A细胞工程原生质体培养和体细胞杂交3.pptx

第六章第六章 植物原生质体培养和体细胞杂交植物原生质体培养和体细胞杂交 主要内容：主要内容：第一第一节 原生原生质体的分离和体的分离和纯化化 第二第二节 原生原生质体培养体培养 第三第三节 植物体植物体细胞胞杂交交 学学习的目的目标与要求：与要求：掌握植物掌握植物细胞原生胞原生质体培养的意体培养的意义，了解原生，了解原生质分离分离方法，原生方法，原生质纯化方法和活力化方法和活力测定方法。掌握原生定方法。掌握原生质体融体融合概念、介合概念、介绍原生原生质体融合方法，了解体融合方法，了解杂种种细胞的胞的筛选、鉴定和定和杂种植株的种植株的鉴定方法。定方法。第1页/共47页植物原生质体培养和体细胞杂交植物原生质体培养和体细胞杂交 原生原生质体的概念体的概念 植物原生植物原生质体体(protoplast):指将植物指将植物细胞壁去掉后得到胞壁去掉后得到的裸露的球形的裸露的球形细胞胞原生原生质体的特性体的特性u去壁的原生去壁的原生质体容易体容易实现外源外源遗传物物质的的导入和吸收。入和吸收。u原生原生质体具有体具有细胞全能性。胞全能性。u不同来源的原生不同来源的原生质体具有彼此融合的能力。体具有彼此融合的能力。原生原生质体培养体培养 将植物将植物细胞游离成原生胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，使体，在适宜的培养条件下，使其再生其再生细胞壁，胞壁，进行行经过培养成完成植株培养成完成植株第2页/共47页植物原生质体培养和体细胞杂交植物原生质体培养和体细胞杂交原生质体原生质体第3页/共47页植物原生质体培养和体细胞杂交植物原生质体培养和体细胞杂交原生原生质体的生物学意体的生物学意义细胞细胞原生质体原生质体酶解酶解体细胞体细胞融融 合合遗传转化遗传转化共培养共培养显微操作显微操作基因枪基因枪导导 入入原生质体培原生质体培 养养细胞细胞培养培养愈伤组织诱愈伤组织诱 导导再生植株再生植株第4页/共47页植物原生质体培养和体细胞杂交植物原生质体培养和体细胞杂交 体体细胞胞杂交交(somatic hybridization)又称又称为原生原生质体融合体融合(protoplast fusion),是指在人工控是指在人工控制条件下，不制条件下，不经过有性有性过程，两种程，两种体体细胞原生胞原生质体相互融合体相互融合产生生杂种种细胞，并胞，并使之分化再生使之分化再生,形成新物种形成新物种或新品种的技或新品种的技术。第5页/共47页植物原生质体培养和体细胞杂交植物原生质体培养和体细胞杂交植物细胞的融合过程植物细胞的融合过程第6页/共47页植物原生质体培养和体细胞杂交植物原生质体培养和体细胞杂交1978年德国科学家年德国科学家梅歇尔斯等人把马铃薯梅歇尔斯等人把马铃薯(potato)和番茄和番茄(tomato)的原生质体融合获得了的原生质体融合获得了体细胞杂种体细胞杂种“泡马豆泡马豆”（pomato)第7页/共47页一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化1.原生原生质体的分离体的分离1)材料来源材料来源植物幼嫩的叶片植物幼嫩的叶片无菌无菌实生苗的子叶和下胚生苗的子叶和下胚轴外植体来源的愈外植体来源的愈伤组织和和悬浮浮细胞系胞系花粉花粉细胞胞2)材料的材料的预处理理 用黑暗用黑暗处理、低温理、低温处理和不同光理和不同光质照射等方法，可提照射等方法，可提高某些材料原生高某些材料原生质体的体的产量和活力。量和活力。第8页/共47页一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化1.原生原生质体的分离体的分离3)酶的种的种类及及酶液配制液配制 原生原生质体分离常用的商品体分离常用的商品酶第9页/共47页一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化1.原生原生质体的分离体的分离4)分离方法分离方法原生原生质体分离的方法体分离的方法机机 械械 分分 离离 法法酶 解解 分分 离离 法法第10页/共47页一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化1.