化学检测专业知识讲座省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

第七章 化学检测技术1第1页化学检测技术特点：化学检测技术特点：依据物质化学性质而对物质进行定量、定性测定。应用最早、最广泛检测技术简便、快速、操作轻易2第2页一.序言n化学检测是依据物质化学性质而对物质进行定性、定量测定方法，主要包含：1.糖类化学检测 2.蛋白质化学定量检测 3.蛋白质氨基酸序列检测 4.蛋白质免疫化学检测 5.核酸化学检测3第3页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 定义和分类定义和分类 碳水化合物统称为糖类，是由碳、氢、氧三种碳水化合物统称为糖类，是由碳、氢、氧三种元素组成一大类化合物。元素组成一大类化合物。糖类包含多糖、双糖、单糖单糖和一些双糖含有游离羰基还原糖多糖和蔗糖等无还原性非还原糖糖类化学检测主要是利用游离羰基还原性质，与试剂（氧化剂）进行氧化还原反应而进行测定。非还原糖必须转化为还原糖再进行测定4第4页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 糖类物质测定方法糖类物质测定方法 相对密度法相对密度法折光法折光法 旋光法旋光法物理法物理法 物理法物理法 化学法化学法 色谱法色谱法 发酵法发酵法 酶酶 法法 重量法重量法5第5页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 直接滴定法直接滴定法 (改良改良兰兰爱农法爱农法）高锰酸钾法高锰酸钾法 萨氏法萨氏法 3，5二硝基水杨酸二硝基水杨酸 酚酚硫酸法硫酸法 蒽酮法蒽酮法 半胱氨酸半胱氨酸咔唑法咔唑法化学法化学法还原糖法还原糖法碘量法碘量法比色法比色法糖类检测化学法糖类检测化学法6第6页1.兰爱农法n此法以次甲基蓝为指示剂，直接用糖液滴定到斐林试剂中进行测定；或者将糖液加到斐林试剂中，再用标准葡萄糖液反滴定。又称置换法，直接滴定法或者次甲基蓝法。8第8页n1.1原理 糖液滴到斐林试剂中时，还原糖中游离羰基与酒石酸钾钠铜反应，使二价铜离子还原生成一价氧化亚铜沉淀。因为次甲基蓝氧化能力比二价铜弱，当二价铜离子全部被还原后，过量一滴还原糖马上使次甲基蓝还原，溶液蓝色消失，从而显示反应终点。9第9页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 还原糖测定还原糖测定方法方法兰爱农（Lane-Eynon）法：斐林试剂甲液：硫酸铜斐林试剂甲液：硫酸铜+次甲基蓝次甲基蓝 斐林试剂乙液：酒石酸钾钠斐林试剂乙液：酒石酸钾钠+NaOH+NaOH+亚铁氰化钾亚铁氰化钾 乙酸锌溶液乙酸锌溶液 亚铁氰化钾溶液亚铁氰化钾溶液 葡萄糖标准溶液：准确称取经葡萄糖标准溶液：准确称取经 98 98 100 100 干燥至恒重干燥至恒重无水葡萄糖，加水溶解后移入无水葡萄糖，加水溶解后移入1000 m11000 m1容量瓶中，加入容量瓶中，加入5m15m1盐酸盐酸(预防微生物生长预防微生物生长)。10第10页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 操作关键点操作关键点（1）斐林试剂标定（a）标定预备试验 A、B各5mL10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，2滴1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1或0.2）V1mL。（b）标定 A、B各5mL10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，从滴定管中预先加入（V1-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸腾，2滴1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），统计消耗标准葡萄糖液总毫升数V011第11页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 (2)定糖（a）定糖预备试验A、B各5mL10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，2滴1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1或0.2）V2mL。