目的基因导入受体细胞2.pptx

第六章第六章目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞第三节 重组子的筛选 在重组在重组DNADNA分子的转化、转染或转导过程分子的转化、转染或转导过程中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选出期待的克隆子出期待的克隆子。概念概念克隆子克隆子转化子转化子重组子重组子将摄取外源将摄取外源DNADNA分子并能使该分子在其中稳定维持的受分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞统称为体细胞统称为克隆子克隆子。把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做转化转化子（子（导入外源导入外源DNADNA分子后能稳定存在的受体细胞称为分子后能稳定存在的受体细胞称为转转化子化子），现在这两者有通用的趋向。现在这两者有通用的趋向。含有含有重组重组DNADNA分子分子的克隆子被称为的克隆子被称为重组子重组子，如果重组子如果重组子中含有中含有外源目的基因外源目的基因则又称为则又称为阳性克隆子阳性克隆子或或期望重组子期望重组子。经过各种方法将外源经过各种方法将外源DNADNA分子导入受体细胞后，获得所分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选克隆子的筛选。一、遗传表型直接筛选法（一）根据载体选择标记初步筛选转化子（一）根据载体选择标记初步筛选转化子在构建基因工程载体系统时，通常在载体在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNADNA分子分子中组装了一种或两种中组装了一种或两种选择标记基因选择标记基因，在受体细胞，在受体细胞内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性，内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性，作为作为筛选转化子的依据。筛选转化子的依据。一般的做法一般的做法是是:将转化处理后的受体细胞接种在含适将转化处理后的受体细胞接种在含适量量选择药物的培养基选择药物的培养基上，在最适生长温度上，在最适生长温度条件下培养一定时间，根据菌落生长情况条件下培养一定时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。挑选出转化子。常用的常用的选择标记选择标记基因基因主要是：主要是：抗性基因；抗性基因；表达产物可以表达产物可以发光或使反应底发光或使反应底物显色的基因物显色的基因相应的选择条件相应的选择条件是：是：可以可以被抗性基因产被抗性基因产物分解的抗生素物分解的抗生素；可以使基因产物发可以使基因产物发光的光线，或者是可光的光线，或者是可以使基因产物显色的以使基因产物显色的试剂。试剂。选择培养基选择培养基是：是：根据宿主细胞类型配置的培养基，对于根据宿主细胞类型配置的培养基，对于细菌受体细胞细菌受体细胞而言，通常用而言，通常用LBLB培养基，培养基，在在LBLB培养基中加入适量的某种选择物，即为培养基中加入适量的某种选择物，即为选择培养基。选择培养基。选择物：选择物：是由是由载体载体DNADNA分子上携带的分子上携带的选择标记基选择标记基因因所决定。所决定。（一）根据载体选择标记初步筛选转化子（1 1）抗药性筛选）抗药性筛选（2 2）插入失活筛选法）插入失活筛选法（3 3）插入表达筛选法）插入表达筛选法（4 4）显色互补筛选法）显色互补筛选法（5 5）利用报告基因筛选植物转化细胞）利用报告基因筛选植物转化细胞（6 6）利用遗传选择标记筛选哺乳动物）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞转基因细胞（1 1）抗药性筛选）抗药性筛选正向选择方式正向选择方式注意：注意：利用利用含一种选择药物的选择培养基含一种选择药物的选择培养基无法无法区分重组子和非重组子，只能区分转化子区分重组子和非重组子，只能区分转化子和非转化子。和非转化子。非转化子呈非转化子呈 ApAps s、TcTcs s 转化子呈转化子呈 ApApr r、TcTcr r/s/s（2）插入失活筛选法双抗药性筛选双抗药性筛选双双（3）插入表达筛选法利用外源目的基因插入特定载体后能利用外源目的基因插入特定载体后能激活筛激活筛选标记基因的表达，选标记基因的表达，由此进行转化子的筛由此进行转化子的筛选。选。