DNA测序化学降解法省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

DNA序列测定序列测定第1页脱氧核糖含氮碱基磷酸A G C TDNADNA基本单位基本单位脱氧核苷酸脱氧核苷酸腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶胸腺嘧啶第2页 DNA测序：测定未知序列确定重组DNA方向与结构对突变进行定位和判定比较研究第3页成熟DNA测序技术始于20世纪70年代中期。1977年Maxam 和Gilbert报道了经过化学降解测定DNA序列方法。同一时期,Sanger创造了双脱氧链终止法 20世纪90年代初出现荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序时代。这些技术统称为第一代这些技术统称为第一代DNADNA测序技术。测序技术。第4页第二代测序技术第二代测序技术GSFLX测序技术（罗氏454公司）solexa测序技术（Illumina公司）SOLiD测序技术（ABI公司）第5页三种第二代测序技术对比三种第二代测序技术对比测序技术454454SolexaSolexaSOLiDSOLiD上市时间价格（万美元，）504559单次反应数据量0.42050读长（bp）40050*250优势长读长低测序成本，高性价比高通量，高准确度第6页第三代测序技术第三代测序技术第二代测序技术在制备测序文库时候都需要经过PCR扩增，而这一PCR过程可能引入突变或者改变样品中核酸分子百分比关系。另外，第二代测序读长普遍偏短，在进行数据拼接时会碰到麻烦。为了克服这么缺点，业界发展出了以单分子实时测序和纳米孔为标志第三代测序技术。Heliscope单分子测序仪SMRT技术纳米孔单分子技术第7页Maxam-Gilbert DNA 化学降解法化学降解法基本原理：直接或间接特异性识别4种碱基特定化学试剂可对碱基进行特异性修饰在修饰碱基处(5或3)打断磷酸二酯键将一个 DNA 片段 5 端磷酸基作放射性标识，再分别采取不一样化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而 5 端被标识 DNA 片段，这些以特定碱基结尾片段群经过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目标 DNA 碱基序列。操作步骤将双链DNA样品变为单链每个单链同一方向末端都用放射性同位素标识,方便显示DNA条带分别用不一样方法处理,取得只差一个核苷酸降解DNA群体电泳,读取DNA核苷酸次序第8页第9页先用限制性内切酶把DNA切成10200bp测序材料；用碱性磷酸化酶处理该片段，消除5末端上磷酸；在5OH端标识32P，用多核苷酸磷酸激酶催化；标识片段变性为单链；用特异化学试剂作用于不一样碱基进行修饰，然后用哌啶甲酸切断反应碱基多核苷酸链，紧接着用四组不一样特异反应能够使末端标识DNA分子切成不一样长度片段，产生一组其末端都是该特异碱基长度不等DNA片段；经电泳和放射性自显影后，从4个反应系统统一阅读，待测DNA全部核苷酸序列就可直接读出第10页该反应关键在于使该反应关键在于使DNA4种核苷酸中，只有种核苷酸中，只有1-2种发生特异性种发生特异性化学切割反应：化学切割反应：碱基特异性修饰；修饰碱基从核糖环上转移；失去碱基糖环部位发生DNA链断裂。专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键化学试剂有硫酸二甲酯（dimethylsulphate)和肼(hydrazine)、哌啶甲酸等。第11页 肼，又称联氨 NH2.NH2 在碱性环境中作用于胞嘧啶C和胸腺嘧啶TC4和C6位置造成糖苷键断裂。假如加入高浓度盐（1.5M NaCl），肼则主要作用于胞嘧啶C使之断裂。在高温强碱作用(90,1.2M NaOH)下可使腺嘌呤A位点发生猛烈断裂反应,但对胞嘧啶C反应较弱哌啶甲酸(90,1mol/L)在修饰位点两端使DNA糖-磷酸链断裂胞嘧啶胸腺嘧啶第12页硫酸二甲酯dimethylsulphate，DMS，（CH3O）2SO2：一个碱性化学试剂，能够使DNA链上腺嘌呤AN2和鸟嘌呤GN甲基化，不过鸟嘌呤GN甲基化速度比腺嘌呤AN2甲基化速度要快4-10倍，而且在中性pH环境中，DMS主要作用于鸟嘌呤G，使之甲基化，造成糖苷键断裂。热哌啶：使DNA链上嘌呤在酸作用下发生糖苷水解，造成DNA链在脱嘌呤位点（G和A）发生断裂。第13页DNA化学降解反应体系化学降解反应体系反应体系反应体系 碱基修饰试剂碱基修饰试剂 碱基修饰反应碱基修饰反应 主链断裂试剂主链断裂试剂 断裂点断裂点G 硫酸二甲酯硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶六氢吡啶 GG+A 甲酸甲酸 脱嘌呤作用脱嘌呤作用 六氢吡啶六氢吡啶 G和和AC+T 肼肼 嘧啶开环嘧啶开环 六氢吡啶六氢吡啶 C和和TC 肼（加盐）肼（加盐）胞嘧啶开环胞嘧啶开环 六氢吡啶六氢吡啶 C DMS（硫酸二甲酯）在（硫酸二甲酯）在中性中性pH环境，环境，主要主要作用于作用于G，被六氢吡啶作用而造成该，被六氢吡啶作用而造成该位点上位点上DNA链断裂。