（b）定糖A、B各5mL10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，补加（V0-V2）mL水，并从滴定管中预先加入（V2-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸腾，2滴1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），统计消耗标准葡萄糖液总毫升数V12第12页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 (3)计算还原糖含量（以葡萄糖计）（V0-V)c (1/10)n注意：（a）AB分开储存，预防Cu+改变，临用混合（b）单标移液管吸液准确，外壁也需擦洁净（c）体积需控制在一定范围内，对pH有影响（d）煮沸时间要一致（e）注意指示剂加入时间和加入量一致（f）滴定速度一致（后滴定0.51mL，1min内完成）（g）产物Cu2O不稳定，次甲基蓝变色也不稳定，暴露于空气或沸腾颜色改变，滴定过程不能摇动，不可中途中止加热 13第13页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 斐林试剂快速法：斐林试剂快速法：在斐林试剂中加入亚铁氰化钾（黄血盐）反应终点为蓝色消失，淡黄色出现。反应终点比兰爱农法更为显著。其特点是试剂用量少，操作和计算都比较简便、其特点是试剂用量少，操作和计算都比较简便、快速，滴定终点显著。快速，滴定终点显著。14第14页n2.2试验操作 2.2.1斐林试剂标定 吸收斐林甲、乙液各5ml，置于250ml三角瓶内，加10ml水，从滴定管中预先加入约20ml0.1标准葡萄糖液，摇匀后于电炉上加热至沸，马上用标准葡萄糖液继续滴定至蓝色消失。统计消耗葡萄糖液总毫升数V0。15第15页n2.2.2 样品含糖量测定 吸收斐林甲、乙液各5ml，置于250ml三角瓶内，加入样品稀释液10ml，及适量0.1标准葡萄糖液。摇匀后按标定时相同操作进行。统计消耗标准葡萄糖液毫升数（V)。16第16页n2.2.3 计算还原糖含量（）（V0-V)*c*N/10 式中，V0斐林试剂标定值，ml V样品糖液测定值，ml c标准葡萄糖液浓度，g/ml 10样品液体积，ml N样品稀释倍数17第17页3.碘量法3.1 原理 此法是利用碘与氢氧化钠反应生成次碘酸钠，氧化还原糖自由醛基，过量碘再用硫代硫酸钠滴定，从而测定糖含量。次碘酸钠氧化能力比较弱，所以只适合用于醛糖滴定，与酮糖不起反应。18第18页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 I2 NaIO(氧化剂），其氧化能力较弱，仅适合用于醛糖测定，与酮糖不起反应操作关键点：（1）标准硫代硫酸钠溶液配制，0.05 mol/L，沸腾后冷却水配制，存放在棕色瓶中，一周后用标准重铬酸钾标定。（2）标准碘液配制，0.1mol/L（3）空白滴定：空白液，用硫代硫酸钠滴定试剂中全部碘醛糖醛糖+I2+3 NaOH=醛糖酸钠醛糖酸钠+2 NaI+2H2OI2+2 NaOH=NaIO+NaI+H2ONaIO +NaI+2 HCl=I2+2 NaCl+H2O19第19页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 碘量瓶中，10mL0.1mol/L碘液15mL0.1 mol/LNaOH5mL空白液，摇匀后暗反应15min1mL1mol/L硫酸溶液，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加0.2mL0.5淀粉液作指示剂，滴定至蓝色消失，统计V0(4)样品滴定：以5mL样品液代替空白液，V1(5)计算：醛糖含量（V0 V1）C M n注意：暗反应后需酸化再滴定，滴定时开始轻摇（碘挥发），后再摇（淀粉吸附碘）配合次甲基蓝法测定一些糖含量（假如糖）配合次甲基蓝法测定一些糖含量（假如糖）20第20页4.