有些载体在设计时，在筛选标记基因前面连有些载体在设计时，在筛选标记基因前面连接上一段接上一段负调控序列负调控序列，当，当插入失活该负调插入失活该负调控序列控序列时，其下游的筛选标记基因才能表时，其下游的筛选标记基因才能表达。达。例如例如pTR262pTR262质粒载体，它由质粒载体，它由pBR322pBR322衍生而来，其衍生而来，其TcTcr r基因的上游基因的上游含有一段含有一段噬菌体噬菌体DNADNA的的CICI阻遏蛋白编码阻遏蛋白编码基因及其调控序列，基因及其调控序列，CICI基因表达的阻遏蛋白可以抑制基因表达的阻遏蛋白可以抑制TcTcr r基因的表达。基因的表达。当外源当外源DNADNA片段片段插入插入CICI基因的基因的Hin dHin d或或BglBgl位点位点上时，上时，CICI基因失活。基因失活。TcTcr r基因基因因阻碍解除而得因阻碍解除而得以以表达表达，故阳性重组子为，故阳性重组子为TcTcr r表型。表型。质粒本身质粒本身因为因为TcTcr r基因受阻碍为基因受阻碍为TcTcs s表型表型，当转化细，当转化细菌涂布在菌涂布在TcTc平板上时，只有含有外源平板上时，只有含有外源DNADNA插入片段的阳插入片段的阳性重组子的转化菌才能生长成菌落。性重组子的转化菌才能生长成菌落。（4）显色互补筛选法lacZ lacZ 基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性突变体半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补，这种互补现象称为之间实现互补，这种互补现象称为-互补互补。具有完整乳糖操纵子的菌体能转译具有完整乳糖操纵子的菌体能转译-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(Z)(Z)、IPTGIPTG和和X-galX-gal时，产生兰色沉淀物，使菌落时，产生兰色沉淀物，使菌落成为蓝色。如果在载体成为蓝色。如果在载体DNADNA上组入上组入-半乳糖苷酶半乳糖苷酶基因（基因（lacZ)lacZ)部分缺失的片段部分缺失的片段(lacZ(lacZ)则重组则重组DNADNA分子转化分子转化lacZlacZ互补型菌落，会在含有互补型菌落，会在含有X-galX-gal和和IPTGIPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落。的培养基中得到的转化子是蓝色菌落。lac Zlac Z是是-半乳糖苷酶基因部分缺失的半乳糖苷酶基因部分缺失的DNADNA片段，片段，含含lac Zlac Z的重组载体转化的重组载体转化lac Zlac Z互补型菌株，互补型菌株，可转译可转译-半乳糖苷酶半乳糖苷酶，在含有，在含有X-galX-gal（5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-D-D-半乳糖苷）和半乳糖苷）和IPTGIPTG（异丙基（异丙基-硫硫代半乳糖苷）代半乳糖苷）的培养基上使转化子成为蓝色菌落，的培养基上使转化子成为蓝色菌落，而而lac Zlac Z互补型菌株本身为白色菌落互补型菌株本身为白色菌落。当。当lac lac Z Z区插入外源基因后，再转化区插入外源基因后，再转化lac Zlac Z互补型菌互补型菌株，由于不能翻译株，由于不能翻译-半乳糖苷酶，转化子即使在半乳糖苷酶，转化子即使在含有含有X Xgalgal和和IPTGIPTG的培养基上也只能长成白色菌的培养基上也只能长成白色菌落。这样可以区分含外源基因和不含外源基因的落。这样可以区分含外源基因和不含外源基因的转化子。转化子。此方法主要用于原核生物。此方法主要用于原核生物。互互补补的的检检测测以显色剂以显色剂x-galx-gal作为选择物时作为选择物时:DNADNA对照组对照组不应出现任何菌落；不应出现任何菌落；感受态细胞对照组长感受态细胞对照组长出的菌落应全是蓝色出的菌落应全是蓝色的；的；感受态细胞有效性对照组长感受态细胞有效性对照组长出的菌落中应出的菌落中应有白色的。有白色的。其中一项不符，就有可能挑出假的转化子其中一项不符，就有可能挑出假的转化子菌落。菌落。（5）利用报告基因筛选植物转化细胞报告基因：报告基因：系指系指其编码产物其编码产物能够被快速地测定，能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。用途的基因。在在植物转基因植物转基因研究中，在有选择压力的情况下，研究中，在有选择压力的情况下，可利用报告基因在受体细胞内的表达，从大量非可利用报告基因在受体细胞内的表达，从大量非转化克隆中选择出转化细胞；同时，报告基因可转化克隆中选择出转化细胞；同时，报告基因可以和某些目的基因构成以和某些目的基因构成嵌合基因嵌合基因，从报告基因的，从报告基因的表达了解目的基因的表达情况及推测基因调控序表达了解目的基因的表达情况及推测基因调控序列列。