胺脱氨基作用,天冬氨酸肽键水解,二硫键破坏,半胱氨酸氧化及脯氨酸和甘氨酸的异构化等蛋白质热失活过程全都难以进行导致：有机溶剂中酶的热稳定性和储存性都比水溶液中高。 酶在有机溶剂中对底物的化学结构和立体结构均有严格的选择性;酶与底物的结合受溶剂的影响,底物专一性在有机溶剂中将发生改变；在水中酶和底物重要靠疏水作用,而在非水介质中疏水作用已不重要.重要决定于自由能的变化导致：对生产有利的改变，如底物特异性提高28，酶在有机介质中具有更高稳定性的因素?答：由于有机溶剂中缺少使酶失活的水分子,由水引起的酶分子中天冬酰胺脱氨基作用,天冬氨酸肽键水解,二硫键破坏,半胱氨酸氧化及脯氨酸和甘氨酸的异构化等蛋白质热失活过程全都难以进行29，酶在有机溶剂中表现催化作用与水的关系?答： 与酶结合的水量是影响酶活力稳定性以及专一性的决定因素,成功应用非水介质中的酶催化反映,控制酶结合水和水在酶分子中的位置是关键.水对于酶催化活性构象的获得是必须的,但水也与许多酶的失活过程有关.在非水酶体系中,含水量的微小差别会导致酶催化活性的较大改变.具体细化：（当酶周边的水化层受到破坏时,酶基本上是没有活力的,随着水化限度的增长,酶活力将得到恢复.酶需要水维持其活性三维结构,水影响蛋白质结构的完整性,活性位点的极性和稳定性;酶周边水的存在,能减少酶分子的极性氨基酸的互相作用,防止产生不对的的构象.含水量太高时,酶结构的柔性过大,酶的构象将向疏水环境热力学稳定状态变化,引起酶结构的改变和失活.）30，非水介质中酶的催化作用与溶剂的关系? 答：有机溶剂对酶的动态的影响 有机溶剂通过改变蛋白分子的动态移动性及构象来影响酶的活力。 溶剂对酶的结构的影响 在有机溶剂中，酶的整体性和活性中心的结构都保持完整，但酶分子自身的动态结构姐表面发生不可忽视的变化。 溶剂对酶活性中心的影响 溶剂会减少整个活性中心的数量。 酶活性和溶剂的属性存在定量关系 溶剂的几何形状也影响非水介质中酶的活性 31，酶在非水介质中重要酶学性质的变化 答：酶的催化活性和稳定性 酶分子结构动态变化，即蛋白质的刚性变强，活动自由度变小导致酶活力的变化。而在非水介质中有水引起的酶分子中天冬氨酰脱氨作用等蛋白质热时候的过程难以进行，以及蛋白酶在非水介质的缺少致使其稳定性增强。 酶催化的选择性 底物特异性，对映体的选择性，位置选择性，化学键选择性等发生改变 微水有机溶剂中酶催化的动力学 非水介质中酶催化的动力学中催化机制，米氏常数等不同于水相中酶动力学 非水相酶催化的其他性质 酶在有机溶剂中存在“分子记忆”效应32，最适水量,pH记忆与pH忘掉最适水量:是保证酶的极性部位水合,表现活力必须的,也叫必需水.有机溶剂中的酶可以记忆它冷冻干燥或丙酮沉淀前所在缓冲液中的pH,这种现象被称为酶的pH记忆.微水有机溶剂中疏水性的酸或碱与它们的盐组成的混合物,可以作为有机相缓冲液,这两种形式的比例控制着有机相中酶的解离状态,使酶完全忘掉干燥前它所处的水溶液的pH值,这种现象叫pH忘掉第六章概念：人工酶：又称模拟酶模型，它是吸取酶中那些起主导作用的因素，运用有机化学、生物化学等方法设计和合成一些较天然酶简朴的非蛋白质分子或蛋白质分子，以这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过程酶的人工模拟分子印迹分子印迹(molecular imprinting):制备对某一化合物具有选择性的 聚合物的过程.这个分子叫印迹分子(print molecule, P),也叫模板分子(template, T).分子印迹酶运用分子印迹技术制备能与底物特异性结合并具有一定的催化能力的聚合物叫分子印迹酶,是模拟酶的一种第七章：39，抗体酶：本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白40，理解抗体和抗体酶以及抗体酶和一般蛋白酶的不同？（例如前者底物结合方式，后者基态和过渡态的区别）酶和抗体的本质区别就在于：酶是能与底物的反映过渡态选择结合的催化性物质，而抗体是和底物的基态分子紧密结合的物质。 抗体酶与蛋白酶的异同：同：同是蛋白质，选择性结合底物，催化效率高，专一性，可以进行化学修饰等。异：抗体酶可催化多种化学反映，其中有的反映过去主线不存在一种生物催化剂能催化它们进行，甚至可以使热力学上无法进行的反映得以进行。 第八章：41，核酶：具有生物催化活性的核酸脱氧核酶：具有催化活性的脱氧核酸分子。42，为什么自然界中重要的是核酶，不是脱氧核酶？脱氧核酶没有2-羟基,43，核酶相对于蛋白酶的优缺陷？缺陷：缺少化学多样性；缺少更多的催化基团；因而催化活力低，催化种类单一；优点：没有免疫反映；定位准确；容易通过度子技术人工设计和合成。第九章44，概念：进化酶 分子定向进化：在实验室试管中模拟达尔文的自然进化原理，对蛋白质(酶)的基因运用随机突变和随机杂交的方法加以改造，通过大规模筛选，从而得到性能上改良的优异变种。使蛋白质(酶)在自然界需要几百万年才干完毕的进化过程缩短至几个月，为蛋白质(酶)的工程应用提供了一个强有力的技术手段。 45，理解试管中进行进化酶的策略基本技术手段:易错PCR,连续易错PCR，DNA改组技术,高突变菌株等技术.46，DNA分子进化的载体？（例如PCR中常见的载体）及其优缺陷？构建突变文库的载体系统:优缺陷噬菌体载体系统:优点为可以装载容量大的,适合于大片段的克隆.较好的质量控制;缺陷:可采用的文库筛选方法有限,经常在载体系统中无法表达.质粒载体系统:操作方便,可塑性强,可以实现对基因文库的功能筛选. 缺陷:插入片段的容量较小.哺乳动物细胞表达系统:是一个新动向,已显示了良好的前景.第十章47，杂合酶（概念）：由二种以上酶成分构成,将来自不同酶的结构单元(功能基、二级结构、三级结构、或功能域)或是整个酶分子进行组合或互换，可以产生具有所需要性质的优化酶杂合体，这种酶就是杂合酶。48，理解杂合酶的制备的重要方式（概述）？多数杂合酶是通过蛋白质工程法构建的,也可用DNA改组技术这种随机方法来