槲树不同外植体愈伤组织诱导及继代培养研究.pdf

北京农学院学报2 0 2 4，39（2）：10 3-10 7Journal of Beijing University of Agriculturehttp:/doi:10.13473/ki.issn.1002-3186.2024.0218树不同外植体愈伤组织诱导及继代培养研究白心远1.2，张啸1-2，刘腾，赵志荣4，赵乾龙4，冷平生1，胡增辉1.2*（1国家林业草原古树健康与古树文化工程技术研究中心/园林学院北京农学院，北京10 2 2 0 6；2城乡生态环境北京实验室，北京10 2 2 0 6；3北京市房山区园林绿化局，北京10 2 48 8；4北京市房山区上方山国家森林公园管理处，北京10 2 40 6)摘要：【目的】以树（Quercusdentata）的根与叶为外植体，以期筛选出愈伤组织诱导和继代培养的适宜条件，为树组培快繁体系的建立提供支撑。【方法】在WPM、M S、1/2 M S三种培养基中，加人不同浓度的NAA和6-BA，以树幼苗根与叶为外植体诱导愈伤组织，记录、分析和比较不同条件下的诱导率。再将根诱导后的愈伤组织接种于WPM培养基中，添加不同浓度的2，4-D和6-BA进行愈伤组织的增殖，计算和比较增殖系数。【结果】叶片诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+NAA1.0mg/L+6-BA0.5mg/L。根诱导愈伤组织的最佳的培养基为WPM+NAA2.0mg/L十6-BA1.0mg/L。经比较，以根作为外植体的诱导率高于叶片。愈伤组织增殖的最佳培养基为WPM+2，4-D 1.2 m g/L+6-BA 0.9 m g/L。【结论】筛选出了最适合树愈伤组织诱导和增殖的培养基配方，为树组培快繁体系的建立奠定了基础。关键词：树；叶片；根；愈伤组织；植物激素；组织培养中图分类号：S792.99文章编号：10 0 2-318 6（2 0 2 4）0 2-0 10 3-0 5文献标志码：AStudies on callus tissue induction and subculture fromdifferent explants of Quercus dentataBAI Xinyuan 2,ZHANG Xiaol-2,LIU Teng,ZHAO Zhirong,ZHAO Qianlong,LENG Pingsheng,HU Zenghuil.2*(1.National Forestry and Grassland Ancient Tree Health and Ancient Tree Culture Engineering and Technology ResearchCenter/College of Landscape Architecture,Beijing University of Agricultural,Beijing 102206,China;2.Beijing Laboratory ofUrban and Rural Ecology and Environment,Beijing 102206,China;3.Fangshan District Landscape and Greening Bureau,Beijing 102488,China;4.Beijing Fangshan District Shangfang Mountain NationalForest Park Management Office,Beijing 102406,China)Abstract:ObjectiveJIn this study,the roots and leaves of Quercus dentata were used as explants to screen the optimal condi-tions of callus tissue induction and subculture,which can support the establishment of tissue culture and rapid propagation sys-tem for Q.dentata.MethodsJ In the WPM,MS and 1/2MS medium containing different concentrations of NAA and 6-BA,theexplants of roots and leaves from.Q.dentata seedling were cultured to induce callus tissue,and the induction rates were recor-ded,analyzed,and compared.Then the induced callus tissue from roots was inoculated into WPM medium with different concen-trations of 2,4-D and 6-BA to proliferate,and the proliferation coefficients were calculated and compared.ResultsJ The optimalmedium for the induced callus tissue of leaves was MS medium containing 1.O mg/L NAA and 0.5 mg/L6-BA.The optimalmedium for the induced callus tissue of roots was WPM medium containing 2.O mg/L NAA and 