原生原生质体的分离体的分离4)分离方法分离方法第11页/共47页一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化1.原生原生质体的分离体的分离4)分离方法分离方法 机械分离法：机械分离法：先将先将细胞放在高渗糖溶液中胞放在高渗糖溶液中预处理，待理，待细胞胞发生生轻微微质壁分离，原生壁分离，原生质体收体收缩成球形后，再用机械法成球形后，再用机械法磨碎磨碎组织，从，从伤口口处可可释放出完整的原生放出完整的原生质体。体。缺点：缺点：获得完整的原生得完整的原生质体的数量比体的数量比较少，能少，能够用此法用此法产生原生生原生质体的植物种体的植物种类受到限制。受到限制。优点：点：该方法可避免方法可避免酶制制剂对原生原生质体的破坏作用。体的破坏作用。第12页/共47页一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化1.原生原生质体的分离体的分离4)分离方法分离方法 酶解分离法：解分离法：指将材料放入能降解指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗胞壁的混合等渗酶液液中保温一定中保温一定时间，在，在酶液的作用下，液的作用下，细胞壁被降解，从而胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生得大量有活力的原生质体的方法。体的方法。常用的常用的酶种种类：纤维素素酶类（纤维素素酶、半、半纤维素素酶、崩崩溃酶Driselase）、果胶）、果胶酶类（果胶（果胶酶和离析和离析酶Macerozyme）、）、蜗牛牛酶和胼胝和胼胝质酶。第13页/共47页一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化1.原生原生质体的分离体的分离4)分离方法分离方法酶解分离法解分离法优点：点：获得量大，适用广泛。得量大，适用广泛。缺点：商品缺点：商品酶制制剂均含有核酸均含有核酸酶、蛋白、蛋白酶、过氧化物氧化物酶以及酚以及酚类物物质会影响所会影响所获原生原生质体的活力体的活力第14页/共47页一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化1.原生原生质体的分离体的分离4)分离方法分离方法酶酶解解分分离离法法第15页/共47页一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化1.原生原生质体的分离体的分离4)分离方法分离方法Principle steps in enzymatic isolation第16页/共47页一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化2.原生原生质体的体的纯化化 1)过滤-离心法离心法 2)漂浮法漂浮法 3)界面法界面法第17页/共47页一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化2.原生原生质体的体的纯化化1)过滤-离心法离心法 利用比重原理，在具有一定渗透利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先的溶液中，先进行行过滤然后低速离心，使然后低速离心，使纯净完整的原生完整的原生质体沉体沉积于于试管底管底部。部。优缺点：缺点：纯化原生化原生质体比体比较简单。由于原生由于原生质体沉体沉积于于试管底部，造成相互管底部，造成相互 挤压，常，常引起原生引起原生质体的破碎。体的破碎。第18页/共47页一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化2.原生原生质体的体的纯化化2)漂浮法漂浮法 采用比原生采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗糖、体密度大的高渗溶液（蔗糖、Percoll、Ficoll），使原生），使原生质体漂浮在液体表体漂浮在液体表层的的纯化方法。化方法。优点：点：(1)可以避免分离的原生可以避免分离的原生质体因震体因震荡被被组织碎片碎片撞撞击而破而破损。(2)所用所用药品品简单，成本低。，成本低。缺点及缺点及补救措施：救措施：对离心力要求比离心力要求比较严格，掌握不好，格，掌握不好，原生原生质体体则不易漂浮。