常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码。常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他持殊产物的基因等某些酶类或其他持殊产物的基因等。特征特征作为报告基因，在遗传选择和筛选检作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：测方面必须具有以下几个条件：(1)(1)已被克隆和全序列已测定；已被克隆和全序列已测定；(2)(2)表达产物在受体细胞中本不存在，表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；源性表达产物；(3)(3)其表达产物能进行定量测定。其表达产物能进行定量测定。新霉素磷酸转移酶基因（新霉素磷酸转移酶基因（nptnpt）抗新霉素、卡抗新霉素、卡那霉素、庆大霉素和那霉素、庆大霉素和G418G418等抗生素，成为筛选动等抗生素，成为筛选动植物转化子的选择标记基因。植物转化子的选择标记基因。潮霉素磷酸转移酶基因（潮霉素磷酸转移酶基因（hpthpt）赋予转化子能抗赋予转化子能抗潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物转化子。转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。氯霉素乙酰转移酶基因（氯霉素乙酰转移酶基因（catcat）也被用于筛选动也被用于筛选动植物转化子的标记基因。植物转化子的标记基因。-葡萄糖酸酶基因（gus）gusgus的基因产物的基因产物-葡萄糖酸酶葡萄糖酸酶（GUSGUS）能够催化能够催化4-4-甲基伞形花酮甲基伞形花酮-D-D-葡萄糖苷酸，葡萄糖苷酸，产生荧光物质产生荧光物质4-4-甲基伞形花酮，以此筛选含甲基伞形花酮，以此筛选含gusgus基因的转化子。基因的转化子。由于植物细胞由于植物细胞GUSGUS本底非常低，因此广泛地应用于本底非常低，因此广泛地应用于筛选植物转化子。筛选植物转化子。尤其是尤其是gusgus基因的基因的3 3端与其他结构基因连接产生端与其他结构基因连接产生的的嵌合基因嵌合基因仍能正常表达，产生的仍能正常表达，产生的融合蛋白融合蛋白中仍中仍有有GUSGUS活性，可用于外源基因在转化生物体中的定活性，可用于外源基因在转化生物体中的定位分析。位分析。萤火虫荧光素酶基因（luc）lucluc表达产物表达产物萤火虫荧光素酶（萤火虫荧光素酶（LUCLUC）在）在MgMg2+2+的作用的作用下，下，可以与荧光素和可以与荧光素和ATPATP底物发生反应，底物发生反应，形成形成与酶结与酶结合的合的腺苷酸荧光素酰化复合物，腺苷酸荧光素酰化复合物，经过氧化脱羧作用经过氧化脱羧作用后，后，该复合物转变成为处于激活状态的氧化荧光素，该复合物转变成为处于激活状态的氧化荧光素，可以用可以用荧光测定仪荧光测定仪快速灵敏地检测出产生的荧光，快速灵敏地检测出产生的荧光，是目前研究动植物转基因很好用的一种报告基因。是目前研究动植物转基因很好用的一种报告基因。LucLuc基因检测十分迅速，灵敏度高，成本低，不存在基因检测十分迅速，灵敏度高，成本低，不存在放射性同位素检测对人体健康和环境生态所造成的放射性同位素检测对人体健康和环境生态所造成的危害，也没有内源荧光产生的背景干扰，因此，危害，也没有内源荧光产生的背景干扰，因此，LucLuc是是一种理想的报告基因一种理想的报告基因。抗除草剂抗除草剂barbar基因。基因。barbar基因编码磷化乙酰转移基因编码磷化乙酰转移酶（酶（PATPAT），使转化子对含有磷化麦黄酮（），使转化子对含有磷化麦黄酮（PPTPPT）成分的除草剂具有抗性。成分的除草剂具有抗性。冠瘿碱合成酶基因。冠瘿碱合成酶基因。主要包括主要包括胭脂碱合成酶基因胭脂碱合成酶基因和章鱼碱合成基因和章鱼碱合成基因两类，存在于土壤农杆菌两类，存在于土壤农杆菌TiTi质粒质粒的的T-DNAT-DNA区段。区段。冠冠瘿瘿碱合成酶基因在植物细胞中的表达产物可以催碱合成酶基因在植物细胞中的表达产物可以催化一些特殊反应，通过电泳分离及菲醌荧光染料染化一些特殊反应，通过电泳分离及菲醌荧光染料染色，方便地观察，据此作为报告基因用于转植物基色，方便地观察，据此作为报告基因用于转植物基因细胞的筛选。因细胞的筛选。冠冠瘿瘿碱合成酶基因在植物基因工程早期应用较多，碱合成酶基因在植物基因工程早期应用较多，现已逐渐被其他更为理想的报告基因所取代。现已逐渐被其他更为理想的报告基因所取代。