电泳法--浙江大学.pptx

电泳法电泳法电泳法电泳法：在电解质溶液中，带电荷供试品在电场作用下，向对应的电极方向按不同的泳动速度而进行泳动并且分离的分析方法。特点特点：操作简便、灵敏度高、重现性好、检测范围广。具分离、分析优点，可进行定性、定量分析。特别适合于蛋白、核酸等大分子物质的分离。是生化药物、基因工程药物分析的重要手段。电泳法分类电泳法分类n自由界面电泳自由界面电泳：U型管，最早应用n区带电泳：区带电泳：广泛应用。种类多。（纸电泳、纤维薄膜电泳、PAGE、SDS-PAGE）n高效毛细管电泳高效毛细管电泳（HPCE）区带电泳区带电泳纸电泳：纸电泳：以滤纸为支持载体。自醋酸纤维薄膜用作支持物以来，以逐渐被替代。后者分离清晰、分离速率快、样品用量少、操作简便。纸电泳纸电泳eg.ATP的含量测定：枸橼酸缓冲液（枸橼酸-枸橼酸钠PH3.0）；紫外检视；剪下斑点以盐酸浸泡洗脱，空白滤纸对照，测定吸收度定量区带电泳区带电泳醋酸纤维素薄膜醋酸纤维素薄膜：以醋酸纤维素薄膜为支持载体。用于血清蛋白、脂蛋白的分离、定量。eg.分离血清白蛋白：巴比妥缓冲液（巴比妥-巴比妥钠PH8.6）。点样 电泳 染色（氨基黑）含量测定（洗脱、扫描）区带电泳区带电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)聚丙烯酰胺凝胶为支持载体。电荷/分子大小，分子筛原理分离。垂直板电泳盘状电泳不连续体系连续体系聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续体系：利用不连续的缓冲溶液、PH值和凝胶孔径进行电泳。PAGE以盘状电泳最为常用，属于不连续体系。盘状电泳管中置三种不同的凝胶层：样品胶、浓缩胶、分离胶。三种效应：浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳样品胶浓缩胶分离胶聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳eg.胰岛素有关蛋白质检查：胰岛素有关蛋白质检查：标准品每标准品每100l含含0.5（1）、）、1.0（2）、）、3.0（3）、5.0（4）、100g（5）的溶液。照聚丙烯酰的溶液。照聚丙烯酰胺凝胺凝胶电泳胶电泳法测定，以考马斯亮蓝染色液染色后法测定，以考马斯亮蓝染色液染色后，目，目测测100g/100l供试品与（供试品与（5）中主带后泳）中主带后泳动较快动较快的的一条色带，颜色不得深于（一条色带，颜色不得深于（3）；）；500ug/100l供试品与（供试品与（5）中主带后泳动较慢）中主带后泳动较慢的一条的一条色带，色带，颜色不得深于（颜色不得深于（1）。）。L L1 1=3.0/100*100%=3%=3.0/100*100%=3%L L2 2=0.5/500*100%=0.1%=0.5/500*100%=0.1%区带电泳区带电泳SDS-PAGE法：法：蛋白与十二烷基硫酸钠（SDS）形成复合物，由于SDS的电荷量远远大于蛋白所带电荷，因此与SDS结合的蛋白质带有一致的负电荷，电泳时其迁移速率只取决于Mr。可根据标准曲线求出蛋白分子量。本法适合于蛋白和酶等大分子物质分子量测定。SDS-PAGEeg.尿激酶分子组分比测定：尿激酶由Mr.54000和Mr.33000组成的混合物。高分子量含量不得少于90%。制胶 溶液制备 电泳 染色 脱色 扫描定位、定量高分子量尿激酶峰面积%=高、低分子量尿激酶峰面积和区带电泳区带电泳琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：以琼脂糖为基质，适用于RNA、DNA等核酸及其衍生物的分离。原理：电荷效应、分子筛效应。紫外检测、染色剂染色。eg.肝素钠的鉴别：本品与肝素标准品所显斑点的迁移距离比为0.91.1。高效毛细管电泳（高效毛细管电泳（HPCE）高效毛细管电泳高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis,HPCE）在电场作用下离子迁移速度不同对组分进行分离和分析。该法柱效高、分离速度快、样品量小。特别适合于氨基酸、多肽类、蛋白质、和核酸等生物分子的测定。高效毛细管电泳高效毛细管电泳进样方法压差进样：毛细管虹吸，准确记时电动进样：外加进样电压，黏度大用检测方法直接检测：紫外、荧光、电化学间接检测：添加有检测响应的添加剂，作为本底响生物检定生物检定生物检定法是利用药物对生物体或其离体器官组织等所起的药理作用来检定药物效价的方法，用于无适当理化方法进行检定的药物。生物制品：1.结构复杂、分子量大、成分多样；2.效价和理化法测得的含量无特定关系；3.体内浓度低易受干扰，但生物活性高。生物检定生物检定目前中国药典收载的用生物检定法测定的药物有：胰岛素、肝素、缩宫素、洋地黄等。生物检定有一定的实验误差，主要来源是生物变异性，要对其进行控制。检定方法：直接测定法、量反应平行线测定法。