细胞的分离和破碎.pptx

一、预处理的目的一、预处理的目的1 改变发酵液的物理性质，提高固液分离效率改变发酵液的物理性质，提高固液分离效率加热调pH絮凝和凝聚2 尽可能使产物转入便于后处理的某一相中尽可能使产物转入便于后处理的某一相中 例如:四环素类抗生素的生产 2.1 发酵液的预处理发酵液的预处理 3 去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作杂质中影响最大的是高价无机离子高价无机离子和杂蛋白杂蛋白等二、预处理的具体方法二、预处理的具体方法 1.高价无机离子的去除方法高价无机离子的去除方法 去除钙离子去除钙离子：通常使用通常使用草酸草酸。但由于草酸溶解。但由于草酸溶解度较小，不适合用量较大的场合。度较小，不适合用量较大的场合。去除镁离子去除镁离子：加入：加入三聚磷酸钠三聚磷酸钠，与镁离子形，与镁离子形成络合物。成络合物。用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。例如：环丝氨酸的提取。浓度。例如：环丝氨酸的提取。去除铁离子去除铁离子:加入加入黄血盐黄血盐，使其形成普鲁士蓝，使其形成普鲁士蓝沉淀而除去。沉淀而除去。(4)凝聚凝聚Coagulation和絮凝和絮凝flocculation 目前工业上最常用的预处理方法之一。目前工业上最常用的预处理方法之一。常用于常用于菌体细小菌体细小而且而且粘度大粘度大的发酵液的预处理。的发酵液的预处理。向胶体悬浮液中加入向胶体悬浮液中加入电解质电解质，由于，由于双电层双电层电位降低电位降低，使胶体体系不稳定，胶体粒子间因，使胶体体系不稳定，胶体粒子间因相互碰撞而产生凝集（相互碰撞而产生凝集（1mm左右）的现象。左右）的现象。常用的凝聚剂有：常用的凝聚剂有：Al2(SO4)3.18H2O，AlCl3.6H2O，FeCl3，ZnSO4，MgCO3凝聚凝聚胶体双电层的构造 絮凝絮凝 指指在在某某些些高高分分子子絮絮凝凝剂剂存存在在下下，在在悬悬浮浮粒粒子子之之间间发发生生架架桥桥作作用用而而使使胶胶粒粒形形成成粗粗大大（10mm）的的絮絮凝团的过程。凝团的过程。根据活性基团在水中解离情况的不同，絮凝剂可分为非离子型、阴离子型和阳离子型非离子型、阴离子型和阳离子型三类。根据其来源的不同，工工业业上使用的絮凝剂又可分为如下三类：(1)有机有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物聚丙烯酰胺类衍生物。(2)无机无机高分子聚合物。(3)天然有机天然有机高分子絮凝剂。絮凝剂的分类絮凝剂的分类 絮凝效果与絮凝剂的分子量和类型、絮凝效果与絮凝剂的分子量和类型、加量，溶液的加量，溶液的pH，搅拌速度和时间等，搅拌速度和时间等因素有关。因素有关。带负电荷的菌体带负电荷的菌体 或蛋白质或蛋白质阳离子型高分子絮凝剂阳离子型高分子絮凝剂电解质电解质非离子型和非离子型和阴离子型高分子絮凝剂阴离子型高分子絮凝剂+包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。3.有色物质的去除及其他有色物质的去除及其他 1）使用吸附剂去除有色物质）使用吸附剂去除有色物质 离子交换剂、离子交换纤维、活性炭等 2）用工业酶制剂可净化发酵产物，除去干扰性）用工业酶制剂可净化发酵产物，除去干扰性浑浊物浑浊物 淀粉酶：不溶性多糖单糖3)使用惰性助滤剂使用惰性助滤剂 硅藻土、纸浆、珍珠岩等 4）加入反应剂）加入反应剂 环丝氨酸发酵液用CaO和H3PO4处理一、一、发酵液的过滤特性和滤饼的重量比阻发酵液的过滤特性和滤饼的重量比阻rB 发酵液：高粘度，非牛顿流体，发酵液：高粘度，非牛顿流体，滤饼可压缩。