分子生物学技术市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx

第十三章分子生物学技术第一节、重组第一节、重组DNADNA技术技术-基因工程基因工程 第二节、分子杂交及相关技术第二节、分子杂交及相关技术第三节、聚合酶链反应原理和应用第三节、聚合酶链反应原理和应用第四节、基因定位惯用方法第四节、基因定位惯用方法1 1第1页分子生物学技术l l7070年代以来年代以来,分子生物学技术快速发展起分子生物学技术快速发展起来来,使人们有可能进行人类基因组及单个使人们有可能进行人类基因组及单个基因结构研究基因结构研究,分析其功效特征分析其功效特征,了解其改了解其改变规律。分子生物学技术为揭示人类遗传变规律。分子生物学技术为揭示人类遗传病本质起着主要作用。下面就一些分子生病本质起着主要作用。下面就一些分子生物学技术给予介绍。物学技术给予介绍。2 2第2页1946 1950 1955 1960 19651970 1975 1980 1985 1990 1995 1944DNA是遗传物质1949Hbs贫血1953双螺旋1956HbsGlu-Val1966遗传密码第一个R酶1972重组质粒1975DNA杂交1977DNA测序1981转G小鼠1983HD病G定位1985PCR1986位置克隆1987G剔除小鼠1989位置克隆1990第一个基因治疗1995细菌G组序列1996酵母基因组序列当代分子遗传学发展当代分子遗传学发展主要事件主要事件3 3第3页第一节第一节 重组重组DNADNA技术技术-基因工程基因工程l l重组重组DNADNA技术是当代分子生物技术发展中最主技术是当代分子生物技术发展中最主要成就之一。即是基因工程要成就之一。即是基因工程(Gene(Gene Engineering)Engineering)关键技术。关键技术。l l重组重组DNADNA技术（技术（Recombinant DNA Recombinant DNA TechniqueTechnique）是人类依据需要选择目标基因是人类依据需要选择目标基因（DNADNA片段）在体外与基因运载体重组，转移片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以到达改良和创造至另一细胞或生物体内，以到达改良和创造新物种和治疗人类疾病目标。新物种和治疗人类疾病目标。l l这一技术发展和应用，关键在于限制酶发觉这一技术发展和应用，关键在于限制酶发觉和应用。和应用。4 4第4页 一、限制酶一、限制酶 l l限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶(restrictive(restrictive endonucleases)endonucleases)，又称限制酶。是特异性地，又称限制酶。是特异性地切断切断DNADNA链中磷酸二酯键核酸酶（链中磷酸二酯键核酸酶（“分子手术分子手术刀刀”）。）。l l发觉于原核生物体内，现已分离出发觉于原核生物体内，现已分离出100100各种，各种，几乎全部原核生物都含有这种酶。是重组几乎全部原核生物都含有这种酶。是重组DNADNA技术和基因诊疗中主要一类工具酶。技术和基因诊疗中主要一类工具酶。5 5第5页1 1、限制酶命名、限制酶命名 l l依据其起源命名。如：依据其起源命名。如：属名属名 菌株名菌株名EcoRI种名种名 编号编号l lEcoRIEcoRI起源于大肠杆菌起源于大肠杆菌E.coliRY13E.coliRY13菌株菌株,I,I指指在该菌株中分离第一个限制酶。在该菌株中分离第一个限制酶。6 6第6页2 2、限制酶识别序列和切割形成、限制酶识别序列和切割形成 l l 每种限制酶能识别和切割通常每种限制酶能识别和切割通常每种限制酶能识别和切割通常每种限制酶能识别和切割通常4 4 4 48 8 8 8个核苷酸序列，个核苷酸序列，个核苷酸序列，个核苷酸序列，称为限制性位点或切点。称为限制性位点或切点。称为限制性位点或切点。称为限制性位点或切点。