可采用不同不易漂浮。可采用不同浓度和不同离心速度和不同离心速度分次漂浮的方法。度分次漂浮的方法。飘浮法飘浮法Protoplast第19页/共47页一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化2.原生原生质体的体的纯化化3)界面法界面法 又称又称不不连续梯度法梯度法，采用两种密，采用两种密度不同的溶液形成不度不同的溶液形成不连续梯度，梯度，通通过离心使原生离心使原生质体与破体与破损细胞胞分分别处于不同液相中，从而于不同液相中，从而纯化化原生原生质体的方法。体的方法。优点：点：可以收集到数量可以收集到数量较大的大的纯净原生原生质体，同体，同时避免收集避免收集过程程中原生中原生质体因相互体因相互挤压而破碎。而破碎。第20页/共47页一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化2.原生原生质体的体的纯化化 加培养基使原加培养基使原生质体密度为生质体密度为104106/mL原生质体混合液原生质体混合液收集滤液收集滤液去上清去上清洗液重悬洗液重悬原生质体原生质体 培培 养养 基基 重悬原生质体重悬原生质体去上清去上清40-100m 过滤过滤500rpm1-5 min500rpm1-5 min重复重复3次次500rpm1-5 min去上清去上清重复重复3次次第21页/共47页一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化3.原生原生质体活力体活力测定定1)形形态识别 形形态完整、富含完整、富含细胞胞质、颜色新色新鲜的正常球的正常球形，放入低渗溶液中，可形，放入低渗溶液中，可正常膨大。正常膨大。第22页/共47页一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化3.原生原生质体活力体活力测定定2)染色法染色法荧光光显微微镜识别(FDA法法)：FDA(fluorescein diacetate)本身不本身不发荧光也不具有极性，能自由光也不具有极性，能自由穿穿过细胞胞质膜。活膜。活细胞内胞内FDA可以被可以被酯酶裂解，将能裂解，将能发荧光光的极性部分的极性部分释放出来。放出来。荧光素光素则不能自由穿越不能自由穿越质膜，在完整膜，在完整的活的活细胞内胞内积累。累。使用浓度：使用浓度：0.01%第23页/共47页一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化3.原生原生质体活力体活力测定定2)染色法染色法 酚藏花酚藏花红染色法（染色法（0.1%)：酚藏花酚藏花红能使能使无活力的原生无活力的原生质体染成体染成红色，有活力的色，有活力的原生原生质体不着色。体不着色。伊凡伊凡蓝(Evans blue)染色法染色法(0.025%)：有活力但受有活力但受损伤的的细胞和死胞和死细胞能胞能够摄取取这种染料，活种染料，活细胞不胞不摄取。取。细胞胞质环流法和氧流法和氧电极法极法第24页/共47页一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化4.影响原生影响原生质体数量和活力的因素体数量和活力的因素u供供试材料的基因型和外植体材料的基因型和外植体u酶的种的种类、浓度与度与酶解解时间u渗透渗透压稳定定剂u质膜膜稳定定剂u酶解方式解方式upHu湿度和光照湿度和光照第25页/共47页二、原生质体培养二、原生质体培养 原生原生质体培养体培养 获得有活力的原生得有活力的原生质体后，体后，应用合适的方法，在适当用合适的方法，在适当的培养条件下，可使原生的培养条件下，可使原生质体再生出新的体再生出新的细胞壁，接着胞壁，接着细胞胞进行持行持续分裂形成分裂形成细胞胞团，并培养形成愈，并培养形成愈伤组织或胚状或胚状体，分或或体，分或或发育成苗，最后形成完整的再生植株。育成苗，最后形成完整的再生植株。原生原生质体培养的意体培养的意义u建立建立单细胞无性系胞无性系u用于原生用于原生质体融合体融合u遗传转化的良好受体化的良好受体u多种基多种基础理理论研究的研究的实验材料材料第26页/共47页二、原生质体培养二、原生质体培养1.原生质体培养方法原生质体培养方法第27页/共47页二、原生质体培养二、原生质体培养1.