1.O mg/L 6-BA.After com-parison,the induction rate of root explants was higher than that of leaves.WPM medium containing 1.2 mg/L 2,4-D and 0.9mg/L 6-BA was found to be optimal for callus tissue proliferation.Conclusion In this study,the optimal medium formulationfor the induction and proliferation of Q.dentata callus tissue was successfully screened out,which laid the foundation for estab-收稿日期：2 0 2 3-12-0 9基金项目：北京市教委生态修复工程学高精尖学科建设项目第一作者：白心远（2 0 0 0 一），硕士研究生，研究方向为植物生理生态，E-mail：2 8 48 7 7 2 6 35 q q.c o m通信作者：胡增辉（198 0 一），教授，硕士生导师，研究方向为植物生理生态，E-mail：b u a h u z e n g h u i 16 3.c o m104北京农学院学报第39卷lishing tissue culture and rapid propagation system of Q.dentata.Keywords:Quercus dentata;leaf;root;callus tissue;phytohormone;tissue culture树（Quercusdentata）为壳斗科栎属（Q u e r c u s）落叶乔木，是北京地区重要的乡土生态景观树种。榭树树体高大，抗逆性强，秋叶鲜红，具有极高的生态和观赏价值。北京山区的榭树资源丰富，但由于基础研究薄弱，育种和繁育技术严重滞后，导致其在北京平原地区的园林绿化中少有应用。快速繁殖育苗技术是实现树园林绿化应用的基础，而组织培养技术是进行优良株系快速扩繁的最优途径2 。有关木本植物的组织培养技术已有较多的报道3-8 。栗属（Castanea)植物是开展组织培养较早的壳斗科木本植物之一。在目前广泛栽培的栗属物种中，欧洲栗（Castanea sativa）已经在愈伤组织的诱导、微体繁殖、体细胞胚状体发生等方面开展了一定的研究9.10 。选择合适的培养基附以适当浓度配比的细胞分裂素或生长素能显著促进栗属植物愈伤组织的形成和增殖。苏冬梅等以韶栗（C.mollissima)茎段为材料，筛选出了最佳诱导愈伤组织的培养基为6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L111。自从2 0 世纪8 0 年代以来，在栎属植物中，已经开展了辽东栎（Q.liaotungensis）、蒙古栎（Q.mongolica）及栓皮栎（Q.uariabilis）等树种组培再生体系的探索和研究12 。吕秀立等利用苏玛栎(Q.shumardii）的茎和叶作为外植体，在MS十2,4-D 2 mg/L十KT 0.2 mg/L 的组合中获得了较多的愈伤组织；而在增殖过程中，6-BA3.0mg/L十NAA0.5mg/L的培养效果最好13。同属壳斗科栎属植物的树仍主要以播种育苗的方式进行苗木繁育14-18 ，尚未开展组织培养技术的探索，再生体系尚未建立，严重阻碍了优良株系的繁育和推广及新品种的创制。确定树外植体愈伤组织诱导的最佳条件是建立组织培养再生体系的基础。该研究分别以树实生幼苗的根和叶为外植体，开展愈伤组织诱导和增殖技术研究，以期找到最适合诱导和继代培养树愈伤组织的培养基，为榭树组织培养扩繁体系的建立奠定基础，进一步为树优良株系的繁育和推广，及遗传转化体系的建立提供技术支撑。1材料与方法1.1植物材料挑取新鲜、饱满、种皮完整、含水量高的树种子，在7 5%乙醇溶液中浸泡3min，随后在5.5%6.5%次氯酸钠溶液中浸泡12 min，用无菌水冲洗4次，并于无菌状态下用解剖剪和镊子剥去种皮，切去表面胚乳,接种到WPM培养基中。接种后将培养瓶放置于培养室，在2 3土2、光照周期为16 h/d的条件下培养，第30 天时,培育出实生苗,取其根和叶作为外植体，进行试验。1.2试验方法1.2.1榭树愈伤组织诱导采用L。（34）正交试验设计（表1），共3个因素，分别为A：NA A 浓度、B：6-BA浓度、C:培养基种类。用无菌叶片、无菌根为外植体。共设置9个组合，每个组合重复两次。培养基分别为WPM、M S、1/2 M S,激素梯度设置为6-BA(0.5 mg/L、1.0 m g/L、2.0 m g/L)、NA A(1.0、2.0、3.0 m g/L）。所有培养基均添加6 g/L琼脂和30g/L蔗糖，用1 mol/L NaOH 溶液调节 pH5.86.0。叶片处理为垂直叶脉横切12 刀，切断叶脉，近轴面朝上放置。根处理为取根尖部2 3cm,接种于培养基，每个重复接种12 个外植体。黑暗培养2 0 d后，观察愈伤组织的生长情况，计算愈伤组织诱导率。愈伤组织诱导率（%）=长出愈伤组织的外植体数/外植体总数10 0%。表1正交试验的因素和水平Tab.1Factors and levels of orthogonal testNAA质量浓度编号Concentration ofNumberNAA/(mg/L)11.0022.0032.0041.0053.0063.0071.0083.0092.001.2.2榭树愈伤组织增殖将根诱导出的愈伤组织转到添加于不同浓度激素的WPM继代培养基中(表2)进行增殖。所有培养基均添加6 g/L琼脂和30g/L蔗糖,用1mol/LNaOH溶液调节pH5.86.0。