如：如：如：如：Hare 5-GGCC-3Hare 5-GGCC-3Hare 5-GGCC-3Hare 5-GGCC-3 Bam HI 5-GGATCC-3Bam HI 5-GGATCC-3Bam HI 5-GGATCC-3Bam HI 5-GGATCC-3平末端平末端平末端平末端(blunt end)(blunt end)(blunt end)(blunt end)对称轴切，连接效果差对称轴切，连接效果差对称轴切，连接效果差对称轴切，连接效果差 切割形成切割形成切割形成切割形成 粘性末端（粘性末端（粘性末端（粘性末端（sticky endsticky endsticky endsticky end）交织切。）交织切。）交织切。）交织切。7 7第7页8 8第8页部分惯用限制酶及切点9 9第9页互补末端连接1010第10页产生相同序列突出末端不一样片段产生相同序列突出末端不一样片段可有三种方式：可有三种方式：l l1)1)用同一个限制酶切割；用同一个限制酶切割；l l2)2)用识别相同靶序列不一样限制酶切割；用识别相同靶序列不一样限制酶切割；l l3)3)用识别不一样靶序列但可产生一致粘用识别不一样靶序列但可产生一致粘性末端限制酶切割。性末端限制酶切割。1111第11页3 3、特点：、特点：l l依据上述限制酶特点，在基因工程和基因诊疗中依据上述限制酶特点，在基因工程和基因诊疗中依据上述限制酶特点，在基因工程和基因诊疗中依据上述限制酶特点，在基因工程和基因诊疗中主要用途：主要用途：主要用途：主要用途：l l1)1)1)1)不论不论不论不论DNADNADNADNA起源怎样，同一个限制酶切割后产生起源怎样，同一个限制酶切割后产生起源怎样，同一个限制酶切割后产生起源怎样，同一个限制酶切割后产生粘性末端轻易重新连接。所以可将不一样种属粘性末端轻易重新连接。所以可将不一样种属粘性末端轻易重新连接。所以可将不一样种属粘性末端轻易重新连接。所以可将不一样种属DNADNADNADNA重组。如人和质粒重组。如人和质粒重组。如人和质粒重组。如人和质粒DNADNADNADNA等。等。等。等。l l2)2)2)2)用于人类基因组用于人类基因组用于人类基因组用于人类基因组DNADNADNADNA分析，具特定酶切位点。分析，具特定酶切位点。分析，具特定酶切位点。分析，具特定酶切位点。l l3)Gene3)Gene3)Gene3)Gene突变改变酶切位点消失或新产生将改变酶突变改变酶切位点消失或新产生将改变酶突变改变酶切位点消失或新产生将改变酶突变改变酶切位点消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。1212第12页二、基因运载体及其选择二、基因运载体及其选择 l l载体（载体（VectorVector）:将外源目标将外源目标DNADNA导入受体细导入受体细胞，并能自我复制和增殖工具。胞，并能自我复制和增殖工具。1313第13页l l载体具以下特征载体具以下特征：l l1)1)分子量小，便于携带较大分子量小，便于携带较大DNADNA片段，能进入片段，能进入宿主细胞并在其中增殖；宿主细胞并在其中增殖；l l2)2)有各种限制酶切点，每种限制酶最好只有有各种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点；单一切点；l l3)3)被切割后载体，插入外源被切割后载体，插入外源DNADNA后，不影响其后，不影响其复制能力，并有可选择标识基因（如，抗药复制能力，并有可选择标识基因（如，抗药基因）。基因）。l l惯用载体有惯用载体有：质粒，：质粒，噬菌体，粘粒，噬菌体，粘粒，BACBAC，YACYAC，PIPI等。等。1414第14页（一）（一）.质粒质粒plasmidplasmid Plasmid Plasmid Plasmid Plasmid 独立于细菌染色体外双链环独立于细菌染色体外双链环独立于细菌染色体外双链环独立于细菌染色体外双链环DNADNADNADNA分子。分子。分子。分子。