基于铜离子交联改善壳聚糖水凝胶力学性能和抗菌性能的研究.pdf

第 卷 第 期 年 月北京生物医学工程 作者单位：北京市医疗器械检验研究院（北京）北京农业职业学院（北京）通信作者：李鹏。：基于铜离子交联改善壳聚糖水凝胶力学性能和抗菌性能的研究李鹏 杨秀摘 要 目的 壳聚糖（，）分子在碱性氛围（）中通过链缠结以及分子间的低能键（如氢键、配位键等）的相互作用，可以逐步形成网状结构的壳聚糖水凝胶（），但其力学性能较差，生物抗菌活性较低。本文拟通过加入金属铜离子以改善其相关性能。方法 以 和 作为原材料，在 的（体积分数）乙酸水溶液中加入 的壳聚糖，配制浓度为 （质量分数）的壳聚糖溶液。然后向壳聚糖溶液中加入一定量的氯化铜形成壳聚糖溶液。在 的氨气气氛密闭环境中使壳聚糖溶液交联。静置 至水凝胶形成。将水凝胶从培养皿中取出，用蒸馏水洗涤至洗涤液呈中性。制备不同铜离子浓度的壳聚糖铜离子水凝胶，并检测其力学性能指标和生物抗菌活性。结果 铜离子赋予壳聚糖水凝胶良好的溶胀性能和稳定的流变学性能，从而使其力学性能明显提升，且随着铜离子浓度的增加，力学性能更加优异；同时，铜离子还使得壳聚糖水凝胶表现出更好的抗菌性能，使其具有治愈该类细菌的伤口感染的潜力。结论 金属铜离子可以有效改善壳聚糖水凝胶的力学性能及抗菌性能，并使其具有可作为生物医学敷料的应用前景和在生物医学贯通伤等方面表现出潜在的应用价值。关键词 水凝胶；壳聚糖；金属铜离子；力学性能；抗菌性能：中图分类号 文献标志码 文章编号（）本文著录格式 李鹏，杨秀 基于铜离子交联改善壳聚糖水凝胶力学性能和抗菌性能的研究北京生物医学工程，（）：，（）：，；，：（：）【】（）（）（，）（），（），【】；引言壳聚糖（，）是一种来源广泛的天然高分子材料，作为自然界中唯一的碱性多糖，壳聚糖以其良好的抗菌性、抗肿瘤性和增强免疫作用受到越来越多的关注，并且由于较低的毒性也使其在生物医学工程、药物传输、伤口敷料等领域表现出潜在的应用价值。利用壳聚糖分子在碱性氛围中的链缠结，通过分子间的低能键（如氢键、配位键、疏水相互作用等），实现溶胶凝胶的二维界面转换，逐步形成的网状结构水凝胶具有良好的性能。但这种水凝胶的力学性能差，生物抗菌活性低，限制了其在生物材料领域的应用。等发现壳聚糖溶液中加入含有铜离子的硫酸铜溶液后，再滴加碱液使混合溶液 值升高，在此过程中其络合结构会发生变化：在 值到达 以前，硫酸铜只与壳聚糖分子链上的氨基发生反应；值到达 以后处于 位置的羟基开始参与配位；随着 值的升高，反应体系中的羟基也开始参与配位，当体系由酸性转为碱性的时候，两个铜离子之间以两个羟基为桥，形成双羟桥结构，从而使其力学性能提高。等通过配位反应将铜离子固定于壳聚糖材料上面，发现其可以催化肾上腺素和多巴的氧化。等发现壳聚糖配位铜离子后可以用于蛋白质的富集，并且其富集能力受到反应体系中 值和离子强度的影响。这说明铜离子可以影响壳聚糖的生物学性能。故本文以含有铜离子的氯化铜和壳聚糖为主要原料，将壳聚糖溶解在弱酸溶液中后加入氯化铜溶液，经过碱性环境作用形成壳聚糖铜离子水凝胶。通过溶胀性能、流变学性能和抗拉伸性能测试，发现铜离子能明显改善壳聚糖水凝胶的力学性能；通过生物抗菌性能测试，发现铜离子使壳聚糖水凝胶的抗菌活性，尤其是对铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）具有明显的抑制作用。