（6）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞 在植物转基因研究中采用的在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移氯霉素乙酰转移酶酶(Cat)(Cat)基因和新霉素磷酸转移酶基因和新霉素磷酸转移酶(Npt)(Npt)基基因因也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。常用的标记基因还有：常用的标记基因还有：-胸腺核苷激酶基因（胸腺核苷激酶基因（tktk）、）、-二氢叶酸还原酶基因（二氢叶酸还原酶基因（dhfrdhfr）-次黄嘌呤次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hgprthgprt）-细菌的黄嘌呤细菌的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因基因(ecogpt)(ecogpt)等。等。胸腺核苷激酶基因（胸腺核苷激酶基因（tktk）、二氢叶酸还原酶基因）、二氢叶酸还原酶基因（dhfrdhfr）及次黄嘌呤）及次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hgprthgprt）等的）等的表达产物直接或间接参与核苷酸合表达产物直接或间接参与核苷酸合成代谢。成代谢。这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调而死亡，只有在添加某些核苷酸的培养基中才能生而死亡，只有在添加某些核苷酸的培养基中才能生长。长。如果用这样的如果用这样的缺陷型细胞作为受体细胞缺陷型细胞作为受体细胞，导入含有，导入含有上述基因的外源上述基因的外源DNADNA，补充原来缺失的基因，使核，补充原来缺失的基因，使核苷酸合成代谢恢复正常，可以苷酸合成代谢恢复正常，可以在不添加核苷酸的培在不添加核苷酸的培养基养基中正常生长。根据这一性质可以在不添加核苷中正常生长。根据这一性质可以在不添加核苷酸的培养基中筛选出转化子。酸的培养基中筛选出转化子。三、核酸分子杂交检测法三、核酸分子杂交检测法（p239）基本原理基本原理复性复性RNADNA待测的核酸序列待测的核酸序列杂交的双方杂交的双方用于检测的已知核酸片段用于检测的已知核酸片段探针探针 根据待测核酸的来源以及将其分子结根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固相支持物上的方法的不同。合到固相支持物上的方法的不同。SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交NorthernNorthern印迹杂交印迹杂交斑点和狭线印迹杂交斑点和狭线印迹杂交菌落（或噬菌体）原位杂交菌落（或噬菌体）原位杂交核酸分子杂交检测法分类核酸分子杂交检测法分类又称又称DNA印迹杂交、印迹杂交、Southern DNA印迹杂交印迹杂交1、Southern印迹杂交印迹杂交经琼脂糖凝胶电泳分离的经琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段片段转移到滤膜上转移到滤膜上 与标记的与标记的DNA或或RNA探针杂交探针杂交放射自显影显杂交带放射自显影显杂交带基本原理：基本原理：（1）提取总）提取总DNA（2）酶解）酶解（3）电泳）电泳（4）转印）转印（5）变性解链）变性解链（6）杂交）杂交（7）洗脱）洗脱（8）放射自显影）放射自显影（9）比较分析）比较分析 毛细管虹吸印迹法电转移印迹法真空转移法核酸转移（印迹）方法核酸转移（印迹）方法毛细管虹吸印迹法毛细管虹吸印迹法湿滤纸湿滤纸高盐缓冲液高盐缓冲液滤纸桥滤纸桥凝胶凝胶硝酸纤硝酸纤维素膜维素膜吸水纸吸水纸玻璃板玻璃板支持台支持台容器容器重物重物利用核酸分子在电场中的利用核酸分子在电场中的电泳作用电泳作用将凝胶中将凝胶中的的DNADNA转移到固相支持物上。转移到固相支持物上。