PBR322PBR322PBR322PBR322大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌 pSC101 pSC101 pSC101 pSC101PlasmidchromosomePlasmidchromosome COIEICOIEICOIEICOIEIplasmidplasmid革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌 pc194pc194pc194pc194scp12scp12scp12scp12 真核生物真核生物真核生物真核生物-酵母质粒酵母质粒酵母质粒酵母质粒 1515第15页惯用质粒如惯用质粒如惯用质粒如惯用质粒如pUC19pUC19pUC19pUC19，多连接子，多连接子，多连接子，多连接子MCSMCSMCSMCS。插入外源基因片段长度约。插入外源基因片段长度约。插入外源基因片段长度约。插入外源基因片段长度约10kb10kb10kb10kb。将外源基因插入到。将外源基因插入到。将外源基因插入到。将外源基因插入到MCSMCSMCSMCS中，随质粒表示而表示，增殖中，随质粒表示而表示，增殖中，随质粒表示而表示，增殖中，随质粒表示而表示，增殖而扩增。外源基因插入到而扩增。外源基因插入到而扩增。外源基因插入到而扩增。外源基因插入到MCSMCSMCSMCS后，后，后，后，-半乳糖苷酶活性丧失而半乳糖苷酶活性丧失而半乳糖苷酶活性丧失而半乳糖苷酶活性丧失而不显兰色不显兰色不显兰色不显兰色-白色菌落。假如不插入外源基因，则产生兰色。白色菌落。假如不插入外源基因，则产生兰色。白色菌落。假如不插入外源基因，则产生兰色。白色菌落。假如不插入外源基因，则产生兰色。从而筛选阳性菌落。从而筛选阳性菌落。从而筛选阳性菌落。从而筛选阳性菌落。EcoRIHindIIIOriOri复制起复制起点点LacZAPRpUC191616第16页（二）（二）.-.-噬菌体噬菌体(phage)(phage)l l是一个可在体外包装细菌病毒是一个可在体外包装细菌病毒,可高效感染大可高效感染大肠杆菌肠杆菌.-.-噬菌体噬菌体DNADNA是线状双链是线状双链DNADNA分子分子,全全长约长约50kb,50kb,每条链各带每条链各带12bp12bp长单链互补末端长单链互补末端-粘末端粘末端(COS(COS序列序列)。进入宿主细胞后很快，。进入宿主细胞后很快，COSCOS序列碱基配对环化。序列碱基配对环化。l l改建后改建后噬菌体发展了各种较大型克隆载体，噬菌体发展了各种较大型克隆载体，如：如：1717第17页l l1 1、置换、置换载体载体 溶解路径溶解路径 载体和外源载体和外源DNADNA整合到宿主菌整合到宿主菌DNADNA中。中。可克隆可克隆23kb23kb外源外源DNADNA。l l2 2、插入、插入载体载体 裂解路径裂解路径 DNA DNA在宿主细胞中复制，然后包装成在宿主细胞中复制，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可克隆克隆5kbcDNA5kbcDNA。1818第18页裂裂解解路路径径1919第19页（三）三）.粘粒粘粒(cosmid vector)(cosmid vector)（303040kb40kb）是将质粒和是将质粒和噬菌体改建一个载体噬菌体改建一个载体.它含它含COSCOS序列序列,插入一小插入一小plasmid plasmid 而得名而得名CosmidCosmid。改建后粘粒含有。改建后粘粒含有噬菌体复制起噬菌体复制起点和点和cos cos 末端。全长末端。全长8kb8kb。大片段外源。大片段外源DNADNA插入后，在体外包装进而被克隆。可包装插入后，在体外包装进而被克隆。可包装303045kb45kb长长DNADNA片段，多用于基因文库构片段，多用于基因文库构建。建。2020第20页(四四)大片段大片段DNADNA克隆载体克隆载体 l l人类和哺乳动物基因组很大，甚至人类和哺乳动物基因组很大，甚至许多单个基因也相当大（如：许多单个基因也相当大（如：DMD DMD gene 2300kbgene 2300kb），克隆分析就需要，克隆分析就需要更大基因载体。如近年来构建一些更大基因载体。