铜试剂法n4.1 原理 铜试剂提供二价铜离子和碘，还原糖与二价铜离子反应生成氧化亚铜被碘氧化，再用硫代硫酸钠滴定反应液中剩下碘，从而测定样品中还原糖含量。铜试剂中适当增加或降低硫酸铜和碘酸钾量，就可测定不一样范围糖含量。21第21页n4.2 试验操作 4.2.1 铜试剂配制 4.2.2 标准曲线制作：4.2.2.1 配制葡萄糖标准液 4.2.2.2 取6个三角瓶，分别加入0、1、2、3、4、5ml标准葡萄糖液和5、4、3、2、1、0ml蒸馏水。4.2.2.3 各瓶加入5ml铜试剂。置于沸水浴中加热10min，冷却至室温。22第22页4.2.2.4 加入0.5mol/L硫酸5ml，振荡。待红色氧化亚铜沉淀完全溶解后，马上用0.005mol/L硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加数滴淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失。统计所用硫代硫酸钠毫升数。4.2.2.5 以葡萄糖含量为纵坐标，以空白滴定值减去标准样品滴定值得出硫代硫酸钠毫升数为横坐标，绘标准曲线。4.2.3 样品含糖量测定 将还原糖样品液适当稀释，取5ml样品液代替标准葡萄糖液，按上述方法进行测定。测样品中总糖含量，则样品经过水解后，按还原糖含量测定方法进行测定。测淀粉或半纤维素含量时，水解后测定还原糖量要乘上系数0.9。23第23页5.比色法测糖 上述4种糖检测方法都是经过滴定方法进行糖含量测量；另外，我们还能够经过比色法等检测糖含量，主要有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和DNS法等，其原理分别以下：24第24页n5.1苯酚-硫酸法原理 苯酚硫酸法主要用于多糖检测。其原理是：多糖在浓硫酸作用下水解成单糖,并快速脱水生成糠醛衍生物,随即与苯酚结合生成有色化合物,从而能够利用分光光度计测定其吸光度,并利用标准曲线定量测定样品中多糖含量。n5.2 蒽酮-硫酸法原理 非还原性糖在浓硫酸催化下，快速水解为还原糖。还原糖与浓硫酸作用形成5-羟甲基糠醛，5-羟甲基糠醛，与蒽酮反应生成蓝绿色物质，在625nm处有最大吸收值。25第25页n5.3 DNS法原理 3,5-二硝基水杨酸在中性或偏碱性条件下与多糖水解还原糖共热后被还原成棕红色氨基化合物3-氨基-5-硝基水杨酸,在一定范围内,还原糖量和反应液颜色呈正比。26第26页5.4 DNS法测发酵残糖5.4.1 标准曲线绘制 预先配制好1mg/ml葡萄糖标准液。取6支具塞比色管，编号，分别吸收0、0.2、0.4、0.6、0.8及1ml葡萄糖标准液，再补充蒸馏水至2ml，分别添加DNS试剂3ml。将各管溶液混合均匀，在预先加热好沸水中加热5min，取出马上用自来水冷却至室温，再向每管补充蒸馏水至25ml，小心摇匀。在分光光度计上，测520nm波优点溶液OD值。以葡萄糖mg数为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。27第27页5.4.2 发酵残糖测定 准确吸收已分离菌体后发酵液1ml，用蒸馏水稀释至适当倍数得到稀释液。准确吸收稀释液1ml，按照5.4.2中方法测定OD值，依据DNS法标准曲线和稀释倍数计算发酵液残糖含量。28第28页 注意事项：a.试验中OD值最好在0.20.8范围内。发酵液中残糖比较高，所以可能需要进行预备试验，依据试验结果对发酵液进行适当稀释。b.发酵液和其它试剂在具塞试管内要充分混合均匀。c.沸水浴时间要严格掌握好，时间过长会使溶液颜色加深，试验误差变大。29第29页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 蔗糖是葡萄糖和果糖组成双糖，没有还原蔗糖是葡萄糖和果糖组成双糖，没有还原性，不能用碱性铜盐试剂直接测定，但在一定条性，不能用碱性铜盐试剂直接测定，但在一定条件下，蔗糖可水解为含有还原性葡萄糖和果糖件下，蔗糖可水解为含有还原性葡萄糖和果糖（转化糖）。所以，能够用测定还原糖方法测定（转化糖）。所以，能够用测定还原糖方法测定蔗糖含量。对于纯度较高蔗糖溶液，其相对密度、蔗糖含量。对于纯度较高蔗糖溶液，其相对密度、折光率、旋光度等物理常数与蔗糖浓度都有一定折光率、旋光度等物理常数与蔗糖浓度都有一定关系，故也可用物理检验法测定。这里介绍还原关系，故也可用物理检验法测定。这里介绍还原糖法。