原生原生质体培养方法体培养方法 1)液体浅液体浅层培养培养 优点：点：原生原生质体在液体体在液体环境中有境中有较强的吸收的吸收营养物养物质的能的能力，表力，表现出出较强的的细胞分裂能力。操作胞分裂能力。操作简单，对原生原生质体体的的损伤小，且易于添加新小，且易于添加新鲜培养基和培养基和转移培养物。移培养物。缺点：缺点：原生原生质体分布不均匀，常常体分布不均匀，常常发生原生生原生质体之体之间的粘的粘连现象而影响其象而影响其进一步的生一步的生长和和发育。此外，育。此外，难以跟踪以跟踪观察某一个察某一个细胞的胞的发育情况。育情况。第28页/共47页二、原生质体培养二、原生质体培养1.原生原生质体培养方法体培养方法 2)固体平板培养固体平板培养 优点：点：使原生使原生质体体处于固定位置，避免了原生于固定位置，避免了原生质体的漂浮体的漂浮游游动，有利于，有利于对单个原生个原生质体的体的细胞壁再生及胞壁再生及细胞胞团形成形成的全的全过程程进行定点行定点观察。察。缺点：缺点：培养基温度培养基温度对薄薄层质量和原生量和原生质体分布有一定影响；体分布有一定影响；另外，固体中另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂胞分裂时间会推会推迟2d左右。左右。第29页/共47页二、原生质体培养二、原生质体培养1.原生原生质体培养方法体培养方法 3)液体液体-固体双固体双层培养法培养法 优点：点：固体培养基中的固体培养基中的营养物养物质可以可以缓慢放到液体培养基慢放到液体培养基中，如果在下中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可能吸附培养物可能吸附培养物产生的一些有害物生的一些有害物质，促，促进原生原生质体的分体的分裂和裂和细胞胞团的形成。的形成。缺点：缺点：不易不易观察察细胞的胞的发育育过程程。第30页/共47页二、原生质体培养二、原生质体培养2.植株再生植株再生过程程 植株植株(原生原生质体体)再生再生过程是指分离、程是指分离、纯化的原生化的原生质体体在适当的培养方法和良好的培养条件下，很快恢复在适当的培养方法和良好的培养条件下，很快恢复细胞壁，胞壁，再生再生细胞持胞持续分裂形成分裂形成细胞胞团，最后或通，最后或通过愈愈伤组织或通或通过胚状体分化出完整植株的胚状体分化出完整植株的过程。程。u细胞壁再生胞壁再生u细胞分裂胞分裂u植株再生植株再生第31页/共47页二、原生质体培养二、原生质体培养2.植株再生植株再生过程程 细胞壁再生胞壁再生 再生所需再生所需时间与植物种与植物种类和起源和起源细胞的分化程度及生胞的分化程度及生理状理状态有关。有关。再生再生过程：先是程：先是质膜合成膜合成细胞壁主要成分微胞壁主要成分微纤维，然，然后在后在质膜表面膜表面进行聚合作用，形成多片行聚合作用，形成多片层的的结构，以后在构，以后在质膜和片膜和片层结构之构之间或在膜上或在膜上产生小生小纤维丝，逐，逐渐形成不形成不定向的定向的纤维团，最后形成完整的，最后形成完整的细胞壁。胞壁。细胞壁再生是细胞分裂的先决条件细胞壁再生是细胞分裂的先决条件第32页/共47页二、原生质体培养二、原生质体培养2.植株再生植株再生过程程 细胞分裂胞分裂 植株再生植株再生 植株再生有两种途径：植株再生有两种途径：通通过愈愈伤组织诱导器官形成途径器官形成途径 通通过诱导胚状体途径胚状体途径第33页/共47页二、原生质体培养二、原生质体培养3.影响原生影响原生质体培养的因素体培养的因素u材料材料u培养基培养基u渗透渗透压稳定定剂u原生原生质体的培养密度体的培养密度u培养条件培养条件第34页/共47页二、原生质体培养二、原生质体培养原生原生质体的分离培养与植株再生体的分离培养与植株再生(动画画)第35页/共47页二、原生质体培养二、原生质体培养4.