淋巴细胞的分离及功能检测.pptx

一、淋巴细胞的分离一、淋巴细胞的分离借助其表面标志及功能差异分为不同的群及亚群借助其表面标志及功能差异分为不同的群及亚群尼龙棉分离法尼龙棉分离法E-花环分离法花环分离法洗淘法洗淘法流式细胞术（流式细胞术（FCM）免疫磁球分离技术免疫磁球分离技术二、二、淋巴细胞的表面标志淋巴细胞的表面标志 CD抗原抗原 特特 异异 性性 CD2 E受体、全部T细胞和部分NK细胞 CD3 成熟T细胞 CD4 Th细胞、M、HIV受体 CD8 Tc细胞、NK细胞的亚型 CD25 IL-2受体、活化T细胞 CD16、CD56 NK细胞三、三、T细胞表面标志的检测方法1.免疫荧光技术免疫荧光技术 直接法：细胞直接法：细胞+标记的标记的McAb 间接法：细胞间接法：细胞+McAb+荧光素标记的抗小鼠荧光素标记的抗小鼠IgG抗血清抗血清 流式细胞术（流式细胞术（FCM）：）：2.免疫细胞化学法免疫细胞化学法 APAAP酶免疫桥联法酶免疫桥联法3.微量细胞毒实验微量细胞毒实验 细胞细胞+McAb+补体补体APAAP酶免疫桥联法酶免疫桥联法E-花环花环(erythrocyte rosette)实验实验外周血单个核细胞的分离E-花环实验外周血单个核细胞的分离原理外周血单个核细胞的分离原理 常用的方法是Ficoll-Hypaque（又称淋巴细胞分层液）密度梯度离心法。Ficoll-Hypaque 比重：1.0770.001 RBC和中性粒的比重：约1.09 PBMC的比重：约1.075Isolation of peripheral blood lymphocytes by Ficoll-Hypaque gradient实验试剂和材料实验试剂和材料淋巴细胞分层液淋巴细胞分层液SRBC悬液悬液肝素溶液肝素溶液Hanks或或RPMI-1640培养液培养液试管试管毛细细管毛细细管玻片玻片显微镜显微镜人人T T细胞表面有绵羊红细胞受体，即细胞表面有绵羊红细胞受体，即E E受体受体 ，又命名为又命名为CD2CD2；绵羊红细胞（；绵羊红细胞（SRBCSRBC）表面有）表面有CD2CD2的配的配体，即体，即LFA-3LFA-3，将淋巴细胞与，将淋巴细胞与SRBCSRBC按一定比例混合按一定比例混合后，在一定条件下就形成一个后，在一定条件下就形成一个T T细胞结合多个细胞结合多个SRBCSRBC的玫瑰花一样的花环，即的玫瑰花一样的花环，即E-E-花环，取样涂片染色、花环，取样涂片染色、镜检计数可得花环形成率。镜检计数可得花环形成率。如置如置44至少至少2h2h或过夜，所检出的或过夜，所检出的E-E-花环称为花环称为总花环（总花环（EtEt），亦即），亦即T T细胞的百分率；如减少淋巴细胞的百分率；如减少淋巴细胞与细胞与SRBCSRBC的比例，经短时间的温育即行取样涂片的比例，经短时间的温育即行取样涂片镜检，仍可见部分镜检，仍可见部分E-E-花环，称为活性花环（花环，称为活性花环（EaEa）。）。E-花环实验原理花环实验原理显微镜下的显微镜下的E花环花环 实验目的和意义目的 *掌握PBMC的分离方法 *掌握用E-花环实验计数或分离外周血T淋巴细胞。意义 *用于评价机体细胞免疫功能。*用于分离外周血T淋巴细胞分离分离PBMCPBMC 吸取吸取PBMCPBMC加入至加入至5 5ml ml hankshanks液液，离心，离心，10001000rpmrpm,10 ,10 minmin 去上清，加入去上清，加入0.1ml0.1ml（约（约1 1滴）滴）SRBCSRBC 置于置于3737C C水浴水浴1010minmin 低数离心，低数离心，500500rpm,5minrpm,5min 吸去部分上清（约吸去部分上清（约0.1ml0.1ml），加），加1 1滴戊二醛固定滴戊二醛固定1010minmin 再加入再加入1 1滴美兰染色滴美兰染色1 1minmin 取取1 1滴滴片，盖上盖玻片，高倍镜下计数花环形成滴滴片，盖上盖玻片，高倍镜下计数花环形成率率E-花花环环实实验验操操作作骤骤结果判断结果判断阳性细胞：阳性细胞：受检细胞周围粘附有受检细胞周围粘附有3个或更多红细胞个或更多红细胞的判为花环形成细胞。的判为花环形成细胞。正常参考值 总总E-花环形成率（花环形成率（Et）为）为60%80%活性活性-E花环形成率花环形成率(Ea)仅为仅为Et 的的1/31/2，约，约2040