第14天时，观察愈伤组织状态，计算增殖系数。增殖系数=（增殖量一初始添加量）/初始添加6-BA质量浓度Concentration ofMedium6-BA/(mg/L)2.000.502.001.000.502.000.501.001.00培养基1/2S1/2SMSMSMSWPMWPM1/2MSWPM2024年第2 期量10 0%。拍照记录愈伤组织的大小和颜色。表2 树根和叶愈伤组织增殖试验设计Tab.2Experimental design for the callus tissue proliferationfrom roots and leaves of Quercus dentata编号2,4-D/Number(mg/L)10.4020.8031.2041.0050.5060.251.3数据处理与分析使用MicrosoftExcel和SPSS26.0进行数据分析。2结果与分析2.1树愈伤组织诱导2.1.1榭树叶片诱导愈伤组织体，在含不同激素种类及浓度的不同培养基上培养25d,结果表明，4号处理的培养基诱愈伤导率最高（表3）。方差分析表明,NAA对愈伤组织诱导具有Tab.3Effect of NAA,6-BA,and medium types on the callus tissue induction from Quercus dentata leaves and rootsNAA浓度编号Concentration ofNumberNAA/(mg/L)11.0022.0032.0041.0053.0063.0071.0083.0092.00变异源Source of variationNAA6-BA培养基类型Medium误差Inaccuracies总计Aggregate注：*代表显著性在P0.05水平Note:*represents significance at P 培养基种类6-BA 浓度（表5，即NAA对叶片诱导愈伤组织作用最大。极差分析表明，最佳培养基为MS,NAA最佳浓度为1.0 0mg/L,6-BA最佳浓度为0.50 mg/L（表6)。综合激素、培养基种类对诱导率的影响结果，树叶片愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+NAA1.0mg/L+6-BA 0.5 mg/L。2.1.2榭树根诱导愈伤组织以无菌根为外植体在含不同激素种类及浓度的不同培养基上培养2 5d,结果表明，6 号处理的培养基的诱导率最高（表3）。方差分析表明，激素种类和培养基种类对愈伤组织诱导均无显著影响（表4）。激素种类及浓度和培养基类型对树无菌根愈伤组织诱导的影响按照重要性依次为NAA浓度 培养基种类 6-BA浓度（表5）。极差分析表明，最佳培养基为WPM，NAA最佳浓度为2.0 0 mg/L，6-BA 最佳浓度为培养基叶诱导率MediumLeaf induction rate/%1/2MS72.0015.56ab1/2MS44.507.78bcMS47.5012.02bcMS77.507.78aMS64.0011.31abWPM56.000.00abWPM72.0015.56ab1/2MS45.5016.26bcWPM23.507.78c叶 Leaf显著性FStatisticalsignificance29.31*0.033.770.214.000.20根诱导率Root induction rate/%22.507.78de94.507.78a44.507.78bc94.507.78a16.507.78e94.000a38.507.78cd33.000cd55.507.78b根Root显著性均方FMean square0.020.010.010.36Statisticalsignificance0.060.930.030.970.040.96106Tab.5因素FactorNAA/(mg/L)6-BA/(mg/L)培养基种类MediumA北京农学院学报表5愈伤组织诱导的单因素统计表6 愈伤组织诱导的极差分析Single-factor statistical analysis for the callusTab.6Polar analysis of induced callus tissuetissue induction叶 Leaf极差水平Level叶Leaf1.000.742.000.383.000.540.500.601.000.482.000.58WPM0.50MS0.631/2MS0.54第39卷根Root根Root培养基RangeNAA6BA0.52Medium0.64K12.221.81K21.14 1.440.48K31.641.750.50k10.61k20.54k3R0.190.020.630.520.50B培养基NAA6-BA1.501.561.501.891.941.831.611.44.0.740.600.38 0.480.550.582.2树愈伤组织增殖将根诱导的初代愈伤组织(图1-A)于培养箱中25黑暗培育14d,用体式显微镜观察看到继代培CMedium1.891.561.611.500.500.52 0.500.630.650.610.540.480.540.130.170.110.630.520.500.131mmA.初代愈伤组织；B.继代愈伤组织；C.增殖愈伤组织图1培养的愈伤组织A.Primary callus tissue;B.Subcultured callus tissue;C.Proliferated callus tissueFig.1The callus tissue养愈伤生长状态良好，愈伤组织清晰、颜色透亮（图1-B),具体增殖情况见表7。