如近年来构建一些载体：载体：BACBAC，PIPI，YACYAC等。等。2121第21页1 1 1 1、细菌人工染色体（、细菌人工染色体（、细菌人工染色体（、细菌人工染色体（bacterial artificial bacterial artificial bacterial artificial bacterial artificial chromosome,BACchromosome,BACchromosome,BACchromosome,BAC）l l优点：能携带大片段优点：能携带大片段优点：能携带大片段优点：能携带大片段DNADNADNADNA，约约约约300kb300kb300kb300kb。在每个细胞中，一个载在每个细胞中，一个载在每个细胞中，一个载在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，体分子能繁殖多个拷贝，体分子能繁殖多个拷贝，体分子能繁殖多个拷贝，高产高产高产高产DNADNADNADNA。l l缺点：会出现插入片段在缺点：会出现插入片段在缺点：会出现插入片段在缺点：会出现插入片段在结构上不稳定，造成克隆结构上不稳定，造成克隆结构上不稳定，造成克隆结构上不稳定，造成克隆DNADNADNADNA部分缺失或重排。为克部分缺失或重排。为克部分缺失或重排。为克部分缺失或重排。为克服上述缺点，人们采取低服上述缺点，人们采取低服上述缺点，人们采取低服上述缺点，人们采取低拷贝数复制子载体，如，拷贝数复制子载体，如，拷贝数复制子载体，如，拷贝数复制子载体，如，E E E E colicolicolicoli中中中中F F F F因子。此质粒含有因子。此质粒含有因子。此质粒含有因子。此质粒含有2 2 2 2种基因（种基因（种基因（种基因（part A,part part A,part part A,part part A,part B B B B）。每个）。每个）。每个）。每个E coliE coliE coliE coli能接收能接收能接收能接收 300kbDNA300kbDNA300kbDNA300kbDNA片段。片段。片段。片段。2222第22页2 2、噬菌体、噬菌体PIPI载体和载体和PACPAC l lPIPI噬菌体与噬菌体与噬菌体一样，外有蛋白质噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含相当大（壳。内含相当大（110110115kb115kb）线性）线性DNADNA，并在体外包装于，并在体外包装于PIPI壳内。壳内。PIPI进入进入宿主细胞后环化，扩增。宿主细胞后环化，扩增。l l19941994年，有些人将年，有些人将PIPI和和F F因子克隆结合因子克隆结合产生产生PIPI人工染色体克隆系统人工染色体克隆系统-PAC-PAC。2323第23页3 3 3 3、酵母人工染色体（、酵母人工染色体（、酵母人工染色体（、酵母人工染色体（yeast artificial yeast artificial yeast artificial yeast artificial chromosome,YACchromosome,YACchromosome,YACchromosome,YAC）l l适合适合适合适合用于用于用于用于克隆克隆克隆克隆大片大片大片大片段段段段DNADNADNADNA，0.20.20.20.22Mb2Mb2Mb2Mb。2424第24页YAC YAC 主要功效成份有三：主要功效成份有三：l l1 1）着丝粒着丝粒着丝粒着丝粒：mitosismitosismitosismitosis姊妹染色单体和减姊妹染色单体和减姊妹染色单体和减姊妹染色单体和减I I I I同同同同源染色体分离之必需。源染色体分离之必需。源染色体分离之必需。源染色体分离之必需。l l2 2 2 2）端粒：端粒：端粒：端粒：保护染色体末端免受核酸酶侵袭。保护染色体末端免受核酸酶侵袭。保护染色体末端免受核酸酶侵袭。保护染色体末端免受核酸酶侵袭。l l3 3 3 3）自主复制序列（自主复制序列（自主复制序列（自主复制序列（ARSARSARSARS）元件）元件）元件）元件：是染色体自：是染色体自：是染色体自：是染色体自主复制复制起点。