湿式电转移湿式电转移干式电转移干式电转移电转移法电转移法尼龙膜尼龙膜凝胶凝胶滤纸滤纸海绵海绵凝胶支持夹凝胶支持夹缓冲液缓冲液电极电极+滤纸滤纸电极电极湿式湿式电转移法电转移法真空转移法真空转移法真空转移装置真空转移装置硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜（简称（简称NCNC膜）膜）优点：优点：吸附能力强，杂交吸附能力强，杂交信号本底低信号本底低缺点：缺点：DNADNA分子结合不牢分子结合不牢固，膜易碎裂，依赖高盐固，膜易碎裂，依赖高盐溶液溶液常用的固相支持物常用的固相支持物尼龙膜（尼龙膜（NylonNylon）优优点：点：结合单链，双链结合单链，双链DNA的能力比的能力比NC膜强，膜强，韧性高，可重复杂交韧性高，可重复杂交缺点：缺点：杂交信号本底高杂交信号本底高常用的固相支持物常用的固相支持物凝胶凝胶滤膜滤膜转移转移RNA 至膜上至膜上RNA 分子分子甲醛变性电甲醛变性电泳（聚丙烯泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳）酰胺凝胶电泳）带有带有RNA片段的凝胶片段的凝胶转膜转膜杂交杂交、显影显影2、Northern印迹杂交印迹杂交两两种种印印迹迹技技术术的的比比较较(P248)12343、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交两种方法的两种方法的基本原理基本原理和和操作步骤操作步骤相同相同 即通过特殊的即通过特殊的加样装置加样装置将变性的将变性的DNA或或RNA核酸样品，核酸样品，直接转移直接转移到适当的杂交滤到适当的杂交滤膜上，然后与核酸探针分子进行杂交以检膜上，然后与核酸探针分子进行杂交以检测核酸样品中是否存在特异性测核酸样品中是否存在特异性DNA或或RNA。斑点杂交法斑点杂交法狭缝式点样器狭缝式点样器 1、斑点印迹为圆形、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状、狭缝印迹为线状 3、鉴别、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量、特异性不高、不能鉴别核酸分子量斑点及狭缝印迹杂交的特点斑点及狭缝印迹杂交的特点4 4、菌落（或噬菌斑）原位杂交、菌落（或噬菌斑）原位杂交基本原理基本原理直接把菌落和噬菌斑转移到滤膜上直接把菌落和噬菌斑转移到滤膜上溶菌、变性溶菌、变性DNA暴露并于滤膜原位结合暴露并于滤膜原位结合与探针杂交与探针杂交溶菌、使溶菌、使DNA暴露暴露洗菌体碎片和洗菌体碎片和Pr使单链使单链DNA牢牢固结合在膜上固结合在膜上操操 作作用用 途途SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交从转化子中提取总从转化子中提取总DNADNA，经，经酶切、电泳分带及变性，酶切、电泳分带及变性，转移膜上，再用转移膜上，再用DNADNA探针与探针与其杂交。操作麻烦。其杂交。操作麻烦。鉴定转化子中鉴定转化子中是否是否含有含有待检测重组待检测重组DNADNA分子；分子；鉴定待检测的鉴定待检测的DNADNA分子分子的的大小大小。斑点印迹斑点印迹杂交杂交把提取的转化子总把提取的转化子总DNADNA直接直接点样到膜上，变性处理后点样到膜上，变性处理后再用再用DNADNA探针与其杂交。操探针与其杂交。操作简单。作简单。只能区别总只能区别总DNADNA中中是否是否含有含有待检测重组待检测重组DNADNA分分子的重组子子的重组子菌落（或菌落（或噬菌斑）噬菌斑）原位杂交原位杂交直接把菌落或噬菌斑印迹直接把菌落或噬菌斑印迹转移到膜上，经溶菌和变转移到膜上，经溶菌和变性处理后使性处理后使DNADNA暴露出来并暴露出来并与滤膜原位结合，再用与滤膜原位结合，再用DNADNA探针与其杂交。操作简单。探针与其杂交。操作简单。广泛地用于从广泛地用于从基因组基因组DNADNA文库文库和和cDNAcDNA文库文库中中筛选含目的基因的重组筛选含目的基因的重组子。子。三种筛选方法的比较三种筛选方法的比较杂交探针杂交探针指具有一定序列的核苷酸指具有一定序列的核苷酸片段，它能与互补的核酸序列复性杂交，片段，它能与互补的核酸序列复性杂交，并且通过适当标记进行检测。并且通过适当标记进行检测。5、核酸杂交探针、核酸杂交探针(自学自学)同源或部分同源探针同源或部分同源探针总总cDNAcDNA探针探针特异性特异性cDNAcDNA探针探针人工合成的寡核苷酸探针人工合成的寡核苷酸探针（1）核酸杂交探针的种类）核酸杂交探针的种类理想的探针标记物应满足的条件：理想的探针标记物应满足的条件：1)1)不会影响探针的主要理化性质；不会影响探针的主要理化性质；2)2)检测灵敏度高、特异性强、本底低、检测灵敏度高、特异性强、本底低、重复性好；重复性好；3)3)操作简便、省时经济实用：操作简便、省时经济实用：4)4)化学稳定性高、易于长期保存；化学稳定性高、易于长期保存；5)5)安全、无环境污染。安全、无环境污染。常用于分子杂交的探针标记物分常用于分子杂交的探针标记物分放射性放射性及及非放射性。非放射性。（2 2）探针标记物）探针标记物放射性标记物放射性标记物是指以放射性同位素对核苷是指以放射性同位素对核苷酸等进行标记后的产物，常见的放射性同酸等进行标记后的产物，常见的放射性同位素有位素有3232P P、3 3H H、3535S S、1414C C、125125I I等，其中以等，其中以3232P P、3 3H H、3535S S最为常用。