液相色谱法1-农药残留测定方法.pptx

第五章第五章 农药残留农药残留测定方法测定方法学习指南学习指南观察思考观察思考课外阅读课外阅读复习自测复习自测退出本章退出本章演示文稿演示文稿本章目录本章目录辽农职院辽农职院 工程系工程系 质检中心质检中心20242024年年8 8月月2525日日淋洗液色谱柱检测器数据处理第二节第二节 液相色谱仪液相色谱仪本节首页本节首页退出本章退出本章一、GC与HPLC的比较本节首页本节首页退出本章退出本章二、流动相的基本要求二、流动相的基本要求n保持色谱柱的稳定性，因而与固定相不互溶（延长柱寿命）n不发生不可逆吸附 n有合适的pH值n化学惰性不与样品及固定相发生反应。本节首页本节首页退出本章退出本章nUV：在紫外线区“透明”n示差：折射率与溶剂有较大差异 n电化学检测器：电惰性。n对样品有很强的溶解力。n清洗与更换方便n低价、毒性小、纯度高。1、适用于所选的检测器本节首页本节首页退出本章退出本章2.2.流动相的选择流动相的选择n有合适的理化性质（沸点、粘度等，尽（沸点、粘度等，尽可能小一些）可能小一些）n合适的强度（分配系数要合适，简单样（分配系数要合适，简单样品可大，复杂样品要小）品可大，复杂样品要小）n混合溶剂（有等度和梯度之分）（有等度和梯度之分）n极性合适（需根据溶剂的性质而定）（需根据溶剂的性质而定）本节首页本节首页退出本章退出本章3 3、流动相的物理参数流动相的物理参数n溶解度参数（溶剂极性的量度）：与样品分配比有关，要适中。n沸点：要低些，便于回收分离样品。n粘度：柱效与粘度成反比，要求早在0.40.5cP。n混合溶剂一般能降低粘度。本节首页本节首页退出本章退出本章4 4、混合溶剂混合溶剂n可靠改变溶剂组成来调节溶剂的强度等，以适合不容的样品。n等度淋洗：淋洗过程中溶剂组成不变，强度恒定，k值在10以内可得较好的分离。n梯度淋洗：淋洗过程中溶剂组成随时间而变，一般使强度按程序增加，使组分在最合适的k值处洗出。本节首页本节首页退出本章退出本章5 5、梯度淋洗、梯度淋洗n使用于极性范围宽的混合物的分离。n优点：n提供限单位时间内的最大分离度。n提高出峰的对称性n减小峰宽n降低检测本节首页本节首页退出本章退出本章n问题：n要用高纯试剂（贵贵）。n可能在固定相上产生杂质富集，需再生处理（尤其是极性柱），可用10 30倍柱体积的溶剂淋洗。5 5、梯度淋洗、梯度淋洗本节首页本节首页退出本章退出本章三、液相色谱柱的保养三、液相色谱柱的保养柱的稳定性与固定相类型及使用情况有关。为了保持柱效、柱容量及渗透性，必须进行仔细地保养。是否会由于柱外效应，使分析柱的柱效明显下降？本节首页本节首页退出本章退出本章（一）、防止（一）、防止堵塞1、必须将流动相仔细地蒸馏、过滤。在流动相贮槽与柱之间，使用0.5m孔径的过滤器。水往往是一个重要的污染源。在水溶液流动相（如缓冲液）中，细菌容易生长，可能堵塞筛板。防止细菌生长的办法是加入抑制剂，如0.01%NaNO3。显然，抑制剂不能干扰分离和测定。本节首页本节首页退出本章退出本章（一）、防止（一）、防止堵塞2、在恒定压力下，发现流量减少，柱子可能部分堵塞。堵塞最容易发生在极窄的入口接头处以及入口、出口筛板处。堵塞后需要仔细拆洗，清除堵塞物，但必须防止较强的机械震动，防止用热手接触柱子，以扰动柱内的固定相层，使柱效发生变化。本节首页本节首页退出本章退出本章n5要防止反冲（流动相逆向流动），否则使固定相层位移，柱效下降。n6柱子两端用金属螺帽封闭，保存在纯净的有机溶剂中。应该将柱子保存在以下pH范围内的水溶液流动相中：2pH8.5。为了长期保存，最好用纯有机溶剂（如甲醇）清洗柱子。n7一定要防止柱子干涸，特别是硬胶柱。（一）、防止（一）、防止堵塞本节首页本节首页退出本章退出本章二、液相色谱柱的保养二、液相色谱柱的保养n8使用卫柱(Guard Column,亦称预柱)。