实验技术理论生物大分子的制备市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx

生物大分子制备生物大分子制备第1页2.1概述在自然科学，尤其是生命科学高度发展今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子结构与功效研究是探求生命奥秘中心课题，而生物大分子结构与功效研究，必须首先处理生物大分子制备问题，有能够到达足够纯度生物大分子制备工作为前题，结构与功效研究就无从谈起。然而生物大分子分离纯化与制备是一件十分细致而困难工作。第2页与化学产品分离制备相比较，生物大分子制备有以下主要特点：生物材料组成极其复杂，经常包含有数百种乃至几千种化合物。许多生物大分子在生物材料中含量极微，分离纯化步骤繁多，流程长。许多生物大分子一旦离开了生物体内环境时就极易失活，所以分离过程中怎样预防其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。生物大分子制备几乎都是在溶液中进行，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成综合影响，极难准确预计和判断。第3页生物大分子制备通常可按以下步骤进行：确定要制备生物大分子目标和要求，是进行科研、开发还是要发觉新物质。建立对应可靠分析测定方法，这是制备生物大分子关键。经过文件调研和预备性试验，掌握生物大分子目标产物物理化学性质。生物材料破碎和预处理。分离纯化方案选择和探索，这是最困难过程。生物大分子制备物均一性（即纯度）判定，要求到达一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。产物浓缩，干燥和保留。第4页分析测定方法主要有两类：即生物学和物理、化学测定方法。生物学测定法主要有：酶各种测活方法、蛋白质含量各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定愈加紧速、简便。第5页要了解生物大分子物理、化学性质主要有：在水和各种有机溶剂中溶解性。在不一样温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子稳定性。固态时对温度、含水量和冻干时稳定性。各种物理性质：如分子大小、穿膜能力、带电情况、在电场中行为、离心沉降表现、在各种凝胶、树脂等填料中分配系数。其它化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶稳定性和对各种化学试剂稳定性。对其它生物分子特殊亲和力。第6页制备生物大分子分离纯化方法各种多样，主要是利用它们之间特异性差异，如分子大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其它分子亲和性等。各种方法基本原理能够归纳为两个方面：利用混合物中几个组分分配系数差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等；将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，经过物理力场作用，使各组分分配于不一样区域，从而到达分离目标，如电泳、离心、超滤等。当前纯化蛋白质等生物大分子关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。第7页2.2 生物大分子制备前处理生物大分子制备前处理2.2.1 生物材料选择生物材料选择 制备生物大分子，首先要选择适当生物材料。材料起源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。选择材料应含量高、起源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当溶剂中提取，假如所要求成份在细胞内，则要先破碎细胞。植物要先去壳、除脂。微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。生物材料如暂不提取，应冰冻保留。动物材料则需深度冷冻保留。第8页2.2.2 细胞破碎细胞破碎不一样生物体或同一生物体不一样部位组织，其细胞破碎难易不一，使用方法也不相同，如动物脏器细胞膜较脆弱，轻易破碎，植物和微生物因为含有较坚固纤维素、半纤维素组成细胞壁，要采取专门细胞破碎方法。(1)机械法：1)研磨：将剪碎动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少许石英砂研磨或匀浆。2)组织捣碎器：这是一个较猛烈破碎细胞方法，通常可先用家用食品加工机将组织打坏，然后再用10000r/min0r/min内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织细胞打坏。第9页(2)物理法：1)重复冻融法：将待破碎细胞冷至15到20，然后放于室温(或40)快速融化，如此重复冻融屡次，因为细胞内形成冰粒使剩下胞液盐浓度增高而引发细胞溶胀破碎。2)超声波处理法：此法是借助超声波振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。