糖法。蔗糖测定蔗糖测定30第30页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 淀粉测定方法有各种，部分是依据淀粉理化性淀粉测定方法有各种，部分是依据淀粉理化性质而建立。惯用方法有：质而建立。惯用方法有：酸水解法酸水解法 酶水解法酶水解法 旋光法旋光法 酸化酒精沉淀法。酸化酒精沉淀法。淀粉测定方法淀粉测定方法31第31页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 酸水解法酸水解法 （一）（一）原理原理 样品经乙醚除去脂肪，乙醇除去可溶性糖类后，用盐酸水解淀粉为葡萄糖，按还原糖测定方法测定还原糖含量，再折算为淀粉含量。淀粉水解 于250m1锥形瓶中加入30 ml 6 mol/L盐酸，装上冷凝管，置沸水浴中回流 2 h,速冷。蔗糖水解：于250m1锥形瓶中加入5 ml 6 mol/L盐酸，置6870水浴中15 min,速冷。32第32页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 酶水解法酶水解法（一）（一）原理：原理：含淀粉含淀粉 糊精、麦芽糖糊精、麦芽糖 葡萄糖葡萄糖样品样品酸解液化糖化酸解淀粉酶水解有选择性33第33页二.蛋白质和氨基酸定量检测n蛋白质定性定量分析是生物化学和其它生物学科、食品检验、临床检验诊疗疾病、生物药品分离提纯和质量检验中最惯用伎俩。34第34页第二节第二节 蛋白质与氨基酸化学检测蛋白质与氨基酸化学检测 （1 1）一切蛋白质都含）一切蛋白质都含N N元素，且各种蛋白质含元素，且各种蛋白质含氮量很靠近，平均为氮量很靠近，平均为1616；（2 2）蛋蛋白白质质系系数数：任任何何生生物物样样品品中中每每1g1g元元N N存存在在，就就表表示示大大约约有有100/16=6.25100/16=6.25蛋蛋白白质质存存在在，6.256.25常称为蛋白质常数常称为蛋白质常数100克样品中蛋白质含量克样品中蛋白质含量(g%)=每克样品含氮克数每克样品含氮克数 6.251001/16%蛋白质元素组成特点：蛋白质元素组成特点：35第35页第二节第二节 蛋白质与氨基酸化学检测蛋白质与氨基酸化学检测 含氮量 每gN相当P肉、蛋、豆 16 6.25 面粉 17.6 5.70 奶品 15.7 6.38 花生 18.2 5.50 鲑精蛋白 31.5 3.1736第36页1.凯氏定氮法n1.1 原理 将样品与浓硫酸共热时蛋白质分解，其中氮与硫酸反应生成硫酸胺，然后碱化蒸馏使氨游离。氨由硼酸吸收生成硼酸铵以标准酸滴定。从而能够计算出含氮量。滴定时以甲基红-溴甲酚绿混合液为指示剂，滴至溶液变为紫红色即为终点。也可用标准酸吸收氨，再用标准碱滴定剩下酸。（甲基橙为指示剂，黄色为终点）37第37页常量凯氏定氮装置38第38页微量凯氏定氮装置简图39第39页微量凯氏定氮装置40第40页n1.2 试验操作 1.2.1 样品处理 固体样品应在105干燥至恒重。液体样品可直接吸收一定量或者稀释后吸收一定量进行测定，应该使样品含氮量在0.21.0mg范围内。41第41页n1.2.2 消化 取一定量样品，于50ml干燥凯氏烧瓶内。加入300mg硫酸钾硫酸铜混合粉末，再加入3ml浓硫酸。电炉加热，在通风橱中消化，瓶口加一小漏斗，先以文火加热防止泡沫飞溅，不能让泡沫上升到瓶颈，待泡沫停顿发生后，加强火保持瓶内液体沸腾。时常转动烧瓶使样品全部消化完全，直到消化液清澈透明。另取凯氏烧瓶一个，不加样品，其它操作相同，作空白对照。42第42页n1.2.3 蒸馏n将微量凯氏蒸馏装置洗涤洁净。将凯氏烧瓶内消化液冷却后，全部转入100ml容量瓶中。凯氏烧瓶用蒸馏水洗涤三次，洗涤液全部转入容量瓶内，再用蒸馏水定容。n 吸收20ml稀释消化液，置于蒸馏装置反应室中，加10ml30氢氧化钠溶液，将玻璃塞塞紧，漏斗中加少许蒸馏水作为水封。n取一三角瓶，加入10ml硼酸田氏指示剂混合液，置于冷凝管下口，冷凝管口浸没在硼酸液面之下，确保氨吸收。n 加热水蒸气发生器，沸腾后。夹紧夹子，开始蒸馏。三角瓶中硼酸指示剂混合液吸收蒸出来氨，由紫红色变为绿色。蒸馏15min，让硼酸液面离开冷凝管口，再蒸12min冲洗冷凝管口。空白试验按相同操作进行。43第43页n1.2.4 滴定n样品和空白均蒸馏完成后，用0.01mol/L标准盐酸滴定，至硼酸指示剂混合液由绿色变回紫红色，即为滴定终点。