DB35_T+1669-2017牛布鲁氏菌病荧光纳米颗粒试纸条制备和诊断方法-(高清版）.pdf

ICS 11.220 B 41 DB35 福建省地方标准 DB35/T 16692017 牛布鲁氏菌病荧光纳米颗粒试纸条制备和诊断方法 Preparation and diagnostic techniques for Brucellosis Bovis Using Test Strip of Luminescent Lanthanide Nanoparticles 2017-07-03 发布 2017-10-03 实施 福建省质量技术监督局 发 布 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 疫病概述.1 4 原理.2 5 仪器设备和主要试剂.2 6 操作步骤.3 附录 A（规范性附录）溶液的配制.5 附录 B（资料性附录）时间分辨荧光读数仪工作原理示意图.6 附录 C（资料性附录）牛布鲁氏菌荧光纳米颗粒试纸条检测结果示意图.7 前 言 本标准按照GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由福建出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心、深圳市易瑞生物技术有限公司、福州市疾病预防控制中心。本标准主要起草人：郑腾、张体银、唐寰宇、付辉、李文最、杨年松、朱海、王武军、张志灯、白泉阳、李宋钰。牛布鲁氏菌病荧光纳米颗粒试纸条制备和诊断方法 1 范围 本标准规定了牛布鲁氏菌病的疫病概述，牛布鲁氏菌病荧光纳米颗粒试纸条制备和诊断的原理、仪器设备和主要试剂及操作步骤。本标准适用于牛布鲁氏菌病荧光纳米颗粒试纸条的制备和诊断，也适用于牛布鲁氏菌病的快速初筛。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 66822008 分析实验室用水规格和试验方法 3 疫病概述 布鲁氏菌病，又称“波状热”、“地中海弛张热”或“马耳他热”，是由布鲁氏菌（Brucella）引起的一种人兽共患的慢性传染病。据90年代末的报告，全世界200多个国家和地区中有近170个存在人畜布鲁氏菌病，遍布世界各大洲。全世界受布鲁氏菌病威胁的人约占l/51/6，布病患者约500万600万，每年新发病人约50万。我国人畜布鲁氏菌病疫情在20世纪50年代至70年代较严重，在80年代末至90年代初曾得到较好控制，1992年发病率创中国历史最低，此后逐渐上升，发病区域不断扩大，成为严重的公共卫生问题。布鲁氏菌是一类不运动、需氧型的革兰氏阴性球杆菌或短杆菌，属于胞内寄生菌，菌体大小约（0.5 m0.7 m）（0.6 m1.5 m）。布鲁氏菌对营养要求较高，生长缓慢；在自然界广泛分布且抵抗力比较强，在土壤、水、肉和乳类食品、粪尿、动物毛皮等自然状态下可以存活数周至几个月；对光、热、多种消毒剂和抗生素类药物等很敏感，在上述条件下长则几小时、短则几分钟即可被杀死。世界卫生组织（WHO）根据主要宿主和培养特性等将布鲁氏菌属分为牛种布鲁氏菌（Br.abortus）、猪种布鲁氏菌（Br.suis）、羊种布鲁氏菌（Br.melitensis）、沙林鼠种布鲁氏菌（Br.neotomae）、绵羊种布鲁氏菌（Br.ovis）和犬种布鲁氏菌（Br.canis）共6个种。布鲁氏菌可以感染人类及多种家畜或野生动物，不同种各有不同的首选宿主；临床上以羊、牛、猪三种布鲁氏菌意义最大，其中羊种布鲁氏菌致病力最强。牛布鲁氏菌病的特点是生殖器官、胎膜及多种器官组织发炎、坏死和肉芽肿的形成，引起流产、不孕、睾丸及关节炎等症状。可见胎儿败血症变化，组织器官（子宫、乳房、胎衣、睾丸及副睾）的炎性反应（渗出、坏死、化脓或干酪化）及细胞增生形成肉芽肿（结节由上皮样细胞及巨噬细胞组成）至瘢痕化。染病的家畜和野生动物是人与动物布鲁氏菌病主要的传播源。其中牛、羊和猪是牛布鲁氏菌病的主要传播源，在人际间的传播很少发生。布鲁氏菌病可以通过空气传播或接触传播，其感染途径有呼吸道、消化道、粘膜和破损的皮肤等。