3)压榨法：这是一个温和、彻底破碎细胞方法。在1000105Pa105Pa高压下使细胞悬液经过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。4)冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90左右维持数分钟，马上放入冰浴中使之冷却，如此重复屡次，绝大部分细胞能够被破碎。第10页(3)化学与生物化学方法：1)自溶法：将新鲜生物材料存放于一定pH和适当温度下，细胞结构在本身所含有各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。2)溶胀法：细胞膜为天然半透膜，在低渗溶液和低浓度稀盐溶液中，因为存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。3)酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37，pH8，处理15分钟，能够专一性地将细胞壁分解。4)有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也能够与研磨法联合使用。第11页2.2.3 生物大分子提取生物大分子提取“提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎细胞置于溶剂中，使被分离生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来天然状态不丢失生物活性过程。影响提取原因主要有：目标产物在提取溶剂中溶解度大小；由固相扩散到液相难易；溶剂pH值和提取时间等。通常：极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；温度升高，溶解度加大；远离等电点pH值，溶解度增加。提取时所选择条件应有利于目标产物溶解度增加和保持其生物活性。第12页水溶液提取：蛋白质和酶提取普通以水溶液为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最惯用溶剂。用水溶液提取生物大分子应注意几个主要影响原因是：1)盐浓度（即离子强度）：离子强度对生物大分子溶解度有极大影响，有些物质，如DNA-蛋白复合物，在高离子强度下溶解度增加。绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度溶液中都有较大溶解度，如在纯水中加入少许中性盐，蛋白质溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶”现象。盐溶现象产生主要是少许离子活动，降低了偶极分子之间极性基团静电吸引力，增加了溶质和溶剂分子间相互作用力结果。为了提升提取效率，有时需要降低或提升溶剂极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）能够增加溶液极性。第13页2)pH值：蛋白质、酶与核酸溶解度和稳定性与pH值相关。过酸、过碱均应尽可能防止，普通控制在pH=68范围内，提取溶剂pH应在蛋白质和酶稳定范围内，通常选择偏离等电点两侧。3)温度：为预防变性和降解，制备含有活性蛋白质和酶，提取时普通在05低温操作。4)预防蛋白酶或核酸酶降解作用：加入抑制剂或调整提取液pH、离子强度或极性等方法使对应水解酶失去活性，预防它们对欲提纯蛋白质、酶及核酸降解作用。第14页5)搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物溶解，普通采取温和搅拌为宜，速度太快轻易产生大量泡沫，增大了与空气接触面，会引发酶等物质变性失活。因为普通蛋白质都含有相当数量巯基，有些巯基经常是活性部位必需基团，若提取液中有氧化剂或与空气中氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间二硫键，造成酶活性丧失。在提取液中加入少许巯基乙醇或半胱氨酸以预防巯基氧化。第15页 有机溶剂提取一些和脂类结合比较牢靠或分子中非极性侧链较多蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，惯用不一样百分比有机溶剂提取。惯用有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂能够与水互溶或部分互溶，同时含有亲水性和亲脂性。有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定百分比有机溶剂水溶液中，在这种情况下，采取稀有机溶液提取经常能够预防水解酶破坏，并兼有除去杂质提升纯化效果作用。比如，胰岛素。第16页2.3 生物大分子分离纯化生物大分子分离纯化 因为生物体组成成份是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，所以不可能有一个适合于各类分子固定分离程序，但多数分离工作关键部分基本伎俩是相同。