最为常用。标记物放射性的检测主要使用标记物放射性的检测主要使用盖革计数器盖革计数器和和液体闪烁计数器液体闪烁计数器等等射线探测仪射线探测仪来完成。来完成。放射性标记物放射性标记物非放射性标记物的最大优势是非放射性标记物的最大优势是无放射性污无放射性污染，分辨力高，稳定性好，可以较长时间染，分辨力高，稳定性好，可以较长时间保存使用，保存使用，但与放射性探针相比，但与放射性探针相比，多数非多数非放射性探针的敏感性及特异性较差放射性探针的敏感性及特异性较差。目前已广泛应用的非放射性标记物有：目前已广泛应用的非放射性标记物有：生物素生物素(biotin)(biotin)标记的核苷酸、标记的核苷酸、地高辛地高辛(digoxigenin)(digoxigenin)标记的核苷酸标记的核苷酸荧光素荧光素(fluorescein)(fluorescein)标记的核苷酸标记的核苷酸非放射性标记物非放射性标记物（3）探针标记方法探针的标记有探针的标记有体内标记体内标记及及体外标记体外标记两种两种方法。方法。体内标记法体内标记法是以标记化合物作为代谢底是以标记化合物作为代谢底物，通过活体生物或活细胞的体内代谢物，通过活体生物或活细胞的体内代谢完成核酸分子标记，例如在培养基中加完成核酸分子标记，例如在培养基中加入入3 3H-H-胸苷，就可以标记到生长在该培养胸苷，就可以标记到生长在该培养基中的活细胞基中的活细胞DNADNA分子上。分子上。体内标记法受多种因素的限制，且标记体内标记法受多种因素的限制，且标记活性不高，一般很少使用。活性不高，一般很少使用。体外标记包括包括化学法化学法和和酶法酶法两种。两种。化学标记法化学标记法是利用标记物的活性基团与核酸分子中是利用标记物的活性基团与核酸分子中的某种基因的某种基因(如磷酸基团如磷酸基团)发生化学反应而直接将标发生化学反应而直接将标记物连接到探针分子上，具有简单快速、标记均匀记物连接到探针分子上，具有简单快速、标记均匀的特点，尤其适于制备的特点，尤其适于制备非放射性标记物非放射性标记物的探针。的探针。酶标记法则酶标记法则是先将标记物标记在核苷酸上，然后通是先将标记物标记在核苷酸上，然后通过酶促聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸序列过酶促聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸序列中，获得核酸探针。中，获得核酸探针。酶法应用广泛，适于制备所有酶法应用广泛，适于制备所有放射性标记探针及部分非放射性标记探针放射性标记探针及部分非放射性标记探针。常用的酶法有常用的酶法有DNADNA缺口平移标记法、缺口平移标记法、DNADNA随机引物标随机引物标记法、记法、DNADNA末端标记法末端标记法及及PCRPCR标记法标记法等。等。切口平移标记法切口平移标记法(nick thanslation labeling)(nick thanslation labeling)DNA聚合酶聚合酶该法标记模板链该法标记模板链随机引物标记法(random primed DNA labeling)Klenow片段催化片段催化该法标记模板互补链该法标记模板互补链随随机机引引物物是是含含有有各各种种可可能能排排列列的的寡寡核核苷苷酸酸片片段段的的混混合合物物。随机引物：随机引物：4 46 6使用随机引物标记的探针一般长使用随机引物标记的探针一般长400-600400-600个个核苷酸，具多种序列，但都与模板互补。核苷酸，具多种序列，但都与模板互补。与切口平移法不同的是，该方法标记的是与切口平移法不同的是，该方法标记的是模板互补链，而非模板本身。模板互补链，而非模板本身。末端标记法(DNA terminal labeling)该法标记的是线性该法标记的是线性DNADNA或或RNARNA的的5 5端或端或3 3端，属端，属非均一性标记。非均一性标记。1)31)3凸出末端的加尾标记法：凸出末端的加尾标记法：末端脱氧核苷酸转末端脱氧核苷酸转移酶将带有标记的移酶将带有标记的dGTPdGTP或或dCTPdCTP加到加到DNA3DNA3-OH-OH端端2)2)双链双链DNA3DNA3隐蔽末端的填充标记隐蔽末端的填充标记：（若反应体：（若反应体系存在全部与模板序列互补的系存在全部与模板序列互补的dNTPdNTP）以凸出序列）以凸出序列为模板，为模板，KlenowKlenow酶或酶或T4DNAT4DNA连接酶催化补平连接酶催化补平3 3末末端（若一种端（若一种dNTPdNTP带标记则成为探针）。带标记则成为探针）。