44第44页n1.2.5 计算 样品总氮含量（mg）（A-B）*C*14*100/20 式中，A样品滴定时消耗标准盐酸体积，ml B空白滴定时消耗标准盐酸体积，ml C标准盐酸当量浓度 14氮相对分子质量 20用于蒸馏稀释消化液体积，ml 100稀释消耗液体积，ml 样品粗蛋白含量（mg）样品总氮含量*6.2545第45页2.双缩脲试剂法(Biuret法)n2.1 原理 蛋白质含有两个以上肽键，含有双缩脲反应，即蛋白质在碱性溶液中与二价铜离子结合，生成紫红色络合物。络合物颜色深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质相对分子质量和氨基酸组成无关。46第46页n2.2 试验操作 2.2.1 双缩脲试剂配制 配置溶液若出现黑点或红色沉淀时，则不能再用。加入0.1碘化钾可预防铜析出。2.2.2 标准曲线制作 于试管中分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml1酪蛋白溶液，用水补足至1ml。然后加入4ml双缩脲试剂，充分摇匀在室温下反应30min，于540nm波长下测定光吸收率。以酪蛋白含量为横坐标，光吸收率为纵坐标，绘制标准曲线。47第47页n2.3 样品测定 取样品溶液1ml，加入4ml双缩脲试剂，摇匀后在室温下反应30min测定540nm处光吸收率，依据标准曲线查处蛋白质含量。3.注意：a.双缩脲试剂法测定范围为110mg蛋白质。b.双缩脲并非蛋白质特效反应，所以测定前必须先使蛋白质完全沉淀，去除其它干扰物质。c.双缩脲法操作简便，快速，但测定不是十分准确。硫酸铵不干扰反应，但Tris缓冲液等给予阳性反应，干扰蛋白质测定。48第48页3.福林-酚试剂法(lowry法)n3.1 原理 福林-酚试剂由两种试剂组成，其中碱性铜试剂能与蛋白质中肽键发生双缩脲反应生成蛋白质-铜复合物。另一个稀释苯酚试剂则与酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸残基反应，展现蓝色。两种显色反应能够叠加，所以此法含有很高敏感性。49第49页n3.2 试验操作 3.2.1 福林-酚试剂配制 3.2.2 蛋白质标准溶液配制 准确称取一定量结晶牛血清蛋白，溶于0.9NaCl溶液中，配制成适当浓度标准液。（也可用酪蛋白，但需要经凯氏定氮法测定其蛋白质含量）50第50页n3.2.3 样品测定 取1ml样品液（含蛋白质15500ug），加入5ml试剂甲，混匀于室温放置10min，再加入试剂乙0.5ml，马上混匀，于室温反应30min。然后选择500750nm间一个波长，以蒸馏水作空白对照测定吸光率。蛋白质含量高时，选择靠近500nm波长测定；含量低时，选择靠近750nm波长测定。51第51页4、紫外吸收法n因为蛋白质分子中，酪氨酸和色氨酸残基苯环含有共轭双键，所以蛋白质含有吸收紫外光性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度与蛋白质含量成正比，可用作定量测定。n紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。尤其适合用于柱层析洗脱液快速连续检测，n利用280nm进行紫外检测，来判断蛋白质吸附或洗脱情况是最惯用方法。52第52页n紫外吸收法特点是测定蛋白质含量准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大蛋白质，有一定误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相同蛋白质。n若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光物质，会出现较大干扰。核酸干扰能够经过查校正表，再进行计算方法，加以适当校正。n因为不一样蛋白质和核酸紫外吸收是不相同，即使经过校正，测定结果还是存在一定误差。53第53页5、考马斯亮兰法（Bradford法）n1976年由Bradford建立考马斯亮兰法（Bradford法），是依据蛋白质与染料相结合原理设计。这种蛋白质测定法含有超出其它几个方法突出优点，因而正在得到广泛应用。这一方法是当前灵敏度最高蛋白质测定法。