原生原生质体培养的操作体培养的操作实例例7a:7a:分离原生质体分离原生质体1010天后第天后第1 1次分裂次分裂7b,c:27b,c:2和和3 3周龄小细胞团周龄小细胞团 7d,e:47d,e:4和和6 6周龄小愈伤组织周龄小愈伤组织 7f:7f:转到转到 B5h B5h 培养基前培养基前8 8周周龄小愈伤组织龄小愈伤组织 8a:8a:转到转到 B5H B5H 培养基上的培养基上的小愈伤组织和体细胞胚诱小愈伤组织和体细胞胚诱导导 8b:8b:转到转到 Boi2y Boi2y 培养基上培养基上的球形胚的球形胚 8c:8c:转到转到MSMS培养基上的子叶培养基上的子叶期胚以转化为小植株期胚以转化为小植株 紫花苜蓿叶片原生质体分裂、克隆体的发育紫花苜蓿叶片原生质体分裂、克隆体的发育及通过体细胞胚再生小植株及通过体细胞胚再生小植株 第36页/共47页三、植物体细胞杂交三、植物体细胞杂交原生质体的分离与培养原生质体的分离与培养(动画动画)第37页/共47页三、植物体细胞杂交三、植物体细胞杂交体体细胞胞杂交交 两种异源（种、属两种异源（种、属间）原生）原生质体，体，在人工控制条件下，相互接触从而在人工控制条件下，相互接触从而发生生膜融合，胞膜融合，胞质融合和核融合并形成融合和核融合并形成杂种种细胞的胞的过程。程。体体细胞胞杂交的意交的意义u实现远缘杂交，形成新的物种交，形成新的物种u创造造细胞胞质杂种种u培育作物新种培育作物新种质和新品种和新品种第38页/共47页三、植物体细胞杂交三、植物体细胞杂交生物种类生物种类细胞来源细胞来源成功年代成功年代烟草两个种间苷蓝青菜大豆马唐草矮牵牛龙面花大麦花生大麦大豆小麦矮牵牛油菜大豆玉米大豆大豆野豌豆大麦蚕豆大豆草香木犀酵母菌鸡大豆烟草大豆秋水仙番茄马铃薯叶叶叶根愈伤组织叶叶花瓣种子种子叶悬浮细胞叶花瓣叶悬浮细胞叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶根悬浮细胞叶原生质体血红细胞悬浮细胞叶悬浮细胞叶叶根尖1972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972第39页/共47页三、植物体细胞杂交三、植物体细胞杂交1.原生原生质体融合的体融合的类型型 1)自自发融合融合 同种同种细胞在培养胞在培养时2个靠在一起的个靠在一起的细胞自胞自发合并，称自合并，称自发融合；融合；2)诱发融合融合 指将植物原生指将植物原生质体制体制备出来后，再加入出来后，再加入诱导剂或用其或用其他方法促使两他方法促使两亲本原生本原生质体融合的方法。体融合的方法。第40页/共47页三、植物体细胞杂交三、植物体细胞杂交1.原生原生质体融合的体融合的类型型(动画画)第41页/共47页三、植物体细胞杂交三、植物体细胞杂交2.原生原生质体融合的方法体融合的方法 1)化学化学诱导融合融合 利用化学融合利用化学融合剂，促使原生，促使原生质体相互靠近、粘体相互靠近、粘连融合融合的方法。的方法。u无机无机盐诱导融合法融合法u高高pH-高高Ca2+诱导融合法融合法uPEG诱导融合法融合法uPEG-高高pH-高高Ca2+诱导融合法融合法 2)电诱导融合法融合法 利用改利用改变电场来来诱导原生原生质体彼此体彼此连接成串，再施以接成串，再施以瞬瞬间强脉冲使脉冲使质膜膜发生可逆性生可逆性电击穿而使原生穿而使原生质体融合的体融合的方法。方法。第42页/共47页三、植物体细胞杂交三、植物体细胞杂交2)电诱导融合法融合法(动画画)第43页/共47页三、植物体细胞杂交三、植物体细胞杂交3.体体细胞胞杂种的种的筛选及再生植株及再生植株鉴定定1)杂种种细胞的胞的筛选 互互补选择法法 抗性互抗性互补选择法法 营养缺陷型互养缺陷型互补选择法法 生生长互互补选择法法 细胞代胞代谢互互补选择法法 机械机械选择法法2)再生植株的再生植株的鉴定定 形形态学学鉴定、定、细胞学胞学鉴定、同工定、同工酶鉴定、分子生物学定、分子生物学鉴定定第44页/共47页三、植物体细胞杂交三、植物体细胞杂交4.体体细胞胞杂交交应用用举例例(1)(1)(2)(3)(4)(5)第45页/共47页杂杂种种植植株株融合的融合的原生质原生质体体ABAB再再生生出出细细胞胞壁壁脱脱分分化化愈愈伤伤组组织织再再分分化化植物细胞的融合植物细胞的融合植物组织培养植物组织培养植物细胞植物细胞A A原生质体原生质体B B原生质体原生质体A A杂种杂种细胞细胞ABAB去去 壁壁去去 壁壁人人工工诱诱导导方法？方法？促进融合促进融合的方法？的方法？融合完成的融合完成的标志标志植物细胞植物细胞B B三、植物体细胞杂交三、植物体细胞杂交第46页/共47页思考题思考题1、说明机械分离法和明机械分离法和酶分离法的特点分离法的特点2、原生、原生质体体纯化方法有哪些？原生化方法有哪些？原生质体活力的体活力的测定方法有哪定方法有哪些？些？3、简述原生述原生质体五种培养方法及特点体五种培养方法及特点4、原生、原生质体融合有哪几种方法？体融合有哪几种方法？第47页/共47页