材料和方法 试剂壳聚糖（浙江奥星生物技术有限公司，脱乙酰度，数均分子量为 ），氨水（西陇科学股份有限公司，分析级），乙酸（西陇科学股份有限公司，分析级），硼氢化钠（天津市福晨化学试剂厂，分析纯），氯化铜（天津市福晨化学试剂厂，分析纯）。仪器设备电动搅拌器（北京中兴伟业仪器有限公司，），电子精密天平（上海菁海仪器有限公司），冷冻干燥机（北京德天佑科技发展有限公司，），通用材料试验机（美国 公司，），动态流变仪（德国 公司，），恒温振荡仪（太仓市实验设备厂，），手提式压力灭菌器（合肥华泰医疗设备有限公司，）。壳聚糖铜离子水凝胶的制备首先在 的（体积分数）乙酸水溶液中第 期 李鹏，等：基于铜离子交联改善壳聚糖水凝胶力学性能和抗菌性能的研究加入 的壳聚糖，配制浓度为 （质量分数）的壳聚糖溶液。然后向壳聚糖溶液中加入一定量的氯化铜形成壳聚糖溶液。将 壳聚糖溶液倒入培养皿，并将培养皿放在 的密闭环境内，同时在密闭环境中放置一个装有 氨水的烧杯。静置 至水凝胶形成。将水凝胶从培养皿中取出，用蒸馏水洗涤至洗涤液呈中性。力学性能研究 溶胀性能测试壳聚糖铜离子水凝胶的溶胀性能采用滤袋法进行测试。将 的不同被测样品置于尼龙袋中，然后将其在 的蒸馏水中浸泡相同的时间取出，除去尼龙袋上多余的溶液后称其质量。时刻的溶胀倍率可以用下式来计算：溶胀倍率 式中：为时间 时溶胀水凝胶的质量；为样品的干重。重复 次平行试验，溶胀倍率取 次实验的平均值。流变学性能测试通过使用配有集合平行板（直径为 ）的 仪（，）来测定水凝胶样品的储能模量（）和损耗模量（），得到样品的流变性能。应变为 时，和 的角频率函数在 、扫频 条件下测得。在应变、角频率 ，相对温度以 的速率由 上升至 的条件下测试温度效应。抗拉伸性能测试壳聚糖铜离子水凝胶的力学性能通过测定其抗拉 强 度（）来 表 征，测 试 工 具 为 （，）。将样品切成哑铃形，的稳定应变率下拉伸，直至断裂。每次实验重复 组，取平均值。抗菌性能研究壳聚糖铜离子水凝胶抗菌性能通过 等描述的琼脂扩散实验来测定。实验细菌的培养方法：配制 （质量分数）（）肉汤液体培养基（溶菌肉汤），分装于试管中；取含有铜绿假单胞菌（，）的冻存管，移取菌液至含 肉汤液体培养基的试管中，于、的恒温振荡器中培养 。壳聚糖水凝胶和壳聚糖铜离子水凝胶切割成圆盘状，置于接种了菌落的营养琼脂培养皿中，在 下培养 ，拍照，以备进一步评估。本实验共针对 种不同的菌种，包括革兰氏阴性大肠杆菌（）、铜绿假单胞菌（）、金黄色葡萄球菌（）、金黄色葡萄球菌亚种（）。采用抑菌圈法对含铜离子壳聚糖敷料的体外抗菌性能进行研究。配制 固体培养基，置于手提式压力灭菌器中 、灭菌。灭菌后待培养基温度降至 左右，在超净工作台将培养基倒入无菌培养皿中，待其自然冷却，凝固。取培养 的铜绿假单胞菌菌液稀释至活菌浓度为 ，取 稀释后的菌液均匀涂抹在固体培养基表面。用打孔器在含铜离子壳聚糖敷料上裁剪直径为 的圆片，用无菌镊子将敷料样品贴于涂菌的平板表面，每个涂菌平板平行贴放不同浓度的敷料，将培养皿盖好置于 恒温培养箱中培养 ，观察结果并拍照。重复实验 次，选择均匀且完全无菌的环进行抑菌圈的测量。结果与分析 壳聚糖铜离子水凝胶的制备如表 所示，以 所述的方法配制不同铜离子浓度的壳聚糖铜离子水凝胶。表 壳聚糖水凝胶和壳聚糖铜离子水凝胶的组成 样品壳聚糖的质量分数 氯化铜的质量分数 水凝胶铜离子浓度（）壳聚糖铜离子水凝胶力学性能分析 水凝胶溶胀性能分析图 为不同铜离子浓度的壳聚糖铜离子水凝北京生物医学工程 第 卷胶冷冻干燥后在蒸馏水中的溶胀倍率曲线。