主复制复制起点。主复制复制起点。主复制复制起点。l l构建构建构建构建YACYACYACYAC需要需要需要需要4 4 4 4个短序列：个短序列：个短序列：个短序列：2 2 2 2个端粒，着丝粒，个端粒，着丝粒，个端粒，着丝粒，个端粒，着丝粒，ARSARSARSARS元件，与外源元件，与外源元件，与外源元件，与外源DNADNADNADNA连接成线性连接成线性连接成线性连接成线性DNADNADNADNA分子，分子，分子，分子，导入酵母细胞克隆。导入酵母细胞克隆。导入酵母细胞克隆。导入酵母细胞克隆。2525第25页三、三、DNADNA重组与分子克隆化重组与分子克隆化 l l 为取得所需基因或特异序列，需为取得所需基因或特异序列，需从细胞中分离得到目标基因与载体从细胞中分离得到目标基因与载体DNADNA重组，并用适当方法在宿主细重组，并用适当方法在宿主细胞中表示，扩增得到大量相同胞中表示，扩增得到大量相同DNADNA片段，片段，称为称为DNADNA克隆，亦称分子克克隆，亦称分子克隆。隆。2626第26页 基本原理与过程：1 1 1 1、分离纯化目标基因、分离纯化目标基因、分离纯化目标基因、分离纯化目标基因2 2 2 2、目标基因、目标基因、目标基因、目标基因+vector=+vector=+vector=+vector=重组重组重组重组DNADNADNADNA分子分子分子分子3 3 3 3、重组、重组、重组、重组DNADNADNADNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。分子导入受体细胞，并在其内增殖。分子导入受体细胞，并在其内增殖。分子导入受体细胞，并在其内增殖。4 4 4 4、筛选含有重组、筛选含有重组、筛选含有重组、筛选含有重组DNADNADNADNA细胞细胞细胞细胞细胞克隆（细胞克隆（细胞克隆（细胞克隆（cell cell cell cell cloneclonecloneclone），将转化细胞置于琼脂表面，以刺激细胞），将转化细胞置于琼脂表面，以刺激细胞），将转化细胞置于琼脂表面，以刺激细胞），将转化细胞置于琼脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成遗传相同克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成遗传相同克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成遗传相同克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成遗传相同细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。体培养基中进行扩增。体培养基中进行扩增。体培养基中进行扩增。5 5 5 5、分离重组、分离重组、分离重组、分离重组DNADNADNADNA克隆：即收获扩增培养细胞，并克隆：即收获扩增培养细胞，并克隆：即收获扩增培养细胞，并克隆：即收获扩增培养细胞，并选择分离重组选择分离重组选择分离重组选择分离重组DNADNADNADNA。2727第27页分离纯化目基因目基因+vector=重组DNA分子2828第28页重组重组DNADNA 和和分子分子克隆克隆 2929第29页重组重组DNADNA和分子克隆几个方法：和分子克隆几个方法：（依目标基因起源依目标基因起源）l l1、从基因组中分离目基因在细胞中克隆l l2、由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行 l l 克隆l l3、化学合成目基因进行克隆l l4、PCR体外扩增目片段进行克隆3030第30页从基因组中分离目基因在细胞中克隆 3131第31页筛选含有重组筛选含有重组筛选含有重组筛选含有重组DNADNADNADNA细胞细胞细胞细胞细胞克隆（细胞克隆（细胞克隆（细胞克隆（cell clonecell clonecell clonecell clone）3232第32页筛查含有目标基因细胞克隆筛查含有目标基因细胞克隆3333第33页四、目基因表达 l l上述细胞克隆系统可直接导入目基因扩增，上述细胞克隆系统可直接导入目基因扩增，取得足够量目标基因来进行结构与功效研究。