液相色谱2分配离子交换凝胶.pptx

第二节第二节 分配色谱分配色谱一、基本原理一、基本原理1、吸附色、吸附色谱的局限性的局限性（1）吸附色谱不适合于分离强极性的亲水性物质（成分）；（2）吸附剂的含水量对吸附剂的吸附能力影响较大，常使结果重现性较差；（3）易出现拖尾峰。2 2、分配色、分配色、分配色、分配色谱谱原理原理原理原理（1）固定相为液体将某种溶剂涂布在吸附剂颗粒表面或纸纤维上，形成一层液膜，称为固定相。吸附剂颗粒表面或纸纤维叫载体或担体。根据组分在两相中的溶解度不同而分离。（2）“相似相溶”原则极性物质在极性溶剂中溶解度大，K大；非极性物质在非极性溶剂中溶解度大，K大。（3）分配定律与分配等温线（4）分配色谱的特点：a、重现性 b、峰对称c、无强烈滞留现象.几乎适用于各种几乎适用于各种类型的化合物，特型的化合物，特别适宜于适宜于亲水性物水性物质，如极性，如极性较大的生物碱、苷大的生物碱、苷类、有机酸、糖、有机酸、糖类及氨基酸的衍生物等。及氨基酸的衍生物等。二、载体只起只起负载固定相的作用。固定相的作用。要求：惰性、无吸附能力、要求：惰性、无吸附能力、纯净、颗粒粒均匀。均匀。种种类 1）硅胶：重）硅胶：重现性差性差 2）硅藻土：）硅藻土：应用最多用最多 3）纤维素：素：纸色色谱三、固定相和流动相的选择正相分配色正相分配色谱：固定相的极性固定相的极性大于大于流流动相的极相的极性；性；固定相：水、缓冲溶液、稀硫酸、甲醇、丙二醇等；按一定的比例与载体混匀后填装于色谱柱。流动相：石油醚等洗脱顺序:极性大的组分保留作用强；极性小的组分保留作用弱 反相分配色反相分配色谱：固定相的极性：固定相的极性小于小于流流动相相的极性。的极性。固定液：硅油、液体石蜡等极性较小的有机溶剂。流动相：水、各种水溶液（酸、碱、盐及缓冲液）、与水混合的有机溶剂。洗脱顺序:极性小的组分保留作用强；极性大的组分保留作用弱四、分配色谱操作注意事项四、分配色谱操作注意事项1 1、两相溶、两相溶、两相溶、两相溶剂剂的的的的处处理理理理2 2、上、上、上、上样样量与量与量与量与样样品前品前品前品前处处理。理。理。理。3 3、柱色、柱色、柱色、柱色谱谱4 4、纸纸色色色色谱谱第三节第三节 离子交换色谱法离子交换色谱法(ion exchange chromatography)一、基本原理一、基本原理1、离子交换剂与离子交换过程（1 1）离子交）离子交换剂换剂为一种固体状可在水溶液中浸润和溶胀的多孔颗粒，其表面有许多可电离的基团，在水中电离时，有一种离子可在水中自由移动，而另一种则在固定相上不能自由移动。可自由移动的离子可以被其它同类离子置换，即离子交换。（2 2）离子交）离子交换过换过程程水溶液中（流动相中）的各种离子，可与离子交换树脂上固定的离子基团结合，使原来与其结合的离子被置换，进入流动相而发生置换。带负电的交换基团（固定的离子基团，如磺酸基、羧酸基）：用于阳离子分离；带正电的交换基团（固定的离子基团，如季胺盐）：用于阴离子分离。2、分离机理（1）不同的离子与交换树脂的结合力不同，从而固定相对它的保留能力不同，从而造成差速迁移。（2）离子交换平衡：K K K K 大，大，大，大，Na+Na+Na+Na+易与固定相结合，移动慢；易与固定相结合，移动慢；易与固定相结合，移动慢；易与固定相结合，移动慢；反之，移动快。反之，移动快。反之，移动快。反之，移动快。t tR R=t=tmm(1+K)(1+K)V VR R=V=Vmm(1+K)=V(1+K)=Vmm+KV+KVS SK K K K 为分配系数为分配系数为分配系数为分配系数平衡时平衡时平衡时平衡时 K 为选择性系数为选择性系数 （交换平衡常数）（交换平衡常数）二、离子交换树脂二、离子交换树脂1 1、离子交、离子交、离子交、离子交换树换树脂的构成脂的构成脂的构成脂的构成由苯乙稀和二乙烯基苯聚合而成的网状结构，不溶于水和有机溶剂，性质稳定。苯乙烯组成长链；苯乙烯组成长链；苯乙烯组成长链；苯乙烯组成长链；二乙烯基苯为交联剂二乙烯基苯为交联剂二乙烯基苯为交联剂二乙烯基苯为交联剂 2、离子交、离子交换树脂的脂的类型型（1）阳离子交换树脂 可交换的离子为阳离子。