猪乙型脑炎及其防制.pptx

猪乙型脑炎及其防制研究进展v乙型脑炎及其危害v乙型脑炎病毒的病原学特性v乙型脑炎的流行病学特性v乙型脑炎的防制v乙型脑炎疫苗研制进展v乙型脑炎诊断方法研究进展v乙型脑炎病毒分子生物学研究进展v展 望 Iv乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)，简称乙脑，是一种由蚊虫传播引起的人与动物共患的急性病毒性传染病。1871年，日本。v夏秋季节流行，曾称为“夏季脑炎”。冬季曾发生过的昏睡脑炎(嗜眠性脑炎)，日本学者(1928年)。冬季 甲型脑炎，夏秋 乙型脑炎。I 乙型脑炎乙型脑炎 乙脑对人类危害巨大，是人类中枢神经系统(CNS)最常见的虫媒病之一，是包括印度次大陆在内的整个亚洲引起人类死亡和残疾的一个主要原因。I 乙型脑炎的危害（人）乙型脑炎的危害（人）时时 间间 国国 别别 病病 例例 病死率病死率1924年 日本 6000 60%1958年 越南 68971965年 日本 3000-50001999年 马来西亚 I我国是乙脑发病人数最多的国家，占世界总发病数的80%以上。乙型脑炎的危害（人）乙型脑炎的危害（人）乙脑暴发流行的部分大事记乙脑暴发流行的部分大事记v该病主要危害儿童，特别是学龄儿童，在新加坡曾有12岁儿童感染率高达70%的报道。40-45岁的成人也易感。怀孕妇女感染后导致流产。v全球每年感染乙脑人数超过1千万，大多数呈隐性感染(亚临床感染)，其发病率一般为1:25-1:1000，平均为1:200。v 病死率高，平均为20%，国外有的地方高达50%-60%，全球每年病死人数超过1万人。v后遗症严重，约57%-68%的治愈者患有不同程度的神经学后遗症。I乙型脑炎的危害（人）乙型脑炎的危害（人）v 多种动物如猪、马、牛、山羊、绵羊、猴和家禽很易感染乙脑，其它如兔、大鼠、鸽、犬、鸭、野禽和爬行类也易感，小鼠和某些蜥蜴能被实验感染。其临床症状随患病动物的种类不同而异，牛、羊、家禽多为隐性感染，马可发生严重的脑炎。I乙型脑炎的危害（动物）乙型脑炎的危害（动物）v猪主要表现为：潜伏期3d-4d，仔猪脑炎，高热稽留，精神沉郁，步行踉跄，最后身躯麻痹而死；育肥猪持续高热；妊娠母猪主要表现为流产，产出大小不等的死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔；公猪单侧或两侧性睾丸肿大，局部发热，有痛感，数天后，睾丸肿胀消退，逐渐萎缩变硬。v此病引起的主要经济损失是怀孕母猪发生繁殖障碍，对作为畜牧业支柱产业养猪业的持续增产造成巨大的危害。I乙型脑炎的危害（猪）乙型脑炎的危害（猪）v乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)的分离和鉴定最早报道于1935年（日本）。v黄病毒科(Flaviviridae)。v 3个血清型：JaGAr,Nakayama和Mie(intermediate type)，它们具有不同的生物学特性，包括生长特性和毒力。vJEV毒粒呈球形，20面体对称，有囊膜，毒粒直径为45-50nm(核心30nm)，沉降系数200S，其分子量约为3000KD，是黄病毒科66个成员中最小的病毒之一。vJEV在环境中不稳定，易被灭活。I乙型脑炎的分类及理化性质乙型脑炎的分类及理化性质vJEV囊膜外表有穗状突起，提纯的穗状突起具有血凝活性，其成分为糖蛋白。其血凝素有轻重两种，血凝性与毒力相关，血凝性是JEV强毒株的共性，减毒毒株的血凝性相当低，甚至完全丧失。vJEV的血凝谱比较广，在一定条件下能凝集鹅、鸽、雏鸡、绵羊等动物的红细胞，但其血凝素易于破坏而且血凝反应要求比较严格的pH域。