取得足够量目标基因来进行结构与功效研究。l l重组重组DNADNA技术另一目标是取得基因重组后产物技术另一目标是取得基因重组后产物RNARNA，蛋白质。，蛋白质。l l就是将目标基因与表示载体重组，导入宿主就是将目标基因与表示载体重组，导入宿主细胞进而表示出对应基因产物（蛋白）。如细胞进而表示出对应基因产物（蛋白）。如胰岛素，干扰素；生产疫苗抗原和特异抗体胰岛素，干扰素；生产疫苗抗原和特异抗体等。这类克隆系统称为表示克隆。等。这类克隆系统称为表示克隆。（expression cloningexpression cloning）.3434第34页目基因表达 3535第35页（一）真核细胞基因在原核细胞（一）真核细胞基因在原核细胞（细菌）中表示（细菌）中表示 l l原核细胞中缺乏真核基因表示装置（如，原核细胞中缺乏真核基因表示装置（如，原核细胞中缺乏真核基因表示装置（如，原核细胞中缺乏真核基因表示装置（如，RNARNARNARNA剪接剪接剪接剪接因子等），所以不能直接表示。通常采取大肠杆因子等），所以不能直接表示。通常采取大肠杆因子等），所以不能直接表示。通常采取大肠杆因子等），所以不能直接表示。通常采取大肠杆 菌为宿主。菌为宿主。菌为宿主。菌为宿主。真核多肽表示要求：真核多肽表示要求：真核多肽表示要求：真核多肽表示要求：1 1 1 1）适当）适当）适当）适当cDNAcDNAcDNAcDNA（完整编码序列）；（完整编码序列）；（完整编码序列）；（完整编码序列）；2 2 2 2）适当表示载体，提供特定多肽信息；）适当表示载体，提供特定多肽信息；）适当表示载体，提供特定多肽信息；）适当表示载体，提供特定多肽信息；3 3 3 3）外部进行表示调控，表示系统设计有开启子。）外部进行表示调控，表示系统设计有开启子。）外部进行表示调控，表示系统设计有开启子。）外部进行表示调控，表示系统设计有开启子。产物特征：产物特征：产物特征：产物特征：1 1 1 1）真核细胞蛋白因为不能羟基化而不稳定；）真核细胞蛋白因为不能羟基化而不稳定；）真核细胞蛋白因为不能羟基化而不稳定；）真核细胞蛋白因为不能羟基化而不稳定；2 2 2 2）活性受限或无活性。）活性受限或无活性。）活性受限或无活性。）活性受限或无活性。3636第36页(二二)、真核细胞基因在真核细胞中表示、真核细胞基因在真核细胞中表示 l l真核宿主细胞提供一个相同但又不相同环真核宿主细胞提供一个相同但又不相同环境。常采取酵母或昆虫细胞作为宿主。境。常采取酵母或昆虫细胞作为宿主。l l应用于真核细胞蛋白质大量制备，研究特应用于真核细胞蛋白质大量制备，研究特定基因表示。定基因表示。l l产物翻译后羟基化，羧基化等，有加强蛋产物翻译后羟基化，羧基化等，有加强蛋白稳定和功效活性。白稳定和功效活性。3737第37页五、基因文库、基因文库l l基因文库（基因文库（gene librarygene library）,应用应用DNADNA重组重组技术构建含有基因组全部基因技术构建含有基因组全部基因DNADNA克隆。克隆。3838第38页（一）一）一）一）构建基因构建基因构建基因构建基因组组组组DNADNADNADNA文文文文库库库库3939第39页（二）染色体特异基因文库二）染色体特异基因文库 （chromosome specific library chromosome specific library）单个染色体单个染色体 细胞克隆细胞克隆（流式（流式C C仪）仪）细胞细胞 染色体染色体染色体文库染色体文库染色体区带染色体区带 区带特异区带特异（显微切割（显微切割 ）DNADNA文库文库4040第40页 （三）（三）cDNAcDNA文库（文库（cDNA librarycDNA library）cDNAcDNA文库文库构建：构建：特定组织特定组织细胞一细胞一定发育定发育阶段阶段 总总 mRNAmRNA4141第41页