新型生物陶瓷材料对人根尖牙乳头干细胞增殖及成骨分化的影响.pdf

北京口腔医学 2024年第32卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2024，Vol.32，No.2120严密的根管充填能杜绝微渗漏，防止再感染，创造有利于根尖周组织愈合的微环境。根管封闭剂是严密充填根管的材料。理想的根管封闭剂应具有良好的生物相容性和诱导骨修复能力，从而促进根尖周病变愈合1。近年来，生物陶瓷类根管封闭剂因其良好的根尖封闭性、细胞毒性小、抗菌性强和能诱导根尖周钙化组织形成而得到临床广泛应用。c-Root SP 是一种主要成分为硅酸锶、磷酸二氢钙、磷酸二氢钾、二氧化锆的新型国产生物陶瓷根管封闭剂，其价格经济，它在硅酸钙根充材料中添加了硅酸锶，有研究显示硅酸锶生物相容性、阻射性更好2,3，能抑制肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF-）,具有镇痛作用4，但其各项性能仍需要更多研究来评价。具有良好细胞相容性及成骨潜力的封闭剂有助于促进根尖周组织修复，在很大程度上可以提高根管治疗的成功率，因此，评估 c-Root SP 与根尖周组织接触后是否能具有良好的生物活性，刺激细胞发生特异性变化，促使组织愈合的性能尤为重要。本研究通过评价 c-Root SP对人根尖牙乳头干细胞(human stem cells from apical papilla，hSCAPs)的细胞增殖及骨诱导能力，为其应用于临床根管治疗提供科学依据。新型生物陶瓷材料对人根尖牙乳头干细胞增殖及成骨分化的影响张昊 石劭婧 张琛【摘要】目的 评估新型生物陶瓷类材料 c-Root SP 对人根尖牙乳头干细胞(hSCAPs)的细胞增殖及骨诱导能力。方法 制备不同浓度 c-Root SP 浸提液，采用 CCK-8 法检测其对 hSCAPs 的细胞增殖情况，使用碱性磷酸酶(ALP)活性测定法测定 ALP 酶水平和茜素红染色法观察钙化结节形成情况，数据采用单因素方差分析，与iRootSP 对比，评价 c-Root SP 促进细胞增殖及骨诱导能力。结果 c-Root SP 对 hSCAPs 的细胞增殖具有浓度依赖性，1/10 浓度浸提液增殖水平最好，c-Root SP1/5、1/10、1/1000 浓度浸提液对 hSCAPs 的细胞增殖的影响显著高于同浓度 iRoot SP 浸提液（P 0.05）。成骨方面，矿化诱导 7 天，iRoot SP ALP 活性显著高于 c-Root SP（P 0.05），矿化诱导 14 天 c-Root SP 矿化结节显著多于 iRoot SP。结论 c-Root SP 具有对 hSCAPs 的良好细胞增殖及骨诱导能力，与 iRoot SP 相似。【关键词】人根尖牙乳头干细胞；c-Root SP；细胞增殖；骨诱导【中图号】R783.1【文献标识码】A【DOI】10.20049/j.bjkqyx.1006-673X.2024.02.010Efects of new bioceramic materials on proliferation and osteogenic differentiation of human stem cells from apical papilla ZHANG Hao,SHI Shao-jing,ZHANG Chen.Department of Endodontics,Capital Medical University School of Stomatology,Beijing 100050,China【Abstract】Objective To evaluate the ability of c-Root SP,a new bioceramic materials,on cell proliferation and bone induction in human stem cells from the apical papilla(hSCAPs).Methods Different concentrations of c-Root SP extracts were prepared.The cell proliferation of hSCAPs was detected by CCK-8 method,ALP enzyme level was examined by alkaline phosphatase(ALP)activity method and the formation of calcified nodules was observed by alizarin red staining method.Single factor analysis of variance was used.The cells proliferation and bone induction ability of c-Root SP were evaluated and