不同毒株血凝反应的最适pH不完全相同。I血凝特性血凝特性 JEV的抗原性较强，自然或人工感染的动物一般都能产生较高效价的中和抗体、血凝抑制抗体和补体结合抗体。I抗原性抗原性 vJEV可在多种原代和传代细胞上增殖。鸡胚成纤维细胞、鼠胚肌和肾细胞、牛胚肾细胞、人胚肺和肾细胞、人羊膜细胞、猪肾原代细胞、狗肾原代细胞(PDK)、白纹伊蚊细胞(C6/36)、金黄地鼠肾原代细胞(Primary Hamster Kidney,PHK)、BHK-21、PK-15、Hela、Vero等。vJEV在PHK、猪肾原代细胞、BHK-21和Vero上可增殖到较高的滴度，而且有明显的细胞病变(CPE)，其特点主要是圆缩和脱落。v目前国内外用于增殖JEV的细胞主要有PHK，BHK-21和鼠脑。I增殖特性增殖特性致病机制致病机制I肝、脾、肌肉神经元血循蚊虫叮咬叮咬部位繁殖初期病毒血症病毒血症CNS和脑皮质的深层炎症炎症 Reported JE cases by countries and regions where viral transmission is proven or suspected I 流行范围流行范围 乙脑的流行在热带地区无明显的季节性，而在温带和亚热带地区则有严格的季节性。据我国多年统计资料，约有90%的病例发生在7、8、9三个月内，流行高峰华中地区多在7-8月，华南和华北地区由于气候特点，流行较华中提早或推迟1个月。云南省的流行高峰也较华中推迟1个月。I 流行季节流行季节Transmission cycle of JEVTransmission cycle of JEVI传播循环传播循环乙型脑炎的防制乙型脑炎的防制 v灭蚊是控制乙脑流行的一项重要措施 药物灭蚊法、生物学和生态学灭蚊法v免疫接种是一种最有效的预防措施 猪是JEV的扩增动物，预防猪感染本病是防止人患乙脑的重要措施，在蚊虫活动季节开始前1个月或配种前1个月注射疫苗。I乙脑的治疗没有特殊的方法，主要是对症治疗。其主导性防制措施防蚊灭蚊与免疫接种。Japanese encephalitis vaccines for humanVaccine Description Substrate Strain(s)Manufacturer(s)inactivated mouse brain Nakayama,India(1),Japan(7),Korea(1),P1 Taiwan(1),Thailand(1),Vietnam(1)inactivated PHK P3 China:Beijng,Shanghai,Changchun live,attenuated PHK SA14-14-2 China:Chengdu and Wuhan I人用乙脑疫苗人用乙脑疫苗 疫疫 苗苗 基基 质质 效效 力力 副副 作作 用用 价价 格格 灭活 鼠 脑 2-3，95%强烈：触痛 红肿 20%高 轻度全身症状10-30%(头痛 肌痛 发热 胃肠道）全身性荨麻疹 面部血管性 水肿 呼吸窘迫 0.6%灭活 PHK 2-3，90%轻微：肿胀4%头痛1%高 发热6%疹 减毒、活 PHK 1，80-100%少见：头痛0.03%发热0.46%低 恶心0.03%疹0.08%I3种疫苗的比较种疫苗的比较人用乙脑疫苗人用乙脑疫苗Virulent parent virus SA14 Isolated from mosquitoes in China 11 passages in newborn mice 100 passages in PHK cell culture 3 plaque purifications Irradiation by u.v.and plaque purification in