链断裂。甲酸甲酸含有脱嘌呤作用。含有脱嘌呤作用。DNA链在脱嘌呤位点链在脱嘌呤位点(G和和A)发生断裂。发生断裂。肼肼，在，在碱性条件下，作用于碱性条件下，作用于T胸腺嘧啶和胸腺嘧啶和C胞嘧啶胞嘧啶，在含有六氢吡啶条件下，造，在含有六氢吡啶条件下，造成在这个核苷酸位置上发生成在这个核苷酸位置上发生DNA链断裂。假如在反应体系中加入链断裂。假如在反应体系中加入高浓度盐高浓度盐，同，同胸腺嘧啶反应速率便会下降，主要作用于胸腺嘧啶反应速率便会下降，主要作用于C胞嘧啶胞嘧啶。AC肼肼 90C,NaOH(1.2M)断裂反应第14页 在在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA机制机制是：是：G+A反应反应-（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，减（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，减弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸糖苷键，然弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。后哌啶置换了嘌呤。G反应反应-硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（DMS）使）使GN7甲基化，其后断开甲基化，其后断开了了C8-C9间化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖结合。间化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖结合。T+C反应反应-肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。C反应反应-在在NaCl存在时，只有存在时，只有C才能与肼发生反应，随即，才能与肼发生反应，随即，被修饰胞嘧啶被哌啶置换。被修饰胞嘧啶被哌啶置换。第15页 在在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA机制是：机制是：G+A反应反应-（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，减弱了嘌呤脱（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，减弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。G反应反应-硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（DMS）使）使GN7甲基化，其后断开了甲基化，其后断开了C8-C9间间化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖结合。化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖结合。T+C反应反应-肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。C反应反应-在在NaCl存在时，只有存在时，只有C才能与肼发生反应，随即，被修饰才能与肼发生反应，随即，被修饰胞嘧啶被哌啶置换。胞嘧啶被哌啶置换。第16页第17页哌啶第18页5 GATCACTACTG 3 标识标识5*GATCACTACTG 3 G：DMSC：肼（加盐）：肼（加盐）G+A：甲酸：甲酸C+T：肼：肼5-*GATCACTACTG 5-*G G5-*GATCACTACTG 5-*GATCACTA 5-*GATCA5-*GA 5-*G 5-*GATCACTAC 5-*GATCACT 5-*GATCAC5-*GATC 5-*GAT 5-*GATCACTACT 5-*GATCACTACTG-5-*GATCACTAC 5-*GATCAC5-*GATC-*GATCACTACTG-第19页在在化化学学修修饰饰反反应应过过程程中中，经经过过控控制制反反应应温温度度和和反反应应时时间间，只只有有一一小小部部分分碱碱基基被被修修饰饰(而而不不是是全全部部被被修修饰饰)，随随即即进进行行断断裂裂反反应应也也是是定定量量反反应应。所所以以，DNA链链并并不不是是在在全全部部可可被被修修饰饰碱碱基基位位点点断断裂裂，而而是是随随机机断断裂裂。