滤饼可压缩。2.2 固固 液液 分分 离离滤饼滤饼传统的过滤cakeConventional filtration滤饼的重量比阻滤饼的重量比阻rB：表示单位滤：表示单位滤饼厚度的阻力系数，是衡量过滤特饼厚度的阻力系数，是衡量过滤特性的主要指标。性的主要指标。对于不可压缩滤饼，比阻值为常数，对于不可压缩滤饼，比阻值为常数，但对于可压缩滤饼，但对于可压缩滤饼，rB=f（p）。）。如忽略过滤介质的阻力，恒压下的过滤速率方程式为：如忽略过滤介质的阻力，恒压下的过滤速率方程式为：q 到瞬间到瞬间，通过单位过滤面积的滤液量，通过单位过滤面积的滤液量，m3/m2；p 操作压差，操作压差，Pa；过滤时间，过滤时间，s；滤液黏度，滤液黏度，Pa.s;rB 滤饼的重量比阻滤饼的重量比阻,m/kg;XB 通过单位体积滤液所形成的滤饼干重通过单位体积滤液所形成的滤饼干重,kg/m3;在不同时间在不同时间测定滤液量测定滤液量,根据过滤面积就可得根据过滤面积就可得q 值。以值。以q为横轴，为横轴，/q为纵轴作图，所得直线获为纵轴作图，所得直线获得斜率（得斜率（M）。）。二、影响过滤速度的因素二、影响过滤速度的因素 菌种菌种 真菌易过滤；放线菌过滤较困难，需预真菌易过滤；放线菌过滤较困难，需预处理；细菌过滤十分困难，絮凝预处理。处理；细菌过滤十分困难，絮凝预处理。培养基组成培养基组成 发酵终止时间发酵终止时间 三、固三、固-液分离设备液分离设备1.板框式压滤机板框式压滤机 国内广泛采用国内广泛采用优点：结构简单、价格低廉、过滤面积大。优点：结构简单、价格低廉、过滤面积大。缺点：不能连续操作、劳动强度大、滤液澄清度不高。缺点：不能连续操作、劳动强度大、滤液澄清度不高。2.鼓式真空过滤机鼓式真空过滤机 主要用于主要用于霉菌霉菌发酵液的过滤发酵液的过滤优点：优点：能连续操作，实现自动化控制，适用于处能连续操作，实现自动化控制，适用于处 理量大而理量大而固体含量较多固体含量较多的滤浆。的滤浆。缺点：压差较小，不适用于滤饼阻力较大的物料。缺点：压差较小，不适用于滤饼阻力较大的物料。DryWashImmersionKnifeCakeFeedRotaryvacuumfilter真空旋转过滤机 3.错流过滤错流过滤 是一种新的过滤方式，与常规过滤的区别在于它是一种新的过滤方式，与常规过滤的区别在于它的固体悬浮液流动方向与过滤介质的固体悬浮液流动方向与过滤介质平行平行。优点：过滤速度快优点：过滤速度快 缺点：固液相的分离不太完全缺点：固液相的分离不太完全错流过滤模式错流过滤模式进料液进料液滤出液滤出液回流液回流液 4.离心分离设备离心分离设备 A 离心分离法离心分离法 1）差速离心）差速离心 生化生化工业工业最常用的方法最常用的方法 2）区带离心）区带离心 生化研究生化研究 分为分为差速差速区带离心和区带离心和平衡平衡区带离心区带离心 用于核酸、蛋白质的分离纯化用于核酸、蛋白质的分离纯化B 离心分离设备离心分离设备1）管式离心机）管式离心机2）碟片式离心机）碟片式离心机3）三相倾斜式离心机）三相倾斜式离心机 含固量较多的发酵液含固量较多的发酵液 细胞破碎细胞破碎:选用物理、化学或机械的方法选用物理、化学或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。来破坏细胞壁或细胞膜。