PHK cellsClone12-1-7First attenuated variant 6 animal passages 6 plaque purifications SA14-2-8SA14-5-3 5 passages in suckling mice 2 plaque purifications in PHKSA14-14-2/PHK 9 passages and plague purificationsin PDK cell culture SA14-14-2/PDKI疫苗毒株的传代减毒过程疫苗毒株的传代减毒过程The derivation of live attenuated vaccine clones of JEV by passage of the wild-type strain SA14 in cell culturev日本有2种活疫苗供兽用。一为M株，经胎鼠皮肤培养传代致弱，供猪用，亚洲其它国家有的也用此苗；一为ML-17株，JaOH0566株经3733302725减毒而获得。v我国目前猪用乙脑疫苗主要是鼠脑灭活疫苗，该苗具有注射剂量大、需多次注射、效果不稳定及免疫力不持久等不足之处。I兽用乙脑疫苗兽用乙脑疫苗 v亚单位疫苗v重组活疫苗v核酸疫苗I发展中的乙脑疫苗发展中的乙脑疫苗v森田公一等(日本，1991)用JEV E基因C-末端1/3长度cDNA片段的原核表达产物免疫小鼠，发现该融合蛋白能诱导小鼠产生抗JEV抗体，且对100PFU JEV攻击的保护率为100%(8/8)。v刘金华等(1998)用昆虫细胞(sf9)表达的prM-E蛋白免疫2头猪，每头2mL，2周后加注1mL。第2次免疫1周后，HI抗体为2，2周为8，3周达到16。I 乙脑亚单位疫苗乙脑亚单位疫苗I乙脑重组活疫苗乙脑重组活疫苗List of live virus-vector vaccine of JEVList of live virus-vector vaccine of JEV时间时间199019911991199119921992199519971997199819991999作者作者AtsushiKonishiKonishiMason Konishi Konishi娄元梅刘启富KonishiKonishiGuirakhooMonath 载体载体VacciniaVacciniaAvipoxVacciniaNYVACVacciniaVacciniaVacciniaNYVACALVACNYVACALVACYFVYFV基因片段基因片段prM prM-E NS1prM,E ,NS1 prM-E-NS1-NS2a-NS2b prM-E-NS1-NS2a E-NS1-NS2a-NS2b E-NS1-NS2aprM,E,NS1prM-EE-NS1-NS2a prM-E-NS1-NS2aprM-E-NS1-NS2a prM-E-NS1 prM-E-NS1prM-E-NS1prM-E-NS1 prM-EprM-E 宿主宿主rabbi t,mice mice micemice swinemicemice rabbitmice humanmicemonkey 免疫应答及保护力免疫应答及保护力均有特异性抗体反应,抗致死性攻击有抗体反应,保护力高有抗体反应,保护力低 抗致死性攻击均有特异性抗体反应,抗致死性攻击均有特异性抗体反应特异性抗体反应,抗致死性攻击有抗体反应,无保护力有抗体反应,有保护力特异性抗体反应，抗致死性攻击均产生特异性抗体和CTL 均引起体液免疫和细胞免疫应答 抗致死性攻击特异性体液免疫应答,抗致死性攻击 Iv 