健康的人或动物通常是由于直接或间接接触患病的动物及其污染物、食用或饮用各种被污染的产品或水源、吸入污染的空气等而感染布鲁氏菌病。然而，宿主感染布鲁氏菌后不一定立即表现出临床症状。布鲁氏菌可以在宿主体内潜伏数周至数年。4 原理 本标准采用基于稀土荧光纳米颗粒的荧光免疫层析技术对牛布鲁氏菌病抗体进行检测。检测时，在层析作用下，经处理后的待测牛血清由样品垫流经结合垫，从而到达层析膜。如果样品中含有目标待测物，则会与结合垫上释放的荧光纳米颗粒标记的抗原反应；当到达检测线时，目标待测物与检测线上包被的物质发生反应并被拦截在检测线上，通过激发光激发，检测线显色。反之，如果没有目标待测物，检测线则不显色。5 仪器设备和主要试剂 5.1 仪器设备 5.1.1 微量可调移液器（10 L、200 L、1 000 L）。5.1.2 恒温箱（25 1）。5.1.3 冷冻高速离心机。5.1.4 除湿机。5.1.5 切条机。5.1.6 划膜喷金机。5.1.7 冰箱（2 8）。5.1.8 时间分辨荧光读数仪。5.2 主要试剂和耗材 除另有规定外，本标准所用试剂均为分析纯或生化试剂，试验用水应符合GB/T 66822008中一级水的要求。5.2.1 水溶性量子点。5.2.2 碳二酰亚胺盐（EDC）。5.2.3 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）。5.2.4 抗原 PB26。5.2.5 甘氨酸。5.2.6 磷酸盐缓冲溶液（PBS）。5.2.7 牛血清白蛋白（BSA）。5.2.8 吐温 20（Tween-20）。5.2.9 叠氮钠（NaN3）。5.2.10 ProteinG 蛋白。5.2.11 羊抗鼠二抗。5.2.12 硝酸纤维素膜。5.2.13 玻璃纤维结合垫。5.2.14 聚氯乙烯底板（PVC 底板）。5.2.15 吸水滤纸。5.2.16 样品垫。5.2.17 牛布鲁氏菌病阳性血清和阴性血清，由指定单位提供。6 操作步骤 6.1 牛布鲁氏菌病荧光纳米颗粒试纸条的制备 6.1.1 荧光纳米颗粒的制备 6.1.1.1 用 0.01 mol/L PBS（pH7.6）（配制方法见附录 A 中 A.1）溶解水溶性量子点，取溶解后的 10 mg/mL 水溶性量子点 300 L 加入 200 L 的 60 mg/mL EDC 溶液（配制方法见附录 A 中 A.2），振荡混匀。6.1.1.2 再加入 1 mL 的 0.2 mg/mL NHS 溶液（配制方法见附录 A 中 A.3），混匀。25 1 下温和搅拌，反应 60 min。6.1.1.3 在搅拌条件下，缓慢加入 1 mL 用 0.01 mol/L PBS（pH7.6）溶解的 ProteinG 蛋白（2 mg/mL）。25 1 下温和搅拌，反应 60 min。6.1.1.4 再加入 100 L 的 0.2 mol/L 甘氨酸（配制方法见附录 A 中 A.4），25 1 下温和搅拌，反应 5 min 后终止反应。6.1.1.5 将以上 6.1.1.4 中的溶液在 4 下，14 000 r/min 离心 15 min，弃去上清液，收集荧光纳米颗粒。6.1.1.6 在荧光纳米颗粒中加入 5 mL 的 0.01 mol/L PBS（pH7.6），重悬荧光纳米颗粒（必要时，可以在超声条件下重悬），在 4 下 14 000 r/min 离心 15 min，弃去上清液，收集荧光纳米颗粒。6.1.1.7 重复 6.1.1.6 中的步骤 2 次，最后用 3 mL 重悬液（配制方法见附录 A 中 A.5）重悬荧光纳米颗粒。6.1.2 样品垫的处理 将样品垫放入处理液（配制方法见附录A中A.6）中完全浸湿，取出后，在25 5 和相对湿度小于40%的条件下，干燥样品垫，干燥时间超过24 h后，密封保存备用。6.1.3 玻璃纤维结合垫的处理 取6.1.1.7中制备的荧光纳米颗粒重悬液100 L用重悬液稀释20倍。每一条结合垫用1 mL以上稀释过的荧光纳米颗粒重悬液均匀铺满。在25 5 和相对湿度小于40%的条件下干燥样品垫，干燥时间超过24 h后，密封保存备用。6.1.4 硝酸纤维素膜的划线 6.1.4.1 用抗原 PB26 划检测线（T 线），条件为：用含有 0.5%BSA（w/v）的 0.01 mol/L PBS（pH7.6）配制浓度为 2 mg/mL 的抗原划线，划线量为 1 L/cm。