为了防止盲目性，节约试验探索时间，要认真参考和借鉴前人经验，少走弯路。惯用分离纯化方法和技术有：沉淀法（包含：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。本章以介绍沉淀法为主。第17页2.3.1 沉淀法沉淀法 沉淀是溶液中溶质由液相变成固相析出过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不但用于试验室中，也用于一些生产目标制备过程，是分离纯化生物大分子，尤其是制备蛋白质和酶时最惯用方法。经过沉淀，将目标生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步分离。其基本原理是依据不一样物质在溶剂中溶解度不一样而到达分离目标，不一样溶解度产生是因为溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力差异而引发，溶解度大小与溶质和溶剂化学性质及结构相关，溶剂组分改变或加入一些沉淀剂以及改变溶液pH值、离子强度和极性都会使溶质溶解度产生显著改变。第18页在生物大分子制备中最惯用几个沉淀方法是：中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶分离纯化。有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子分离纯化。选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去一些不耐热和在一定pH值下易变性杂蛋白。等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质沉淀，但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。有机聚合物沉淀：是发展较快一个新方法，主 要 使 用 PEG聚 乙 二 醇（Polyethyeneglycol）作为沉淀剂。第19页2.3.1.1 中性盐沉淀（盐析法）中性盐沉淀（盐析法）在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都能够用盐析法进行沉淀分离。盐析法应用最广还是在蛋白质领域，已经有八十多年历史，其突出优点是：成本低，不需要尤其昂贵设备。操作简单、安全。对许多生物活性物质含有稳定作用。第20页 中性盐沉淀蛋白质基本原理蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子COOH、NH2和OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm100nm颗粒亲水胶体，减弱了蛋白质分子之间作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中稳定原因有两个：即电荷和水膜。因为中性盐亲水性大于蛋白质和酶分子亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。盐析示意图以下页“图4”所表示。第21页第22页 中性盐选择惯用中性盐中最主要是（NH4）2SO4，因为它与其它惯用盐类相比有十分突出优点：1)溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高溶解度，这是其它盐类所不具备。因为酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（04）进行。由下表能够看到，硫铵在0时溶解度，远远高于其它盐类：表2-1几个盐在不一样温度下溶解度（克/100毫升水）02080100（NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101第23页2)分离效果好：有提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就能够除去75杂蛋白，纯度提升了四倍。3)不易引发变性，有稳定酶与蛋白质结构作用。有酶或蛋白质用23mol/L浓度（NH4）2SO4保留可达多年之久。4)价格廉价，废液不污染环境。第24页 盐析操作方法最惯用是固体硫酸铵加入法。将其研成细粉，在搅拌下迟缓均匀少许屡次地加入，靠近计划饱和度时，加盐速度更要慢一些，尽可能防止局部硫酸铵浓度过大而造成不应有蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采取离心分离，高浓度硫酸铵惯用过滤方法。各种饱和度下需加固体硫酸铵量可由附录中查出。第25页 盐析曲线制作假如要分离一个新蛋白质和酶，没有文件数据能够借鉴，则应先确定沉淀该物质硫酸铵饱和度。详细操作方法以下(讲义p39)：蛋白质量(mg)或酶活力102030405060708090100 硫铵饱和度第26页盐析影响原因1)蛋白质浓度：高浓度蛋白质用稍低硫酸铵饱和度沉淀，若蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质共沉淀作用。