病原学方法病原学方法病毒分离鉴定反向被动血凝试验(RPHA)免疫细胞化学法荧光抗体染色法RT-PCR乙型脑炎的诊断乙型脑炎的诊断Iv血清学方法血清学方法补体结合试验(CT)血凝抑制试验(HI)中和试验(NT)乳胶凝集试验(LAT)酶联免疫吸附试验(ELISA)乙型脑炎的诊断乙型脑炎的诊断Structural m7GpppAmp AG ORF(10.3kb)UAG CU-OH3/NCR5/NCRNonstructural C prM E NS1 NS2a NS2b NS3 NS4a NS4b NS5 125 165 500 350 227 130 620 290 115 905prM75950.6kbIAUGJEV genome structure(11kb)乙型脑炎病毒的分子生物学乙型脑炎病毒的分子生物学蛋白分类蛋白分类 蛋白名称蛋白名称 MW(KD)糖基化糖基化(位点位点)结构功能结构功能结构蛋白 C 13.9 否 C端疏水，衣壳蛋白 prM 18.5 是(15)N端疏水，M的前体 M 8.3 否 完全疏水，毒粒包膜蛋白 E 53 是(154)C端疏水，毒粒囊膜蛋白非结构蛋白 NS1 35 是(130,207)早期复制、组装、释放 NS2a 17 否 疏水，膜功能？NS2b13 否 疏水，膜功能？NS3 64 否 protease/helicase?NS4a 28 否 疏水，功能待定 NS4b14 否 疏水，功能待定 NS5 105 否 polymerase?I乙脑病毒的蛋白及其功能乙脑病毒的蛋白及其功能vNS4、NS5 N末端和C末端 AA序列，功能v新型疫苗 基因疫苗 重组活疫苗v感染性全长cDNA克隆 黄庆生等(2000)JEV SA14 致病机理、减毒机制、基因组功能I研究展望研究展望 猪乙型脑炎减毒活疫苗研究猪乙型脑炎减毒活疫苗研究 以原代地鼠肾(PHK)细胞为培养基质研制出了猪用乙脑冻干减毒活疫苗，解决了我国目前还没有国家正式 批准的猪用乙型脑炎弱毒疫苗，满足生产急需。该疫苗对小白鼠和妊娠母猪的安全性良好。该苗能在小鼠和仔猪体内引起特异性免疫应答。疫苗在-20的保存期至少为2年，在4-8可保存1年半。II小鼠脑内致病力测定怀孕母猪安全试验PHK细胞制备及培养接毒与收获效价测定无菌检验疫苗冻干安全性测定小鼠免疫原性测定仔猪免疫原性测定免疫原性测定LAT脾细胞增殖试验保存期测定试验毒性II几批疫苗冻干前后效价的检测几批疫苗冻干前后效价的检测 滴度滴度（TCID50/1.0mL）冻干前冻干前 冻干后冻干后 1 10-7.6 10-6.9 2 10-7.8 10-7.1 3 10-7.2 10-6.8 4 10-7.5 10-6.9批批 次次疫苗安全性试验结果疫苗安全性试验结果未出现不良反应，无流产，死胎等异常情况，均正常分娩，胎儿发育正常。小鼠脑内致病力试验毒性试验怀孕母猪安全试验动物数动物数 接种途径接种途径 剂量剂量(mL)结果结果10只4只3头脑内腹腔耳静脉0.030.5314d无死亡30min内无异常反应，3d内健存II 采采 血血 时时 间（周）间（周）0 1 2 4 6 8 I 1:2(1)1:8(2)1:8(3)1:8(3)1:1(3)1:4(1)1:4(1)1:4(1)1:2(1)II 1:4(1)1:8(2)1:8(2)1:8(2)1:2(1)1:2(2)1:2(2)1:4(1)1:1(1)1:2(1)III 1:1(4)1:4(1)1:4(3)1:4(4)1:2(2)1:2(1)1:1(1)疫苗免疫鼠抗体水平检测疫苗免疫鼠抗体水平检测(LAT)批批 次次II减毒活疫苗免疫鼠细胞免疫水平检测减毒活疫苗免疫鼠细胞免疫水平检测S III剂量剂量 猪号猪号 免前免前 免免 后后(周周)1 2 3 4 5 6 7 8 1mL 27 -1:1 1:4 1:1 1:16 1:8 1:4 