compared with iRoot SP.Results c-Root SP had a concentration dependent effect on the cell proliferation of hSCAPs,with a 1/10 concentration extract having the best proliferation level.The effects of c-Root SP 1/5,1/10,and 1/1000 concentration extracts on hSCAPs cell proliferation were significantly higher than those of iRoot SP extracts at the same concentration(P0.05).In terms of osteogenesis,after 7 days of mineralization induction,the activity of iRoot SP ALP was significantly higher than that of c-Root SP(P0.015；Y:碱性磷酸酶 ALP sigma unit/min/mg protein)。成骨分化诱导后的矿化情况观察-茜素红染色实验：取成骨诱导 14 d 后的培养板（要求每实验组至少 3 个独立培养副孔），倒置显微镜下观察可见似河底淤泥样细胞间质沉淀物后，弃去成骨分化诱导培养基，预热 PBS 洗涤 2 次，加入 2 mL 70%乙醇，置于 4环境内固定至少 1 h；弃去孔内的 70%乙醇固定液，双蒸水洗涤 2 次，每孔加入 2 mL 40 mmol/L 茜素红溶液（ARS，pH=4.2），室温下染色 15 min，肉眼不时观察鲜艳红色着色情况；弃去 ARS 染色液，双蒸水洗涤 45 次，继续轻摇洗涤 15 min 至剩余较少非特异性染色；扫描仪透射模式采集图像。3.统计学分析采用 SPSS21.0 软件对数据进行统计分析，组间采用单因素方差分析，P0.05认为差异有统计学意义。结 果1.c-Root SP 和 iRoot SP 对 hSCAPs 增殖能力的影响CCK-8 法检测 c-Root SP，iRoot SP 对人根尖牙乳头细胞增殖能力的影响，酶标仪于 450 nm 波长下测量各孔吸光度 OD 值见表 1。如图 1 所示，CCK-8 法检测不同浓度 c-Root SP、iRoot SP 浸提液对 hSCAPs 增殖能力的影响，在 3 d 时，c-Root SP 浸提液随浓度逐渐减小而呈现细胞增殖水平先升高后降低的情况，1/10 浓度浸提液细胞增殖水平最好，1/10 浓度、1/100 浓度、1/1000浓度浸提液与对照组之间有显著差异（P 0.05），iRoot SP1/100 浓度的浸提液处理后细胞增殖水平最好，iRoot SP 1/5 浓度、1/10 浓度、1/100 浓度、1/1000 浓度与对照组之间均有显著差异（P 0.05），c-Root SP 与 iRoot SP浸提液其余同浓度有显著差异（P 0.05）。表 1 CCK-8 法检测不同浓度 cRoot SP 和 iRoot SP 浸提液对 hSCAPs 增殖能力的影响（xs）浓度cRootSPiRootSP对照1/1000 浓度0.630.040.760.030.480.021/100 浓度0.870.030.850.031/10 浓度0.990.080.640.021/5 浓度0.440.030.610.01注：*：与对照组相比，P 0.05图 1 CCK-8 法检测不同浓度 cRoot SP、iRoot SP 浸提液对hSCAPs 增殖能力的影响北京口腔医学 2024年第32卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2024，Vol.32，No.21232.c-Root SP 和 iRoot SP 对 hSCAPs ALP 活 性的影响如图 2 所示 c-Root SP，iRoot SP 处理 hSCAPs后，于 7 d 进行 ALP 活性测定。1/100 浓度 c-Root SP 浸提液对 hSCAPs ALP 活性的影响实验结果为2.520.02，1/100 浓度 iRoot SP 浸提液对 hSCAPs ALP 活性的影响实验结果为 2.800.01，空白对照为 2.310.01，c-Root SP，iRoot SP 和对照组之间均有显著差异（P 0.05），iRoot SP ALP 活性最高。3.c-Root SP，iRoot SP 对 hSCAPs 矿化结节形成能力的影响观察矿化诱导 14 d 矿化结节形成情况，结果显示 c-Root SP 矿化结节显著多于 iRoot SP（图 3）。讨 论根管治疗的目标是彻底去除根管内的感染源，杜绝再感染，促进根尖周病变的愈合6。严密的根尖封闭是根管治疗成功的关键。