n考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料最大吸收峰由465nm变为595nm，溶液颜色也由棕黑色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸（尤其是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。n在595nm下测定吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。54第54页Bradford法优点：n灵敏度高，据预计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生颜色改变很大，蛋白质染料复合物有更高消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度改变比Lowry法要大多。n测定快速、简便，只需加一个试剂。完成一个样品测定，只需要5分钟左右。因为染料与蛋白质结合过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色能够在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。n干扰物质少。如干扰Lowry法K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。55第55页Bradford法缺点：n因为各种蛋白质中精氨酸和芳香族氨基酸含量不一样，所以Bradford法用于不一样蛋白质测定时有较大偏差，在制作标准曲线时通常选取 G-球蛋白为标准蛋白质，以降低这方面偏差。n仍有一些物质干扰此法测定，主要干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1NNaOH。（如同0.1N酸干扰Lowary法一样）。n标准曲线也有轻微非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质浓度。56第56页6、茚三酮显色法测定氨基酸含量n6.1原理 茚三酮溶液与氨基酸共同加热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。其颜色深浅与氨基酸含量成正比，可经过测定570nm处光密度测定氨基酸含量。57第57页n6.2 试验操作n6.2.1 标准曲线制作 分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml0.3mmol标准氨基酸溶液于试管中，用水补足至1ml。各加入1mlpH5.42mol/L醋酸缓冲液；再加入1ml茚三酮显色液，充分混合后，盖住试管口，在100水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min后，加入3ml60乙醇稀释，用分光度计测定OD570。以OD570为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。58第58页n6.2.2 样品氨基酸测定n 取样品液1ml，加入1mlpH5.42mol/L醋酸缓冲液；再加入1ml茚三酮显色液，充分混合后，盖住试管口，在100水浴中加热15min，自来水冷却。放置5min后，加入3ml60乙醇稀释，用分光度计测定OD570。（生成 颜色在60min内稳定）n将样品OD570测定与标准曲线对照，即可确定样品中氨基酸含量。59第59页n注意事项：脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应展现黄色，应该在440nm处测 光密度，从而测定氨基酸含量。测量氨基酸含量还有甲醛滴定法等等，因时间关系，在此不作详细介绍。60第60页61第61页三.蛋白质氨基酸序列测定n 蛋白质或多肽N-末端分析方法有二硝基氟苯法（DNFB或FDNB法）、丹磺酰氯法（DNS法）、苯异硫氰酸脂法（PITC法）和氨肽酶法等；n C-末端分析方法有肼解法、还原法和羧肽酶法等。62第62页1.丹磺酰氯法（DNS法）n1.1 原理 蛋白质-氨基与荧光试剂丹磺酰氯在碱性条件下反应，生成丹磺酰-蛋白质（DNS-蛋白质）。