组合3的愈伤增殖效果最好（图1-C)，增殖量为3.38 g，并且该组合增殖Tab.7Proliferation coefficients of callus tissue successions in different mediums编号Number2,4-D/(mg/L)10.4020.8031.2041.0050.5060.25注：X1为初始接入愈伤组织的质量；X2为黑暗培养14d的愈伤增殖量；X2一X1为2 次愈伤组织质量的差；增殖系数=（增殖量一初始添加量）/初始添加量10 0%Note:X1 is the mass of initially accessed callus tissue;X2 is the amount of proliferated callus tissue in dark culture for 14d;X2-X1 is thedifference in the mass of callus tissue between two times;Proliferation coefficient=(subculture-initial addition)/initial addition X1oo%取得了一定的研究进展19,但作为北方地区重要栎3讨论与结论栎类树种是中国重要的生态景观树种，辽东栎、蒙古栎和栓皮栎等栎属树种的组织培养技术已1mm效率最高,增殖系数为4.0 4。综上所述，得到最佳组的树愈伤组织增殖培养基为WPM十2,4-D1.2mg/L十6-BA0.9mg/L，于黑暗培养箱中培养。表7 不同培养基愈伤组织继代的增殖系数6-BA/(mg/L)X1/g0.300.700.600.760.900.671,800.750.90.0.650.450.75X2/g0.813.243.381.341.540.88类树种的树，其组织培养技术尚未被开发。该研究在前人的基础上，针对树愈伤组织诱导和增殖的培养基配方进行探索，为其组培快繁体系的建立X2-X1/g0.112.482.710.590.890.13增殖系数 Proliferation coefficient0.163.264.040.791.370.172024年第2 期奠定基础。植物生长调节剂是外植体诱导愈伤组织发生的关键因素2 0 1。6-BA、2,4-D 和NAA是常见的生长调节剂，常被用在植物组织诱导过程中2 1。其中,NAA是一种生长素类似物,在一些植物的愈伤组织诱导中具有较高的活性，可以同时诱导和抑制体细胞胚的发生,因此,NAA过高或过低都不能实现愈伤组织的发生2 2 。同理，不同外植体对不同激素各有其不同水平的需求2 3。只有将各种激素合理搭配使用才能达到外植体对激素的特定要求，从而充分发挥激素的调节作用，进而促进体细胞胚的发生和发育2 4。该研究选取了6-BA及NAA为主要植物生长调节剂。2，4-D有促进细胞分裂的作用，在该研究选取2，4-D进行愈伤组织的增殖。但在进行愈伤组织增殖时2，4-D浓度不宜过高，否则会产生很大的抑制效果2 5壳斗科植物常用的基本培养基主要有MS、1/2MS、1/4M S、WPM 等。其中,MS培养基含有较高的硝态氮和铵态氮，是目前应用最广泛的培养基。但徐晨等研究发现，板栗种子在WPM培养基上萌发形成的幼苗最高，长势最好，DKW次之，MS最差2 6 。也有研究显示，对于栎属植物而言，最常用的培养基是MS和WPM基本培养基12 。因此，在进行植物组织培养时，应根据不同的外植体、培养方法、培养目的等要求选用不同的培养基。本研究选用MS、1/2 M S和WPM三种培养基诱导树愈伤组织,用WPM培养基进行愈伤组织的增殖。成功筛选出最适宜树外植体诱导愈伤组织的最佳培养基种类。刘杜玲等研究表明，影响板栗愈伤组织诱导的主次因素为：6-BA浓度 NAA浓度CK,即6-BA对于板栗愈伤组织诱导作用最大2 7 。本次研究最终发现影响树叶片和根诱导愈伤组织主次因素为 NAA浓度、培养基种类、6-BA浓度，即NAA浓度对于树愈伤组织诱导作用最大。与前人的研究相比可以发现，不同植物诱导愈伤组织所需的培养基种类、激素种类和激素浓度各不相同。综上，该研究筛选出了用树根与叶诱导愈伤组织效果最好的培养基和愈伤组织增殖效果最好的激素浓度配比。主要得到以下结论：以树叶片为外植体的最佳愈伤诱导培养基为MS十NAA1.0mg/L十6-BA0.5mg/L;以树根为外植体的最佳的愈伤诱导培养基为WPM+NAA2.0mg/L十6-BA1.0mg/L;并且，根外植体的愈伤诱导率高于叶片。树愈伤组织增殖的最佳培养基为WPM十2，4-D1.2mg/L+6-BA 0.9mg/L。参考文献：1郝汉，曹磊，陈伟楠，等盐胁迫对树幼苗离子平衡及其生白心远等：榭树不同外植体愈伤组织诱导及继代培养研究报，2 0 0 3,2 3(4)：42-46.5莫晓勇，龙腾，彭仕尧，等.桉树嫩枝扦插育苗技术研究.中南林学院学报，2 0 0 2,2 2（4：31-36.6 1刘玉礼，汤险峰，彭兴龙，等，核桃良种壮苗快速繁育技术.经济林研究，2 0 0 3,2 1(1)：52-53.宋锋惠，史彦江，卡德尔.改进培养方法提高组培快繁技术的初探J.经济林研究，2 0 0 3，2 1（4）：57-59.8王晓春.我国柿树繁殖技术研究进展J.经济林研究，2 0 0 2，20(1):49-50.E 9J KWYS R N.Requirements for the uniform growth of calluscultures of four species of castanea JJ.West VirginiaForestry Notes,1987,13:19-24.10MCPHEETERSK.Culture of chestnut（Ca s t a n e a s p p.）i 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