1:4 37 -1:1 1:4 1:4 1:4 1:4 1:1 1:22mL 17 -1:4 1:8 1:8 1:32 1:4 1:4 47 -1:1 1:1 1:8 1:8 1:16 XX X3mL 57 -1:1 1:1 1:8 1:8 1:8 1:8 1:2 1:1 67 -1:1 1:8 1:4 1:16 1:64 1:16 1:32对照 77 -87 -97 -疫苗免疫疫苗免疫40日龄仔猪的抗体应答（日龄仔猪的抗体应答（LAT）II保存条件保存条件 不同保存时间（月）不同保存时间（月）TCID50/1.0mL（）1261218 -20 10-6.8 10-6.9 10-6.810-6.510-6.4 4-8 10-6.8 10-6.7 10-6.710-6.410-5.6疫苗不同保存条件下疫苗不同保存条件下TCID50测定测定 乙型脑炎及病原学特征乙型脑炎及病原学特征乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)，又称日本乙型脑炎(简称乙脑)，是一种严重威胁人畜健康的急性病毒性蚊媒传染病。此病主要在夏秋流行，属于自然疫源性疾病，病毒通常在蚊猪易感动物间循环。该病是我国及亚州地区的一种严重传染病，我国除少数省，自治区外，大部分地区都有JE流行。在我国三带喙库蚊是JE的主要传播媒介，猪是主要中间宿主和扩散宿主。乙脑对人类的危害：死亡、残疾患者症状：高热、狂暴或沉郁等神经症状为主要特征 其临床表现：潜伏期5d-15d，病程可分为3个阶段：初期、急性脑炎期、恢复期。乙脑对猪的危害：引起妊娠母猪流产，产死胎、木乃伊胎、畸形胎及弱仔；使公猪单侧或两侧性睾丸肿大，发热继而萎缩变硬。牛、羊及家禽多为隐性感染，马可发生严重的脑炎 JE的病原为乙脑病毒(Japanese encephalitis Virus,JEV)JEV原属于报膜病毒科(Tongaviridae)乙组虫媒病毒的黄病毒属(Flavivrius)1984年另立为黄病毒科(Flaviridae)JEV分三个清型：JaGAr,Nakayama和Mie(intremediate type)JEV粒子呈球形，呈20而体对称，有囊膜，毒粒直径为45nm-50nm(核心30nm)，是黄病毒科最小的病毒之一 JEV在环境中不稳定 10%灭活兔血清和0.5%乳白蛋白水解物等对病毒有较好的保护作用 JEV大多数毒株能凝集鹅、鸽及初生雏鸡的红细胞，pH以6.5-6.8最适宜 乙脑病毒可在7-9日龄的鸡胚和多种组织培养细胞内增殖 通常只在仓鼠肾细胞、猪肾和羊胎肾细胞上恒定地引起细胞病变(CPE)乙脑病毒的分子生物学研究进展乙脑病毒的分子生物学研究进展 JEV为单股正链RNA病毒，基因组长11Kb，沉降系数为42S，具有感染性 整个基因组由5端非编码区(5-noncoding region,5NCR)，一个几乎跨越整个基因组的单一开放阅读框(ORF)和3端非偏码区(3-NCR)构成，无亚基因组结构 ORF大小为10.3Kb，共编码约3430个氨基酸基 ORF编码1个多聚蛋白前体 C蛋白起调节蛋白和保护基因组免受核酸酶破坏的作用，与病毒的复制和生物合成密切相关 M蛋白参与病毒的感染过程，它能诱生具有轻度中和作用的抗体 E蛋白为主要结构蛋白，该蛋白在大多数黄病毒中是保守的，它是毒粒表面的重要成份，由它形成的表面抗原决定簇具有血凝活性和中活作用，能刺激机体产生血凝抑制抗体和中和抗体，可保护机体免受病毒的攻击，与病毒的吸附，侵入，致病和诱导缩主的免疫应答等作用密切相关 NS1为分泌型糖蛋白，其具体功能不清，但认为其参与病毒复制的早期阶段,NS1还可能参与病毒的组装和释放，是主要的抗原成份之一。