低浓度蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降低。较适中蛋白质浓度是2.53.0，相当于25mg/mL30mg/mL。2)pH值对盐析影响：在等电点处溶解度小，pH值常选在该蛋白质等电点附近。3)温度影响：对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质溶解度大多数还是随浓度升高而增加。普通情况下，可在室温下进行。但对于一些对温度敏感酶，要求在04下操作，以防止活力丧失。第27页2.3.1.2 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法基本原理有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用沉淀方法之一。其原理主要是：降低水溶液介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降低溶液介电常数，减小溶剂极性，从而减弱了溶剂分子与蛋白质分子间相互作用力，造成蛋白质溶解度降低而沉淀。因为使用有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水同时从蛋白质分子周围水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子水膜，因而发生沉淀作用。第28页有机溶剂沉淀法优点是：分辨能力比盐析法高，即一个蛋白质或其它溶质只在一个比较窄有机溶剂浓度范围内沉淀。沉淀不用脱盐，过滤比较轻易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛应用。其缺点是对一些含有生物活性大分子轻易引发变性失活，操作需在低温下进行。有机溶剂选择和浓度计算用于生化制备有机溶剂选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶惯用是乙醇、甲醇和丙酮。为了取得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。第29页有机溶剂沉淀影响原因1)温度：多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度尤其敏感，温度稍高就会引发变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，所以必须预冷，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须迟缓且不停搅拌以免局部过浓。普通规律是温度越低，得到蛋白质活性越高。2)样品浓度：低浓度样品回收率低，要使用百分比更大有机溶剂进行沉淀。高浓度样品，能够节约有机溶剂，降低变性危险，但杂蛋白共沉淀作用大。通常使用5mg/mL20mg/mL蛋白质初浓度为宜。第30页3)pH值：选择在样品稳定pH值范围内，通常是选在等电点附近，从而提升此沉淀法分辨能力。4)离子强度：盐浓度太大或太小都有不利影响，通常盐浓度以不超出5为宜，使用乙醇量也以不超出原蛋白质水溶液倍体积为宜，少许中性盐对蛋白质变性有良好保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。沉淀所得固体样品，假如不是马上溶解进行下一步分离，则应尽可能抽干沉淀，降低其中有机溶剂含量，如若必要能够装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品生物活性。第31页2.3.1.3 选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法这一方法是利用生物大分子与非目标生物大分子在物理化学性质等方面差异，选择一定条件使杂蛋白等非目标物变性沉淀而得到分离提纯。热变性利用生物大分子对热稳定性不一样，加热升高温度使非目标生物大分子变性沉淀而保留目标物在溶液中。表面活性剂和有机溶剂变性使那些对表面活性剂和有机溶剂敏感性强杂蛋白变性沉淀。通常在冰浴或冷室中进行。选择性酸碱变性利用对pH值稳定性不一样而使杂蛋白变性沉淀。通常是在分离纯化流程中附带进行分离纯化步骤。第32页2.3.1.4 等电点沉淀法等电点沉淀法利用含有不一样等电点两性电解质，在到达电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，能够利用此法进行初步沉淀分离。因为许多蛋白质等电点十分靠近，而且带有水膜蛋白质等生物大分子仍有一定溶解度，不能完全沉淀析出，所以，单独使用此法分辨率较低，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其它沉淀剂一起配合使用，以提升沉淀能力和分离效果。此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目标物。第33页2.3.1.5 有机聚合物沉淀法有机聚合物沉淀法有机聚合物是六十年代发展起来一类主要沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶纯化。