根管封闭剂应该为根尖周病变的愈合提供良好的生物学环境，促进细胞的增殖和成骨分化7。hSCAPs 是存在于根尖未发育完全年轻恒牙的根尖牙乳头组织中的间充质干细胞群，即使在存在炎症的情况下，也能保持活性和干性，并在相同条件下比其他牙髓干细胞有更好的成骨分化8,9。因此，本研究把评估新型生物陶瓷类材料 c-Root SP 对 hSCAPs 的细胞增殖及骨诱导能力作为研究目标。本研究使用材料的浸提液用于模拟根管封闭剂释放物质对细胞增殖的影响。按照 GB/T16886.12要求的标准表面积和浸提液体积，计算浸泡每块材料所需的培养基体积，根据以往的研究结果和初步数据，制备成 1/5、1/10、1/100 及 1/1000 不同比例稀释的浓度浸提液，用于评价 c-Root SP 对hSCAPs 的细胞增殖能力，并与 iRoot SP 对比。结果提示细胞增殖水平具有一定浓度依赖性，1/10 浓度浸提液细胞增殖水平最好，这与钙离子浓度变化对细胞增殖的影响相关10。c-Root SP 与 iRoot SP在水化固化过程中释放的钙离子可能通过激活线粒体基质脱氢酶，促进细胞增殖，然而过多的钙离子引起的高pH值会导致相邻细胞和培养基蛋白变性，抑制细胞增殖，甚至导致细胞凋亡影响细胞的增殖能力。c-Root SP 除 1/10 浓度浸提液以外细胞增殖水平均显著高于同浓度 iRoot SP 浸提液，这可能和 c-Root SP 除了和 iRoot SP 一样不断释放硅离子、钙离子以外，还释放特有的锶离子，而锶离子和硅离子能协同刺激细胞增殖而不失去干性有关3。本研究通过测定成骨诱导 ALP 值和茜素红染色观察矿化结节形成情况的实验方法评估 c-Root SP、iRoot SP 浸提液对 hSCAPs 的骨诱导能力。ALP 参与牙齿和骨等矿化组织的形成、代谢和再生，其活性与基质矿化能力成正比，是 hSCAPs 成骨分化的早期标志物11。茜素红能与钙盐以鳌和方式形成复合物，产生橘红色沉积12。钙盐变化是骨细胞增殖分化和骨组织成骨潜能的标志之一。结果显示 iRoot SP 与c-Root SP 均具有诱导 hSCAPs 成骨分化的能力。成骨诱导性可能与 c-Root SP 和 iRoot SP 在水化固化过程中释放的锶离子、钙离子、硅离子，以及局部形成碱性环境相关13。研究表明锶离子、钙离子和硅离子能抑制破骨细胞活性和促进成骨细胞分化14，15。碱性环境能中和乳酸，阻止矿物质注：*：与对照组相比，P 0.05图 2 c-Root SP，iRoot SP 对 hSCAPs ALP 活性的影响图 3 c-Root SP、iRoot SP 与 hSCAPs 共培养 14 d 后茜素红染色结果 A：对照组；B:iRoot SP；C：c-Root SP北京口腔医学 2024年第32卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2024，Vol.32，No.2124的溶解，激活碱性磷酸酶，形成矿化结节，促进硬组织修复。矿化诱导 14 d 结果显示 c-Root SP 形成矿化结节显著多于 iRoot SP 形成的矿化结节，这可能与硅酸锶水合物（Sr-S-H）复合羟基磷灰石组合物在起到填充密封作用的同时，与硅酸钙水合物（C-S-H）相比，具有更好的促进成骨、提高骨强度的作用。c-Root SP 具有对 hSCAPs 良好的细胞增殖及骨诱导能力。作为一种新型国产根管封闭剂，c-Root SP 具有潜在的应用价值，但还需要更多的研究证据来阐明其性能。参 考 文 献 1 石洁,曲兴民,尚佳健.iRoot SP根尖封闭剂的疗效评价的Meta分析.北京口腔医学,2021,29(5):303-308.2 Jing Y,Gong T,Duan C,et al.In vitro cytocompatibility and osteogenic potential of calcium silicate-based dental cements in a root canal-filling model.J Int Med Res,2020,48(4):300060519894801.3 Xing M,Wang X,Wang E,et al.Bone tissue 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日收稿）北京口腔医学杂志投稿系统新版上线启事北京口腔医学网站新版上线，新投稿件请作者重新注册帐号并投稿，之前投稿成功的稿件请勿重复投稿，等待编辑邮件通知即可，网址为：。作者可以通过该系统投稿、查稿、上传修改稿，审稿专家可以进行网上审稿。作者使用该系统时，首先点击网站首页面上的“作者在线注册”按钮，完成投稿、稿件处理信息查询、上传修改稿等相关操作。作者初次使用该系统投稿时，需用自己的真实电子邮箱名获取密码，然后进行下一步操作。网站开始使用时可能存在不完善之处，如有问题，请及时与编辑部联系，电话：[phone]。E-mail:。热诚欢迎投稿。北京口腔医学编辑部