连续注射含有强滞留(不被洗脱)组分的样品，将使柱效下降，保留值改变，选择性变坏，柱寿命缩短。为了延长柱寿命，在进样阀和分析柱之间加上卫柱。本节首页本节首页退出本章退出本章二、液相色谱柱的保养二、液相色谱柱的保养n卫柱较短(510cm)，固定相与分析柱类似。其作用是吸着强滞留的组分，防止对分析柱的污染，保持分析柱性能稳定。实验表明，只要卫柱与高效、小粒度分析柱联用，除了使k为零的组分的塔板数大大减少外，对k值较大的组分，其柱效下降很少。本节首页本节首页退出本章退出本章三、检测器本节首页本节首页退出本章退出本章三、检测器紫 外 检 测 器UV-DETECTOR本节首页本节首页退出本章退出本章 二 极 管 阵 列 检 测 器DIODE ARRAY DETECTOR本节首页本节首页退出本章退出本章四、液相色谱仪的使用1、流动相（2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。本节首页本节首页退出本章退出本章（3）高纯度。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。（5）低粘度。常用的有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。本节首页本节首页退出本章退出本章必须做!溶剂前处理n过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。本节首页本节首页退出本章退出本章n目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 n气泡对测定的影响：1）柱流量不准；2）检测器基线波动n脱气注意点：1）每天脱气；2）混合溶剂脱气时间不能过长必须做!溶剂前处理本节首页本节首页退出本章退出本章2、高压输液泵1.每次使用后要把泵中的缓冲液洗干净，防止盐的沉积，泵要浸在无缓冲液的溶液或有机溶剂中。2.使用HPLC级的流动相试剂。3.使用不锈钢烧结吸液滤头。本节首页本节首页退出本章退出本章2、高压进样阀必须做!每次使用后要冲洗干净进样阀中残留的样品和缓冲盐。防止无机盐沉积和样品微粒磨损阀转子。严禁用!严禁使用气相色谱那样的尖头针进样。本节首页本节首页退出本章退出本章3、紫外检测器每次做1、流过池每次使用后连同色谱柱一起清洗2、使用脱过气的流动相,防止气泡卡在流过池内。经常做不定期的使用空流过池校正波长。本节首页本节首页退出本章退出本章4、操作极限预防1.严禁在无流动相时启动高压输液泵.2.设定泵的上限压力(25Mpa)防止长期压力过高损坏泵和进样阀.3.设定泵的下限压力(0.51Mpa)防止流动相抽干和严重泄漏.5、预柱与保护柱从泵来的流动相预柱进样器保护柱分析柱到检测器本节首页本节首页退出本章退出本章使用保护柱带整体过滤片的保护柱本节首页本节首页退出本章退出本章步骤1：使用含盐缓冲液后（如离子对试剂）应用溶解性强的溶剂（如水）进行冲洗步骤2：先断开检测器，然后用对来自样品中的物质有强溶解性的溶剂进行冲洗。对于反相色谱柱，可使用甲醇，乙睛四氢呋喃，氯仿，庚烷等，在此条件下，应避免溶剂的pH 低于2 或高于8若经过步骤1 和步骤2 后，压力仍没下降至步骤36、柱堵塞的修复本节首页本节首页退出本章退出本章步骤3：断开检测器，将色谱柱反方向放置，然后检查柱压（1）若压力稳定下降，至步骤4（2）若压力不下降，至步骤5步骤4：保持色谱柱反方向连接，用低于0.5 ml/min 流速冲洗1 小时若步骤4 不能降压，至步骤56、柱堵塞的修复本节首页本节首页退出本章退出本章步骤5：若内置过滤器被堵塞，应冲洗或更换。