DNS-蛋白质经水解可生成DNS-氨基酸，DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析进行分离和检测，从而可知道蛋白质N-末端氨基酸。此法灵敏度高，比茚三酮法高10倍以上，比二硝基氟苯法高100倍以上，可使用于蛋白质氨基酸组成测定。63第63页n1.2 试验操作 1.2.1 丹磺酰反应 取0.20.5mg蛋白质样品置于有塞微型试管中，加入0.5ml0.2mol/L碳酸氢钠溶液，再加入0.5ml0.2DNS-Cl丙酮溶液，用三乙胺调pH至9.0-9.5，塞好，于40烘箱中反应2h，或室温反应2-4h。反应结束后，用真空干燥除去丙酮。1.2.2 水解 将上述干燥反应物用0.5ml6mol/L盐酸水解后，移至水解管，抽真空密封管口，于105-110水解18-24h。开管后，蒸去盐酸。64第64页1.2.3 检测 将上述水解物用0.5ml50吡啶溶液溶解后，进行聚酰胺薄膜层析。或者用0.5ml乙酸乙酯抽提，将抽提液干燥除去乙酸乙酯，用少许丙酮溶解后进行聚酰胺薄膜层析。层析后，在360nm或280nm波长紫外光灯下可看到层析谱呈黄色荧光DNS-氨基酸斑点与标准DNS-氨基酸层析图谱比较，就可确定N-末端氨基酸。65第65页2.Edman法 Edman法，即异硫氰酸苯脂分析法，也称PTC法。其优点是在切下N-末端氨基酸残基时，链其它氨基酸残基不受影响，Edman试剂很轻易和大多数N-末端氨基酸残基反应，所以广泛应用于蛋白质和多肽氨基酸序列分析中。66第66页n2.1 原理 蛋白质（多肽）游离-氨基与异硫氰酸苯脂反应形成苯氨基硫甲酰-蛋白质（PTC-蛋白质）。PTC-蛋白质在无水酸中裂解产生噻唑啉酮衍生物，而肽其它部分被完整地释放出来。噻唑啉酮衍生物水解生成苯氨基硫甲酰-氨基酸（PTC-氨基酸），然后再环化生成乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH-氨基酸），经过聚酰胺薄膜层析，再与标准PTH-氨基酸层析图谱比较，就可确定蛋白质（多肽）N-末端氨基酸。67第67页n2.2 试验操作 2.2.1 蛋白质PTC化 取0.210mg蛋白质，用0.1ml水溶解，加入等体积吡啶，用0.1mol/L氢氧化钠调pH到8.79.0，加入0.1ml异硫氰酸苯脂，摇匀，在室温反应2h，生成PTC-蛋白质后，真空干燥去除吡啶。2.2.2 PTC衍生物环化 PTC-蛋白质中加入0.2ml无水三氟醋酸，盖严于40保温30min，生成PTC-氨基酸后，再真空干燥除去三氟醋酸。然后加入0.2ml蒸馏水，水解，环化生成PTH-氨基酸。68第68页 2.2.3 PTH-氨基酸抽提 在上述PTH-氨基酸和残肽混合液中加入0.15ml有机溶剂（苯、乙酸乙酯等）抽提，振荡分层后，吸收有机相。再重复抽提二次，合并有机相，真空干燥得到PTH-氨基酸。水相含残肽，干燥后可继续测下一个N-末端氨基酸。2.2.4 PTH-氨基酸检测 直接用聚酰胺薄膜层析检出PTH-氨基酸，或者将其水解成游离氨基酸用纸层析或氨基酸自动分析仪检测。69第69页3.2，4二硝基氟苯测定法n3.1 原理 FDNB能在温和条件下（室温、pH8-9)与蛋白质自由-氨基定量地发生反应，生成DNP蛋白质。DNP蛋白质经酸水解，生成DNP氨基酸和氨基酸混合液。用有机溶剂抽提，除了碱性氨基酸DNP衍生物留在水溶液中，其它DNP氨基酸都在有机相中。DNP氨基酸展现黄色，可用聚酰胺薄膜层析或其它层析，电泳分离后再进行定性定量测定。70第70页n3.2试验操作 3.2.1 蛋白质二硝基苯化 称取一定量蛋白质（1-2umol），加入等量碳酸氢钠，溶于5ml水中，再加入2倍体积5 FDNB乙醇溶液，混匀，盖紧，于室温下避光振摇2h。反应结束后，用一定量盐酸酸化，离心搜集沉淀。沉淀用1：1乙醇-乙醚相继洗涤。所得DNP蛋白质置于干燥器中避光干燥。71第71页 3.2.2 DNP蛋白质水解 DNP蛋白质放入水解管，加入2ml5.7mol/L恒沸点盐酸，抽气封管，于105烘箱中水解4-24h。3.2.3 DNP氨基酸抽提 水解完成启封后，用2-3倍体积蒸馏水稀释，再用乙醚提取三次，合并醚层，以去除残酸。醚层提取液蒸干乙醚后，得醚溶性DNP氨基酸（中性与酸性氨基酸）。水层蒸干后，重复用水溶解和蒸干，得到碱性氨基酸DNP衍生物。