在在4个个反反应应中中，产产生生4套套带带相相同同标标识识末末端端、长长短短不不一一寡寡聚聚核核苷苷酸酸片片段段。只只有有带带标标识识末末端端片片段段可可被被识识别别，没没有有标标识识末末端端片片段段能能够够忽忽略不计。略不计。第20页、在在化化学学修修饰饰反反应应过过程程中中，经经过过控控制制反反应应温温度度和和反反应应时时间间，只只有有一一小小部部分分碱碱基基被被修修饰饰(而而不不是是全全部部被被修修饰饰)，随随即即进进行行断断裂裂反反应应也也是是定定量量反反应应。所所以以，DNA链链并并不不是是在在全全部部可可被被修修饰饰碱碱基基位位点点断断裂裂，而而是是随随机机断断裂裂。在在4个个反反应应中中，产产生生4套套带带相相同同标标识识末末端端、长长短短不不一一寡寡聚聚核核苷苷酸酸片片段段。只只有带标识末端片段可被识别有带标识末端片段可被识别，没有标识末端片段能够忽略不计。，没有标识末端片段能够忽略不计。第21页第22页电泳和读谱电泳和读谱详细测定过程中，首先将3端或5端双链DNA溶解在总体积为50L、分别含有0.03mol/LNaOH、10%甘油、1mmol/LEDTA、0.05%二甲苯蓝和0.05%溴甲酚蓝溶液中，使双链DNA变性。然后加到由5%10%丙烯酰胺、0.16%0.33%双丙烯酰胺、50mmol/LTris-硼酸、pH8.31mmol/LEDTA组成凝胶板上，进行电泳和放射性自显影等处理，制得一端带标识单链DNA。第23页电泳检测电泳检测-310第24页步骤：毛细管灌胶第25页步骤：样品盘移动第26页步骤：电进样及电泳第27页步骤：荧光激发及检测第28页化学法读序方法化学法读序方法 化学法测序放射自显影图谱识读，比较复杂一些，这是因为化学裂解化学法测序放射自显影图谱识读，比较复杂一些，这是因为化学裂解反应并不完全是碱基特异性，每组测序图谱为反应并不完全是碱基特异性，每组测序图谱为4或或5条垂直阶梯带，条垂直阶梯带，AC反反应能够不做。该片从胶底部一个个向顶部读，应能够不做。该片从胶底部一个个向顶部读，G+A和和C+T两列中含有全部两列中含有全部相差一个碱基相差一个碱基DNA片段。片段。假如假如G+A中出现中出现1条带就看条带就看G列中是否有一样大列中是否有一样大小带，若有即为小带，若有即为G碱基，无则为碱基，无则为A碱基；同理，碱基；同理，C+T中则检验中则检验C列中有没有列中有没有一样大小条带，有即为一样大小条带，有即为C，无则为，无则为T。在做了在做了AC反应时，出现较深带时，反应时，出现较深带时，能够帮助确定为能够帮助确定为A碱基。化学法必须碱基。化学法必须4或或5个反应管统一阅读，个反应管统一阅读，DNA中中4个个碱基每个位置都有碱基每个位置都有1个对应片段，待测个对应片段，待测DNA全部序列可直接读出。全部序列可直接读出。化学法测序采取化学法测序采取32P标识标识DNA进行，条带会较末端法更含糊，更宽，进行，条带会较末端法更含糊，更宽，因为分辨率不足，从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为因为分辨率不足，从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为200-300bp以内。以内。第29页聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳将泳将DNADNA链按长短链按长短分开分开,依据放射自依据放射自显影显示区带，直显影显示区带，直接读出接读出DNADNA核苷酸核苷酸序列。序列。假如假如G+A中出现中出现1条带就看条带就看G列中是列中是否有一样大小带，否有一样大小带，若有即为若有即为G碱基，碱基，无则为无则为A碱基；同碱基；同理，理，C+T中则检验中则检验C列中有没有一样列中有没有一样大小条带，有即为大小条带，有即为C，无则为，无则为T。第30页在做了在做了AC反应反应时，出现时，出现较深带时，较深带时，能够帮助能够帮助确定为确定为A碱基。碱基。第31页DNA序列测定应用序列测定应用1)测序测序 PCR克隆测序验证突变体检测新基因测序全基因组测序系统发育及物种判定2)2)片段分离片段分离个体识别：亲缘判定 SNP关联分析疾病诊疗等第32页Maxam-Gilbert化学降解法测序长度约250bp优点：不需要进行酶催化反应，所以不会产生因为酶催化反应而带来误差；对未经克隆DNA片段能够直接测序；化学降解测序法尤其适合用于测定含有如5-甲基腺嘌呤A或者G，C含量较高DNA片段，以及短链寡核苷酸片段序列。化学降解测序法既能够标识5-末端，也能够标识3-末端。假如从两端分别测定同一条DNA链核苷酸序列，相互参考测定结果，能够得到准确DNA链序列。第33页没有改进,操作繁琐,化学试剂毒性大,放射性同位素标识效率偏低以致需要较长放射自显影曝光时间,人工读取数据费时费劲.当前,仅在分析特殊DNA链核苷酸序列和分析DNA和蛋白质相互作用中DNA一级结构时才使用缺点：缺点：第34页第35页