柱连接端的拆卸或重装会导致柱效下降（有效塔板数下降和不对称峰）若步骤5 不能降低柱压，至步骤6步骤6：若进口端的填料发生堵塞，柱子将不可能被彻底恢复，只能通过去掉进口端的部分填料，重新填充进行有限的柱效恢复。（25mm）6、柱堵塞的修复 五、FL2200型液相色谱仪1、高压输液泵2、高压进样阀3、液相色谱柱4、紫外检测器5、溶剂箱1、高压输液泵输液系统2、高压输液泵样品完全溶解在流动相中样品没有完全溶解过滤样品，不含固体颗粒用流动相或比流动相弱的溶剂溶解样品进样量尽量小六、常见峰问题六、常见峰问题 1、样品制备、样品制备2 2、峰形问题（双峰）、峰形问题（双峰）柱头塌陷或柱床运动。泵头过滤芯(Frit)部分堵塞。组份共流出正 常双 峰柱头塌陷问题：一个有紫外吸收的流动相与一个没有紫外吸收的流动相动态混合产生噪音，增加静态混合器可以降低这种噪音。缺点:增加了延迟体积静态混合器3、噪、噪 音音检测池脏检测池灯能量下降由泵引起的脉冲检测器上的温度效应检测池中有气泡通过Time(min.)4、基线噪音、基线噪音5 5、基线漂移、基线漂移梯度洗脱引起的温度不稳定（RID）流动相脏柱子没有用流动相平衡系统中污染物溢出6 6、鬼、鬼 峰峰20%20%100%MeOH100%MeOH梯度洗脱，没有进样梯度洗脱，没有进样鬼峰：没有进样就有色谱峰出现。原因流动相脏7 7、柱外扩展、柱外扩展用较短的、窄内径的毛细管连接进样器和色谱柱以及柱子和检测器。确认连接管的接头都相互匹配。使用死体积小的流动池减小进样量增加柱外死体积8 8、峰扩展、峰扩展所有峰都扩展柱效降低或有柱塌陷进样体积过大流动相粘度大部分峰扩展前一次分析样品的流出物高分子量样品蛋白质或聚合物拖尾因子拖尾因子ABExcellentt=1.0-1.05Acceptablet=1.2Unacceptablet=2Awfult=49 9、拖、拖 尾尾柱头有污染物堆积重金属反应所有峰均拖尾柱子失效小峰在大峰后洗脱出来部分峰拖尾二次保留效应残留硅醇的相互作用拖尾因子拖尾因子 1.21.2正常前伸1010、前伸峰、前伸峰柱子过载小峰在大峰之前洗脱出来拖尾因子拖尾因子 0.90.91111、负、负 峰峰溶解样品的溶剂通过柱子时平衡被破坏样品吸收比流动相吸收小。RID中最常见正常负峰本节首页本节首页退出本章退出本章七、压力问题七、压力问题 压力问题压力问题压力过高压力过高压力过低压力过低压力波动压力波动1 1、压力过高、压力过高 柱子进口过滤芯被污染柱子进口过滤芯被污染 PURGE PURGE阀过滤芯被污染阀过滤芯被污染 色谱柱被污染色谱柱被污染 连接管路，尤其是针座毛连接管路，尤其是针座毛细管堵塞细管堵塞 进样器旋转密封阀被堵塞进样器旋转密封阀被堵塞 进样针或针座被阻塞进样针或针座被阻塞 压力测量压力测量使用此阀使用此阀分割系统分割系统l溶剂进口过滤芯堵塞l连接管路泄漏或其它备件（泵密封垫）l溶剂或流速改变l 主动阀失灵l四元比例阀失灵l 单向出口阀失灵l色谱柱失效 (固定相)2 2、压力过低、压力过低 压力测量压力测量溶剂进口溶剂进口过滤芯过滤芯溶剂进口溶剂进口过滤芯过滤芯3 3、压力波动、压力波动 溶剂进口过滤芯堵塞 溶剂未脱气 泵的密封垫老化 出口单向阀失效 主动阀失效*通常是：通常是：泵内有气泡泵内有气泡本节首页本节首页退出本章退出本章八、各种峰形的处理（八、各种峰形的处理（1 1）本节首页本节首页退出本章退出本章八、各种峰形的处理（八、各种峰形的处理（2 2）本节首页本节首页退出本章退出本章八、各种峰形的处理（八、各种峰形的处理（3 3）重叠峰在测量上有困难，可用计算机方法进行拟合色谱峰的测量色谱峰的测量 复习思考题复习思考题1 1、GCGC与与HPLCHPLC的比较的比较2 2、流动相的选择、流动相的选择3 3、液相色谱柱的保养、液相色谱柱的保养4 4、常见峰问题、常见峰问题本节首页本节首页退出本章退出本章