其中应用最多是“聚乙二醇”【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n4)】(PolyethyleneGlycol简写为PEG)，它亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围分子量，在生物大分子制备中，用较多是分子量为60000PEG。本方法优点是：操作条件温和，不易引发生物大分子变性。沉淀效能高，使用极少许P“EG即能够沉淀相当多生物大分子。沉淀后有机聚合物轻易去除。第34页2.3.2 透析透析自ThomasGraham1861年创造透析方法至今已经有一百多年。透析已成为生物化学试验室最简便最惯用分离纯化技术之一。在生物大分子制备过程中，除盐、除少许有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析技术。透析只需要使用专用半透膜即可完成。保留在透析袋内未透析出样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外溶液称为“渗出液”或“透析液”。截留分子量MwCO通常为1万左右。用1BaCl2检验(NH4)2SO4，用1AgNO3检验NaCl、KCl等。第35页2.3.3超滤超出滤即超滤，自代问世后，直至60年代以来发展快速，很快由试验室规模分离伎俩发展成主要工业单元操作技术。超滤现已成为一个主要生化试验技术，广泛用于含有各种小分子溶质各种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）浓缩、分离和纯化。超滤是一个加压膜分离技术，即在一定压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径特制薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜一边，从而使大分子物质得到了部分纯化。第36页第37页超滤依据所加操作压力和所用膜平均孔径不一样，可分为微孔过滤、超滤和反渗透三种。微孔过滤所用操作压通常小于4104Pa，膜平均孔径为500埃14微米（1微米104埃），用于分离较大微粒、细菌和污染物等。超滤所用操作压为4104Pa7105Pa，膜平均孔径为10100埃，用于分离大分子溶质。反渗透所用操作压比超滤更大，常到达35105Pa140105Pa，膜平均孔径最小，普通为10埃以下，用于分离小分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等。第38页超滤技术优点是操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂，尤其是超滤技术试验条件温和，与蒸发、冰冻干燥相比没有相改变，而且不引发温度、pH改变，因而能够预防生物大分子变性、失活和自溶。在生物大分子制备技术中，超滤主要用于生物大分子脱盐、脱水和浓缩等。超滤法也有一定不足，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，普通只能得到1050浓度。第39页超滤技术关键是膜。惯用膜是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者混合物制成。近年来发展了非纤维型各向异性膜，比如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在pH114都是稳定，且能在90下正常工作。超滤膜通常是比较稳定，能连续用12年。超滤膜基本性能指标：水通量（cm3/(cm2h)）；截留率（以百分率表示）；化学物理稳定性（包含机械强度）等。超滤装置由若干超滤组件组成。分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型。因为超滤法处理液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易粘附和沉积于膜表面上，造成严重浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键问题，要克服浓差极化，通常可加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。第40页2.3.4 冰冻干燥冰冻干燥冰冻干燥机是生化与分子生物学试验室必备仪器之一，因为大多数生物大分子分离纯化后最终产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固体产品，最好方法就是冰冻干燥，因为生物大分子轻易失活，通常不能使用加热蒸发浓缩方法。冰冻干燥是先将生物大分子水溶液冰冻，然后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉。冰冻干燥原理可用溶剂三相点相图来说明，见图6：第41页第42页当温度在三相点O以下，将压力降至OC线以下，溶剂（通常是水）就能够由固相直接升华为汽相。冰：40上方蒸汽压为0.1mmHg，60上方蒸汽压为0.01mmHg。1克0冰变成0蒸汽需吸热580千卡，容器外壁上会挂霜。突出优点：样品不起泡，不暴沸。