氢型、钠型 强酸型、弱酸型、中强酸型（COOH、PO3H、SH）例如：磺酸型 R-SO3H+(pH范围宽)*应注意pH范围，否则交换容量急剧下降。（2）阴离子交换树脂 可交换的离子为阴离子。按不同碱性分：强碱型（季胺基团）NR3+(pH11)NH2,NHR,NR2等(pH B3+C2+D+大分子量的有机离子,有较高的亲和力 四、流动相四、流动相1 1、组组成：一般成：一般成：一般成：一般为盐类为盐类的的的的缓缓冲水溶液（有一定冲水溶液（有一定冲水溶液（有一定冲水溶液（有一定的的的的pHpH值值）。）。）。）。2 2、对对分离的影响分离的影响分离的影响分离的影响2、对分离的影响、对分离的影响流动相主要影响组分离子和交换基团形成离子对的过程 pH对弱酸、弱碱的影响影响其离解平衡，即控制了组分形成离子的程度：离子组分，则K；离子组分，则K 不同离子交换剂的pH适用范围：强酸型：较宽;强碱型：pH6;弱碱型：pH20002000）一、基本原理一、基本原理一、基本原理一、基本原理1、分离机理（1）前三种是亲和力不同而分离；（2）凝胶色谱中组分与固定相之间无作用力，只是根据分子量大小来分离；（3）凝胶 有一定的孔径分布范围的多孔物质。组分进入柱内后，全向固定相的孔中扩散，保留程度取决于孔和组分分子的大小。小分子:将全部渗入细孔中,在流经柱时,经历的路程最长.中等大小分子:渗入部分较大的孔隙,而被较小的孔隙排斥,经历的路程居中.大分子:完全被排斥在空隙外,经历的路程最短.所以洗脱次序仅是分子大小(分子量)的函数。分子大小受分子量,分子几何形状（环球形、螺旋形或棒形）组分分子间的缔合程度、组分与流动相分子间的缔合程度有关。Size Exclusion Chromatography2 2、分配系数和保留、分配系数和保留、分配系数和保留、分配系数和保留值值(1)分配系数K组分进入柱子，从高浓度的流动相中向固定相孔隙内扩散，扩散平衡时a、小分子平衡时，一半组分在孔隙内，一半组分在孔隙外。CS=Cm K=1 b、大分子（直径大于固定相孔径时），被全部排斥在固定相孔隙之外 CS=0 K=0c、中等大小分子，直径介于以上两种极限之间，0K1所以在凝胶色谱中 0K1（2）保留值保留方程 VR=Vm+KVS在凝胶色谱中 Vm：外水体积（V0）VS：内水体积（Vi）当 K=1 时，VR Vm VSV0Vi K=0 时，VR Vm V0所以，所有组分均在（Vi+V0）体积内流出。二、凝胶二、凝胶类型型 （自学）（自学）1、葡聚糖凝胶2、聚丙烯酰胺凝胶3、琼脂糖凝胶4、多孔玻璃凝胶 14 用于亲水性样品的分离5、聚苯乙烯凝胶（非水溶液样品亲脂性）三、实验条件的选择三、实验条件的选择分子量较正曲线将分子量不同的组分混合物注入柱子，经分离后，分别测得它们的保留体积，以分子量对保留体积作图，得一曲线，称分子量校正曲线。图中，A、B两点反映了该固定相能够分离的组分分子量的上限(排斥极限)、下限(全渗透极限)，只有分子量在A、B对应量之间的组分才能被分离。1 1、凝胶的选择（主要通过选择凝胶来改善分离）、凝胶的选择（主要通过选择凝胶来改善分离）、凝胶的选择（主要通过选择凝胶来改善分离）、凝胶的选择（主要通过选择凝胶来改善分离）2 2、凝胶的溶、凝胶的溶、凝胶的溶、凝胶的溶胀胀干凝胶+10倍吸水量的洗脱剂中，缓慢搅拌；注意：时间足够长，不易过稀。3 3、装柱：不、装柱：不、装柱：不、装柱：不应应有气泡。有气泡。有气泡。有气泡。柱长100cm4 4、样样品的制品的制品的制品的制备备组别分离（粗分）：上样量可以是柱体积的2530%。K值相近的物质（细分）：上样量可以是柱体积的25。5 5、洗脱：洗脱、洗脱：洗脱、洗脱：洗脱、洗脱：洗脱剂应剂应与溶与溶与溶与溶胀胀凝胶的溶凝胶的溶凝胶的溶凝胶的溶剂剂相同。相同。相同。相同。洗脱剂：水、不同离子强度的溶液、不同pH的缓冲液、水有机溶剂混合液。6 6、应应用：用：用：用：测测定大分子物定大分子物定大分子物定大分子物质质的分子量（如的分子量（如的分子量（如的分子量（如PrPr）