3)53)5末端标记末端标记：T4T4多聚核苷酸激酶将多聚核苷酸激酶将ATPATP的标记的标记的的-磷酸基团转移到游离的磷酸基团转移到游离的5 5-OH-OH上。上。PCRPCR标记法标记法(PCR labeling)(PCR labeling)：标记的一种：标记的一种dNTP dNTP 光敏标记法光敏标记法化学衍生结合标记法化学衍生结合标记法：生物素和地高辛等非放射生物素和地高辛等非放射性标记物可以与事先经过化学修饰得到的核酸衍生物性标记物可以与事先经过化学修饰得到的核酸衍生物更加牢固地结合，进行非放射性探针的制备。常用的更加牢固地结合，进行非放射性探针的制备。常用的化学修饰反应包括磺化、转氨、溴化等反应类型化学修饰反应包括磺化、转氨、溴化等反应类型。交叉相连标记法：交叉相连标记法：利用一些高分子化合物，如利用一些高分子化合物，如细胞色素细胞色素c c、组蛋白、组蛋白H1H1及大肠杆菌单链结合蛋白质及大肠杆菌单链结合蛋白质等能与核酸结合的特性，制备相应的探针。等能与核酸结合的特性，制备相应的探针。四、DNA序列测定法（录像）DNADNA序列测定，即核酸一级结构的测定，简称序列测定，即核酸一级结构的测定，简称DNADNA测序。测序。对克隆对克隆DNADNA片段进行序列测定及分析片段进行序列测定及分析:可以直观地鉴定出重组可以直观地鉴定出重组DNADNA分子中是否含有目的基因分子中是否含有目的基因;可以获得目的基因的编码序列和基因调控序列可以获得目的基因的编码序列和基因调控序列.这对目的基因的表达及其功能研究具有重要意义。这对目的基因的表达及其功能研究具有重要意义。DNA序列分析目前用于测序的技术主要有目前用于测序的技术主要有:SangerSanger等（等（19751975）发明的）发明的双脱氧链末端终止双脱氧链末端终止法法MaxamMaxam和和GilbertGilbert（19771977）发明的）发明的化学降解法。化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生特定的碱基处终止，产生A A，T T，C C，G G四组不四组不同长度的一系列核苷酸，然后在同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的尿素变性的PAGEPAGE胶胶上电泳进行检测，从而获得上电泳进行检测，从而获得DNADNA序列。序列。目前目前SangerSanger测序法得到了广泛的应用。测序法得到了广泛的应用。1 DNA的化学降解测序法DNADNA的化学降解测序的化学降解测序法法也叫也叫Maxam-GilbertMaxam-Gilbert测序法测序法基本原理基本原理是，将待测是，将待测DNADNA分子进行末端放射性标记，分子进行末端放射性标记，然后置于然后置于4 4组独立的化学反应体系中分别进行部分组独立的化学反应体系中分别进行部分降解，其中每一组反应特异性地针对某一碱基或降解，其中每一组反应特异性地针对某一碱基或某一类碱基。通过化学降解一段时间后，在每一某一类碱基。通过化学降解一段时间后，在每一组反应体系中，生成各种不同长度的、一端为放组反应体系中，生成各种不同长度的、一端为放射性标记固定的寡聚核苷酸分子，经聚丙烯酰胺射性标记固定的寡聚核苷酸分子，经聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影检测后可以读出待测凝胶电泳和放射自显影检测后可以读出待测DNADNA分分子的碱基序列。子的碱基序列。（2）碱基切割反应体系 进行碱基特异性化学切割反应的试剂是硫酸二甲进行碱基特异性化学切割反应的试剂是硫酸二甲酯、肼（联氨）以及哌啶（六氢吡啶）。酯、肼（联氨）以及哌啶（六氢吡啶）。硫酸二甲酯硫酸二甲酯、肼（联氨）肼（联氨）碱基进行化学修饰；碱基进行化学修饰；哌啶哌啶从修饰碱基处断裂核苷酸链。从修饰碱基处断裂核苷酸链。在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同的组合能特异地切割核苷酸序列中化学试剂按不同的组合能特异地切割核苷酸序列中的特定碱基，降解待测模板的特定碱基，降解待测模板DNADNA分子。分子。硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（DMSDMS）：）：G G；pH2pH2甲酸哌啶：甲酸哌啶：G+AG+A;肼（肼（NH2NH2NH2NH2）：）：C+TC+T;肼（肼（NH2NH2NH2NH2）+高盐：高盐：C C1、待测模板、待测模板的制备的制备3、待测模板、待测模板DNA分子的分子的序列分析序列分析2、化学降解、化学降解待测模板待测模板DNA分子分子测序步骤（3 3）DNADNA序序序序列列列列的的的的读读读读取取取取是是是是逆逆逆逆电电电电泳泳泳泳方方方方向向向向进进进进行行行行的的的的DNADNA化学降解测序法不仅适于化学降解测序法不仅适于单链单链DNADNA，也适于也适于双链双链DNADNA的测序，主要用于研究的测序，主要用于研究DNADNA的一级和二级结构、的一级和二级结构、DNADNA甲基化位点测定和甲基化位点测定和DNA-DNA-蛋白质相互作用等方蛋白质相互作用等方面，结果准确可靠，是面，结果准确可靠，是DNADNA测序的基本方法之一。