2.3 细细 胞胞 破破 碎碎2.3.1 细胞膜、细胞壁壁的结构和化学组成细胞膜、细胞壁壁的结构和化学组成 1.细菌细菌 2.真菌和酵母真菌和酵母 由难到易的大致排列顺序为：植物细胞由难到易的大致排列顺序为：植物细胞真菌（如酵母菌）革兰氏阳性菌革兰氏阴真菌（如酵母菌）革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌动物细胞。性菌动物细胞。细胞膜的结构细胞膜的结构革兰氏阳性菌细胞壁的结构革兰氏阳性菌细胞壁的结构 革兰氏阴性菌细胞壁的结构革兰氏阴性菌细胞壁的结构 2.3.2 细胞的破碎机理细胞的破碎机理 P242.3.3 细胞的破碎细胞的破碎一、细胞破碎技术的分类一、细胞破碎技术的分类 二、细胞破碎方法二、细胞破碎方法1.机械破碎机械破碎1)高压匀浆法高压匀浆法其中：其中：S S为细胞破碎率；为细胞破碎率；p p为操作压力；为操作压力；N N为循环操作次数；为循环操作次数；k k为破碎速率常数，与细胞种类和操作温度有关。为破碎速率常数，与细胞种类和操作温度有关。特点：特点：适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎，不宜用适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎，不宜用于团状或丝状菌的破碎；于团状或丝状菌的破碎；由于操作中温度会升高，需由于操作中温度会升高，需对料液作冷却处理，保护目的产物活性。对料液作冷却处理，保护目的产物活性。影响因素：主要有压力、循环操作次数和温度。影响因素：主要有压力、循环操作次数和温度。2)珠磨其中：其中：S S为细胞破碎率；为细胞破碎率；t t为间歇操作破碎时间；为间歇操作破碎时间；k k为破碎速率常数为破碎速率常数破碎动力学破碎动力学其中：其中：t t为连续操作破碎时间；为连续操作破碎时间；V V为悬浮液体积为悬浮液体积,m,m3 3;Q Q为料液流量为料液流量,m,m3 3/s/s影响因素影响因素:破碎效果取决于振动速度、破碎效果取决于振动速度、接触时间、助磨剂大小、用量及菌体浓接触时间、助磨剂大小、用量及菌体浓度等。度等。用于有大量菌丝体和一些有亚细胞器用于有大量菌丝体和一些有亚细胞器的微生物细胞的破碎。的微生物细胞的破碎。两种方法的比较两种方法的比较高压匀浆法高压匀浆法珠磨法珠磨法操作参数少，易于确定操作参数少，易于确定 操作参数多，一般凭经验估计操作参数多，一般凭经验估计24次循环次循环 一次操作一次操作级间冷却级间冷却 破碎和冷却双重功能破碎和冷却双重功能应用范围较窄应用范围较窄应用范围广，绝大多数微生物应用范围广，绝大多数微生物3）撞击破碎）撞击破碎 4 4）超声波破碎）超声波破碎破碎机理破碎机理:利用发射利用发射5 5z z的超声波的超声波探头探头处理细胞悬浮液。处理细胞悬浮液。可选配变幅杆可选配变幅杆：2、3，10，15，18破碎容量：0.5-600ml占空比:0.1-99.9%2.非机械法非机械法1）酶溶法）酶溶法 用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。外加酶法外加酶法 微生物细胞：溶菌酶、几丁质酶（真菌）植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 自溶法一种特殊的酶溶方式自溶法一种特殊的酶溶方式 微生物产生的溶胞酶水解自身细胞壁上的聚合微生物产生的溶胞酶水解自身细胞壁上的聚合物结构，使菌体自溶。