NS1蛋白不组成毒粒，所以没有中和活性和血凝抑制活性，但它具有可溶性补体结合活性，可在不出现中和抗体的情况下诱生保护力，即不产生抗体依赖性增强作用，NS1的基因和表型具有高度同源性NS2蛋白可能与膜功能相关 NS3蛋白在病毒感染细胞中对病毒RNA的复制具有十分重要的功能 NS5可能参与病毒RNA聚合酶的组成 乙脑的防制及乙脑疫苗的研究进展乙脑的防制及乙脑疫苗的研究进展 乙脑的治疗没有特效方法，除采取一般措施外，主要是对症治疗。本病主导性防制措施是灭蚊和免疫接种 人用乙脑疫苗:鼠脑灭活疫苗，原代地鼠肾灭活疫苗和原代地鼠肾减毒活疫苗兽用疫苗主要有减毒活疫苗和鼠脑灭活疫苗新一代的乙脑疫苗：亚单位疫苗，重组活疫苗和核酸疫苗 2.2 乙脑酶联免疫吸附试验乙脑酶联免疫吸附试验乙脑ELISA抗原的制备将病毒分别接种于9日龄鸡胚的尿囊腔中，37进行培养48小时后收集尿囊液。离心弃沉淀。上清用冷丙酮沉淀，离心后沉淀冷冻抽干,加入生理盐水溶解，上清作为病毒抗原。对照抗原用同样方法获得。ELISA最佳反应条件的确定病毒抗原及对照抗原分别横行稀释包被奇数列和偶数列包被过夜。将血清纵列稀释，37 反应1h加入1:8000兔抗猪酶标抗体，37反应1h加入OPD底物反应15分钟加入 2M H2SO4终止反应。在490nm波长下测定OD值。以阳性血清OD差值大幅度减少时的抗原稀释度为最佳包被浓度，以阳性血清OD差值大幅度减少及阴性血清OD差值很低的血清稀释倍数为血清最佳稀释倍数。ELISA阳性界限的确定检测92份HI检测为阴性的血清，阴阳性临界值以2.1S/P求得。S=(病毒抗原包被孔测得血清OD值-对照抗原包被孔测得血清OD值)的平均值，P=病毒抗原包被孔测得阳性血清OD值-对照抗原包被孔测得阳性血清OD值。定性：S/P阳性界限判为阳性定量：S/P阳性界限的血清最高稀释倍数作为效价。ELISA方法的检验特异性试验重复性试验对比试验敏感性试验阻断试验4.3乙脑间接乙脑间接ELISA方法方法在确定最佳反应条件时，考虑到了三个因素，阳性血清稀释倍数影响OD差值的情况，阴性血清稀释倍数影响OD差值的情况。以HI检测为阴性的92份血清为参考初步确定了阳性标准。用阳性血清来参比，减少操作误差。采用OD值之差作为病毒蛋白抗原与血清反应产生的OD值，消除对照抗原的影响。为了减少反应时间不同造成的误差，将病毒抗原和对照抗原包被在同一块酶标板上奇数及偶数列。ELISA与HI、ELISA与LAT检测结果3.结果与分析结果与分析3.1日本乙型脑炎乳胶凝集试验 结果与分析 3.1.1乙脑乳胶抗原最佳致敏条件的选择最佳致敏浓度：抗原1:32倍稀释，蛋白含量为0.339mg/mL。最佳致敏时间：30min最佳致敏温度：373.1.23.1.2特异性试验及重复性试验特异性试验及重复性试验特异性：乙脑乳胶抗原与pH7.4PBS无自凝；与乙脑阳性血清凝集；与乙脑阴性血清、牛血清、猪布氏杆菌、猪衣原体、猪细小病毒、猪伪狂犬、猪繁殖与呼吸综合征、猪萎缩性鼻炎阳性血清不凝集。重复性：批內及批间检测结果基本一致。3.1.33.1.3乙脑乙脑LATLAT与与HIHI的对比试验的对比试验经统计分析差异不显著(P0.05)。HI+-合计阳性率%LAT+5666266.0-52732合计 61 33 94阳性率%64.9符合率%88.3 3.1.4乙脑乙脑乳胶凝集抗原保存期试验乳胶凝集抗原保存期试验0-4可保存一年以上,室温可保存二个月,表明乙脑乳胶抗原便于保存和运输。3.1.53.1.5乙脑送检血清检测结果乙脑送检血清检测结果用乳胶凝集试验检测了1613份送检血清，其中阳性份数652份，阴性份数961份；阳性率为40.4%。图图1：血清乙脑抗体在不同月份的阳性率情况血清乙脑抗体在不同月份的阳性率情况 II