6.1.4.2 用羊抗鼠二抗（3 mg/mL）划质控线（C 线），条件为：用含有 0.5%BSA（w/v）的 0.01 mol/L PBS（pH7.6）配制浓度为 0.5 mg/mL 的抗体划线，划线量为 1 L/cm。6.1.5 硝酸纤维素膜的干燥 25 5 和相对湿度小于40%的条件下，干燥硝酸纤维素膜至少24 h。6.1.6 试纸条装配 在相对湿度35%45%和温度18 30 的条件下，将硝酸纤维素膜贴在PVC底板上。将吸水滤纸，齐纸板顶端贴在PVC底板上。将玻璃纤维素结合垫齐边贴在底板上，确保结合垫均有搭到硝酸纤维素膜。最后齐底板边缘贴好样品垫，确保样品垫均有搭到结合垫。检查贴好的大板，裁去任何有缺陷的部位。用切条机将贴好的大板裁切成所需4.0 mm的宽度。需要时可以将试纸条装入卡扣中。6.2 牛布鲁氏菌病荧光纳米颗粒试纸条的检测 6.2.1 牛血清样品的采集和制备 无菌采集3 mL牛血，静置等待其凝固分层，也可使用促凝管以便于尽快析出牛血清。如果有轻微溶血，可以采用3 000 r/min离心5 min进行处理。取20 L清亮的待检牛血清加120 L稀释液（配制方法见附录A中A.7），混匀。阳性对照血清和阴性对照血清也要各取20 L加120 L稀释液，混匀。剩余的牛血清样品可以保存在2 8 的冰箱中备用，但不能超过一周。6.2.2 牛布鲁氏菌病抗体检测 取6.2.1中经稀释的待检牛血清、阳性对照血清和阴性对照血清各100 L滴加到检测卡的样品垫或样品孔中，水平放置，15 30 条件下反应15 min。随后，在波长为365 nm的紫外灯下进行观察，也可使用时间分辨荧光读数仪判读结果。时间分辨荧光读数仪工作原理参见附录B。6.2.3 检测结果的判定 6.2.3.1 阳性对照血清检测线出现橙红色条带，而阴性对照血清检测线没有条带，且两者的质控线均出现橙红色条带，说明该批试纸条有效；否则说明该批试纸条已失效。6.2.3.2 待检牛血清的质控线和检测线均出现橙红色条带，判为阳性；质控线出现橙红色条带，而检测线没有出现橙红色条带，判为阴性；若质控线没有出现橙红色条带，则结果无效，需要重新检测。365 nm 紫外灯下牛布鲁氏菌病荧光纳米颗粒试纸条检测结果的示意图参见附录 C。A A 附 录 A（规范性附录）溶液的配制 A.1 0.01 mol/L PBS（pH7.6）的配制 分别称取6.23 g的Na2HPO4 12H2O、0.41 g的NaH2PO4 2H2O和18 g的NaCl，溶解于2 000 mL的水中即可。A.2 60 mg/mL EDC溶液的配制 称取6.0 g的EDC，溶解在100 mL的水中即可。A.3 0.2 mg/mL NHS溶液的配制 称取0.02 g的NHS，溶解在100 mL的水中即可。A.4 0.2 mol/L甘氨酸溶液的配制 称取1.50 g的甘氨酸（C2H5NO2），溶解在100 mL的水中即可。A.5 重悬液的配制 称取1.0 g的BSA、0.20g的Tween-20，0.050 g的NaN3，溶解在200 mL的0.01 mol/L PBS（pH7.6）中，即为重悬液。A.6 处理液的配制 称取1.0 g的Tween-20，溶解在200 mL的0.01 mol/L PBS（pH7.6）中，即为处理液。A.7 样品稀释液的配制 称取12.10 g三羟甲基氨基甲烷（pH8.0）、20.0 g蔗糖和5.0 g的Tween-20，加水定容至1 L，即为样品稀释液。B B 附 录 B（资料性附录）时间分辨荧光读数仪工作原理示意图 时间分辨荧光读数仪工作原理见图B.1。图B.1 时间分辨荧光读数仪工作原理 C C 附 录 C（资料性附录）牛布鲁氏菌荧光纳米颗粒试纸条检测结果示意图 365 nm紫外灯下牛布鲁氏菌荧光纳米颗粒试纸条检测结果见图C.1。图C.1 365 nm 紫外灯下牛布鲁氏菌荧光纳米颗粒试纸条检测结果 _ DB35/T 16722017 福建省地方标准 蜜蜂微孢子虫病诊断方法 DB35/T 16722017*2017 年 8 月第一版 2017 年 8 月第一次印刷