测序的基本方法之一。它的它的缺点是一轮反应所能测定模板缺点是一轮反应所能测定模板DNADNA长度只有长度只有250bp250bp左右，若测定大片段左右，若测定大片段DNADNA分子时，操作较为分子时，操作较为繁琐费时。繁琐费时。另外，化学降解测序法另外，化学降解测序法不能在载体上不能在载体上直接进行，直接进行，标记后的模板标记后的模板DNADNA分子难以纯化。分子难以纯化。2 DNA的双脱氧链终止测序法双脱氧链终止测序法是由双脱氧链终止测序法是由SangerSanger等在加减法等在加减法的基础上建立的一种简单快速的的基础上建立的一种简单快速的DNADNA序列分序列分析法，故也称为析法，故也称为SangerSanger测序法测序法。有时又称为。有时又称为引物合成法引物合成法，或，或酶促引物合成法酶促引物合成法，因为该法，因为该法是以待测是以待测DNADNA分子为模板，在分子为模板，在DNADNA聚合酶聚合酶的的作用下，利用适当的作用下，利用适当的DNADNA合成引物进行合成引物进行DNADNA互互补链的合成补链的合成来完成测序工作的。来完成测序工作的。基本原理基本原理：DNADNA聚合酶能够利用单链聚合酶能够利用单链DNADNA作作模板，合成出对应的模板，合成出对应的DNADNA互补链，但在反应互补链，但在反应过程中，如果过程中，如果2 2，3 3-双脱氧核糖核苷三双脱氧核糖核苷三磷酸底物磷酸底物（ddNTPddNTP）掺入到寡核苷酸链的）掺入到寡核苷酸链的3 3端，端，DNADNA链的延伸反应即被终止。链的延伸反应即被终止。ddNTPddNTP链终止核苷酸链终止核苷酸（1 1）基本原理）基本原理在在4 4个特定反应体系中个特定反应体系中分别加入一种分别加入一种ddNTPddNTP反应底反应底物（物（ddCTPddCTP、ddATPddATP、ddGTPddGTP、ddTTPddTTP）以及）以及DNADNA模板、模板、合成引物、合成引物、DNADNA聚合酶聚合酶I I、一定浓度的、一定浓度的dNTPdNTP（dCTPdCTP、dATPdATP、dGTPdGTP、dTTPdTTP，其中有一种是带，其中有一种是带3232P P放射性放射性标记的），标记的），DNADNA链的合成随机终止于某一特定链的合成随机终止于某一特定ddNTPsddNTPs。最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自。最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影技术读出待测显影技术读出待测DNADNA模板的碱基序列。模板的碱基序列。双脱氧链终止测序法的精确度较高，绝大多数以双脱氧链终止测序法的精确度较高，绝大多数以单纯测定单纯测定DNADNA序列为目的的实验室均采用此法。序列为目的的实验室均采用此法。此法读取的碱基序列是待测此法读取的碱基序列是待测DNADNA模板的互补链，而模板的互补链，而非模板链本身。非模板链本身。ddNTP（2）双脱氧核糖核苷三磷酸的作用机制 2 2，3 3-双脱氧核糖核苷三磷酸双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTPddNTP）的分子结构式与）的分子结构式与2 2-脱氧核糖核苷三磷脱氧核糖核苷三磷酸（酸（dNTPdNTP）极为相似，惟一的区别是，）极为相似，惟一的区别是，ddNTPddNTP在脱在脱氧核糖的氧核糖的3 3位置上缺少一个羟基。位置上缺少一个羟基。在在DNADNA链的合成过程中，链的合成过程中，ddNTPddNTP可以利用其可以利用其5 5-磷酸基团与磷酸基团与DNADNA链上的游离羟基基团形成磷酸链上的游离羟基基团形成磷酸二酯键而使链得以延伸，但是由于二酯键而使链得以延伸，但是由于ddNTPddNTP缺少缺少3 3-0H0H基团，不能与下一个底物分子的基团，不能与下一个底物分子的5 5-磷酸基团磷酸基团进行反应，因此新生的寡核酸链一旦加入进行反应，因此新生的寡核酸链一旦加入ddNTPddNTP，DNADNA链的合成就会终止。链的合成就会终止。（3）待测模板DNA分子的制备限制性核酸内切酶消化切割形成限制性核酸内切酶消化切割形成DNADNA小片段小片段随机地克隆到一种合