得到干粉样品不粘壁，易取出。冰干后样品是疏松粉末，易溶于水。第43页样品溶液：样品要溶于水，不含有机溶剂，不然冰点降低，样品易融化，起大量泡沫，使样品变性，污染真空泵油。样品要予先脱盐，不然冰冻后易融化。样品缓冲液在冰冻时pH可能会有较大改变需加入pH稳定剂，如糖类和钙离子等。样品溶液浓度不要过稀，比如蛋白质浓度不低于15mg/mL为宜。第44页装样品溶液容器：用各种尺寸培养皿盛样品溶液，液层不要太厚，能够使用安瓿并和青霉素小并。用烧杯时液层厚度不要超出2cm。冻干稀溶液时会得到很轻绒毛状固体样品，轻易飞散而损失和造成污染，因而要用刺了孔薄膜或吸水纸包住杯口，刺孔不要过小过少，不然会影响冻干速度。溶液冰冻：可用干冰乙醇低温浴速冻，边冻边旋转形成很薄冰冻层，能够大大加紧冻干速度。第45页冻干：样品全部冻干前，不要轻易摇动，以防水蒸汽冲散冻干样品粉末。若外霜消失，则说明样品已冻干，或是仅剩样品中心小冰块，再稍加延长冻干时间即可。冻干后要及时取出样品，以免样品在室温下仃留时间过长而失活。仃真空泵时要先放气，以免泵油倒灌。放气时要迟缓，以免气流冲散样品干粉。样品冻干后要及时密封冷藏，以防受潮。真空泵要经常检验油面和油色，油面过低和油色发黑，则需换油。第46页2.3.5样品保留样品保留生物大分子制成品正确保留极为主要，一旦保留不妥，辛辛劳苦制成样品失活、变性、变质，使前面全部制备工作化为乌有，损失惨重，全功尽弃。影响生物大分子样品保留主要原因有：空气：空气空气影响主要是潮解、微生物污染和自动氧化。温度：每种生物大分子都有其稳定温度范围，温度升高10，氧化反应约加紧数倍，酶促反应增加13倍。第47页水份：样品本身所带水份和由空气中吸收水份。水能够参加水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、离解和霉变。光线：一些生物大分子能够吸收一定波长光，使分子活化不利于样品保留，尤其日光中紫外线能量大，影响最大，样品受光催化反应有变色、氧化和分解等，通称光化作用。所以样品通常都要避光保留。样品pH：保留液态样品时注意其稳定pH范围，正确选择保留液态样品缓冲剂种类和浓度十分主要。时间：生化和分子生物学样品不可能永久存活，不一样样品有其不一样使用期，所以，保留样品必须写明日期，定时检验和处理。第48页现以保留蛋白质和酶为例：低温下保留：通常要保留于520，70保留最理想。极少数酶能够耐热：如核糖核酸酶能够短时煮沸；胰蛋白酶在稀HCl中能够耐受90；蔗糖酶在5060能够保持15min30min不失活。还有少数酶对低温敏感，如鸟肝丙酮酸羧化酶。制成干粉或结晶保留：蛋白质和酶固态比在溶液中要稳定多。固态干粉制剂放在干燥剂中可长久保留。第49页在保护剂下保留：惰性生化或有机物质：如糖类、脂肪酸、牛清白蛋白、氨基酸、多元醇等，以保持稳定疏水环境。中性盐：有一些蛋白质要求在高离子强度（1mol/L4mol/L或饱和盐溶液）极性环境中才能保持活性。惯用MgSO4、NaCl、(NH4)SO4等。使用时要脱盐。巯基试剂：一些蛋白质和酶表面或内部含有半胱氨酸巯基，易被空气中氧缓馒氧化为磺酸或二硫化物而变性，保留时可加入半胱氨酸或巯基乙醇。第50页2.3.6分离纯化方法选择分离纯化方法选择制备生物大分子方法能够粗略地分类以下：以分子大小和形态差异为依据方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。以溶解度差异为依据方法：盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。以电荷差异为依据方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。以生物学功效专一性为依据方法：亲和层析等。第51页早期分离纯化1)特点：粗提取液中物质成份十分复杂。欲制备生物大分子浓度很稀。物理化学性质相近物质很多。希望能除去大部分与目标产物物理化学性质差异大杂质。2)对所选方法要求：要快速、粗放。能较大地缩小体积。分辨力无须太高。负荷能力要大。第52页3)可选取方法：吸附；萃取；沉淀法（热变性、盐析、有机溶剂沉淀等）；离子交换（批量吸附、胖柱交换）；亲和层析等。第53页晚期分离纯化1)可选取方法：吸附层析、盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、等电聚焦制备电泳、制备HPLC等。第54页2)要注意一些问题：盐析后要及时脱盐。用凝胶过滤时怎样缩小上样体积，因为凝胶层析柱上样体积只能是柱床体积1/101/6，也能够使用串联柱以加大柱床体积。必要时也能够重复使用同一个分离纯化方法，比如：分级有机溶剂沉淀、分级盐析、连续两次凝胶过滤、离子交换层析等。第55页分离纯化步骤前后要有科学安排和衔接，尽可能降低工序，提升效率。比如吸附不能够放在盐析之后，以免大量盐离子影响吸附效率；离子交换要放在凝胶过滤之前，因为离子交换层析上样量能够不受限制，只要不超出柱交换容量即可。分离纯化后期，目标产物纯度和浓度都大大提升，此时对于很多敏感酶极易变性失活，所以操作步骤要连续、紧凑，尽可能在低温下（如在冷室中）进行。得到最终产品后，必要时要马上冰冻干燥，分装并写明标签，20或70保留。第56页