72第72页 3.2.4 DNP氨基酸检测 将DNP氨基酸加少许丙酮溶解，点样进行聚酰胺薄膜双向层析，用以下溶剂系统展开：苯：冰醋酸80：20（V/V）88甲酸：水50：50（V/V）将层析图谱与标准DNP氨基酸层析图谱比较，可确定蛋白质N-末端氨基酸。将图谱中黄色斑点剪下，用1碳酸氢钠洗脱后，在360nm波长下测定光密度可进行定量测定。73第73页四.蛋白质免疫检测(单独讲解）n 蛋白质免疫化学检测是指利用抗原与抗体之间特异结合反应而对蛋白质进行定性定量分析技术。n免疫反应含有特异性强，灵敏度高特点，非常使用于蛋白质检测。74第74页五.核酸化学检测n依据核酸中所含磷及戊糖化学性质测定核酸含量，主要方法有定磷法、二苯胺法和地衣酚法。75第75页1.定磷法n1.1 原理 核酸中含磷，用强酸消化，变成无机磷。无机磷在酸性条件下与钼酸铵反应生成磷钼酸。在还原剂作用下，磷钼酸生成蓝色化合物钼蓝。钼蓝在650-660nm波优点有最大吸收峰，经过测定OD650，测定磷含量，深入可算出核酸含量。76第76页n1.2 试验操作1.2.1 标准曲线制作准备不一样含量无机磷溶液各 1ml加蒸馏水2ml和定磷试剂3ml，混匀，于45恒温水浴中反应25min。冷却至室温，于650nm波优点测光密度OD650。以标准磷含量（mg）作横坐标，OD650为纵坐标绘制标准曲线。77第77页1.2.2 核酸消化 取1ml1核酸溶液，加入2-3ml5mol/L硫酸，于凯氏烧瓶中，140-160下消化2-4h。待溶液呈黄褐色后，取出，稍冷，加入1-2滴30双氧水，继续消化，直到溶液透明为止。取出冷却后加1ml蒸馏水，在沸水浴中加热10min，以分解消化过程中形成焦磷酸。然后移到100ml容量瓶中定容。78第78页n1.2.3 总磷和无机磷测定 取样品液1ml加蒸馏水2ml和定磷试剂3ml，混匀，于45恒温水浴中反应25min。冷却至室温，于650nm波优点测光密度OD650。用1ml蒸馏水代替样品液作空白对照。取1ml1核酸溶液，不经消化，稀释100倍。取1ml按上述方法测OD650。依据标准曲线查出对应总磷和无机磷含量。79第79页n1.2.4 核酸计算RNA量（总磷-无机磷）*10.9DNA量（总磷-无机磷）*10.5注意定磷剂配制：3mol/L硫酸：水:2.5%钼酸铵：10Vit C=1：2：1:1，当日混合使用。80第80页2.二苯胺法n2.1 原理nDNA中2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应。在595nm处有最大吸收峰。在40400ug范围内，OD与DNA浓度成正比。少许乙醛可提升反应灵敏度，在使用前加入到配制好二苯胺试剂中。81第81页n2.2 试验操作 2.2.1 二苯胺试剂配制 2.2.2 标准曲线制作 取一定量标准DNA，用0.01mol/L氢氧化钠溶液配成200ug/mlDNA标准液。分别吸收0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml DNA标准液，补足蒸馏水至2ml。然后各加入3ml二苯胺试剂，混匀，于60水浴中保温1h。冷却后，分别测定OD595。以DNA浓度为横坐标，OD595为纵坐标，绘制标准曲线。82第82页2.2.3 样品种DNA含量测定 准确称取一定量样品，用0.01mol/L氢氧化钠溶液配成一定浓度。取2ml样品液按上述方法测定OD595，从标准曲线查出样品液中DNA含量。注意：脱氧木糖和阿拉伯糖也有此反应，可能会造成干扰。83第83页3.地衣酚法测RNA含量n3.1 原理n核糖核酸在浓盐酸和三氯化铁存在下，与3,5二羟甲苯反应生成绿色物质，该绿色物质在670nm处有光吸收高峰，在一定浓度范围内，吸光度和RNA浓度成正比。84第84页n3.2 试验操作 3.2.1 地衣酚试剂配制 3.2.2 标准曲线制作 称取标准RNA，用蒸馏水配制成100ug/mlRNA标准液，分别吸收0、0.5、1.0、1.5、2、2.5ml标准液，分别添加蒸馏水至2.5ml。然后各自加入2.5ml地衣酚试剂。混匀后，于沸水浴中加热30min，冷却后测定OD670。以RNA含量为横坐标，OD670为纵坐标，绘制标准曲线。85第85页n3.2.3 样品RNA测定 取2.5ml样品液，按上述方法测OD670。依据标准曲线查出RNA含量。注意;因为全部戊糖均可进行地衣酚反应，所以DNA会干扰测量。86第86页