物结构，使菌体自溶。用于生产最典型的例子是酵用于生产最典型的例子是酵母自溶物的制备。母自溶物的制备。2）化学法）化学法 用化学试剂改变细胞壁或膜的通透性，使内含物用化学试剂改变细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择性地渗透出来。有选择性地渗透出来。酸碱处理酸碱处理 化学渗透法化学渗透法 a.表面活性剂表面活性剂 主要是破坏内膜的磷脂双分子层，释放胞内物质主要是破坏内膜的磷脂双分子层，释放胞内物质 b.EDTA螯合剂螯合剂 处理革兰氏阴性菌，对细胞外层膜有破坏作用处理革兰氏阴性菌，对细胞外层膜有破坏作用c.有机溶剂有机溶剂 甲苯溶解细胞壁中的类脂甲苯溶解细胞壁中的类脂d.变性剂变性剂 盐酸胍盐酸胍3）物理法物理法 渗透压冲击法渗透压冲击法 特点：适用于易于破碎的细胞，如动物细胞和特点：适用于易于破碎的细胞，如动物细胞和革兰氏阴性菌；对革兰氏阳性菌不适用。革兰氏阴性菌；对革兰氏阳性菌不适用。冻融法冻融法特点：此法主要适用于大肠杆菌和细胞壁较薄特点：此法主要适用于大肠杆菌和细胞壁较薄的细胞，特别适用于位于胞间质的酶的释放。的细胞，特别适用于位于胞间质的酶的释放。3.机械破碎法与非机械法的比较机械破碎法与非机械法的比较比较项目比较项目机械法机械法非机械法非机械法破碎机理破碎机理切碎细胞切碎细胞溶解局部壁膜溶解局部壁膜碎片大小碎片大小细小细小较大较大内含物释放内含物释放全部全部部分部分黏度黏度高（核酸多）高（核酸多）低（核酸少）低（核酸少）时间，效率时间，效率时间短，效率高时间短，效率高时间长，效率低时间长，效率低设备设备需专用设备需专用设备不需专用设备不需专用设备通用性通用性强强差差经济经济成本低成本低成本高成本高应用范围应用范围实验室，工业实验室，工业实验室实验室三、破碎率的测定三、破碎率的测定 1.直接测定法直接测定法 破碎前用显微镜或电子微粒计数器直接计数完整细胞的量，破碎后用破碎前用显微镜或电子微粒计数器直接计数完整细胞的量，破碎后用染色法区分。例如革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈紫色，而受损害的染色法区分。例如革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈紫色，而受损害的呈亮红色。呈亮红色。2.测定释放的蛋白质含量或酶的活力测定释放的蛋白质含量或酶的活力 与与100%的标准数比较的标准数比较 3.测定导电率测定导电率 导电率随细胞破碎率的增加而呈线性增加导电率随细胞破碎率的增加而呈线性增加。四、细胞破碎研究方向四、细胞破碎研究方向 1.多种破碎方法相结合多种破碎方法相结合 2.与上游过程相结合与上游过程相结合 上游培养（培养基组成、上游培养（培养基组成、pH、温度）；用基因工程的方法对菌种改造、温度）；用基因工程的方法对菌种改造 3.与下游过程相结合与下游过程相结合 在破碎细胞的同时，要考虑碎片对后分离的影响。如碎片太小，固液分在破碎细胞的同时，要考虑碎片对后分离的影响。如碎片太小，固液分 离困难，未除净的碎片将造成层析柱和超滤膜的堵塞。离困难，未除净的碎片将造成层析柱和超滤膜的堵塞。思考题思考题:1如何预处理发酵液如何预处理发酵液?2凝聚和絮凝的区别凝聚和絮凝的区别3滤饼的重量比阻滤饼的重量比阻rB4了解常用固了解常用固-液分离设备及其特点液分离设备及其特点5常用的细胞破碎方法常用的细胞破碎方法,了解机械破碎法所用设备了解机械破碎法所用设备6P33 2、5