结果显示，当铜离子浓度为 时，壳聚糖铜离子水凝胶吸水速率较慢，溶胀速率也较慢；随着溶胀时间的延长，在 时溶胀率达到最大值，约为初始的 倍。随着水凝胶中铜离子浓度的增加，吸水速率明显加快，溶胀倍率显著提高，溶胀饱和时间缩短，当铜离子浓度达到 时，水凝胶在 以内达到溶胀饱和，并达到最大溶胀倍率为 倍。同时可以看出当溶胀时间延长到 以上后，水凝胶始终保持稳定的溶胀倍率，这表明上述条件下制备的壳聚糖铜离子水凝胶中的物理交联结构比较稳定，这是由壳聚糖中的氨基和之间形成的配位键造成的。随着铜离子浓度增加，虽然氨基和 之间形成配位键，但由于水凝胶中的链缠结、疏水效应和氢键更强，使得冷冻干燥后的水凝胶孔隙和孔隙率增大，在溶胀动力学曲线上表现为更快的溶胀饱和速率和更高的溶胀倍率，从而改善力学性能。同时，这是生物材料应用的一项重要指标。图 不同铜离子浓度的壳聚糖铜离子水凝胶在冷冻干燥后的溶胀倍率曲线 水凝胶流变学特性分析在凝胶的形成过程中储能模量（）和损耗模量（）的变化可以表征凝胶内部结构的变化。储能模量是指材料储存弹性形变的能力，常用来表征固体组分的黏弹性行为。损耗模量又称黏性模量，是指材料在发生形变时由于黏性形变而损耗的能量大小，常用来反应材料黏性的大小。在溶液状态时，值较低，然而在整个体系向凝胶态过渡尤其在凝胶点附近时，值快速升高并在凝胶点处与损耗模量 曲线相交。凝胶点后，值大于 值，表明具有交联结构的凝胶状材料的形成。图 为壳聚糖水凝胶和不同铜离子浓度的壳聚糖铜离子水凝胶在角频率模式下的流变曲线。壳聚糖水凝胶和壳聚糖铜离子水凝胶的储能模量（）和损耗模量（）在应变为 时的角频率函数如图（）所示，角频率低于 时，壳聚糖水凝胶的 小于，角频率等于 时两者相等。当角频率高于 时壳聚糖水凝胶的大于，表明壳聚糖水凝胶内的相互作用容易被破坏。相反，对于所有的壳聚糖铜离子水凝胶，当角频率低于 时，其 值总是大于其 值，表明壳聚糖铜离子水凝胶主要是弹性水凝胶。同时，水凝胶的 值、值和它们之间的差值都随着的浓度上升而上升，这是因为 浓度较高时，和氨基之间形成了更多的配位键，也这说明了分子间相互作用、氢键的形成和分子链之间的链缠结会使水凝胶呈现更好的弹性，力学性能优异。然而当角频率增大至 以上且随着水凝胶中铜离子浓度增加时，值开始减小，直至与 值相等，同时 与 的平衡值所对应的角频率也随着铜离子浓度的增加，这说明以 和氨基之间的配位键为主的物理相互作用在角频率大于 时被破坏了，同时该角频率会随着铜离子浓度增加向高频率方向移动。在更高的角频率下，由配位作用形成的壳聚糖铜离子水凝胶内的网络结构会被破坏，并将水凝胶由一种弹性固体转变成黏稠液体。这是壳聚糖水凝胶的一个典型特征，值和 值是溶胶凝胶转化的重要指标。温度对壳聚糖水凝胶和壳聚糖铜离子水凝胶的 值和 值的影响如图（）所示。从图中可以看出，无论铜离子的浓度如何变化，从室温到，所有测试的水凝胶的 值都高于 值，说明上述壳聚糖铜离子水凝胶具有良好的热稳定性，不会随着温度的升高而发生水凝胶的结构破坏。水凝胶抗拉伸性能分析对壳聚糖水凝胶的力学性能进行测试发现，在壳聚糖浓度为 时，所形成的水凝胶的最大模量仅为 ，因此上述水凝胶无法获得实际的第 期 李鹏，等：基于铜离子交联改善壳聚糖水凝胶力学性能和抗菌性能的研究图 壳聚糖水凝胶和壳聚糖铜离子水凝胶在角频率（）和温度模式（）下的流变曲线 （）（）应用。同时壳聚糖水凝胶软而脆，不能被切成哑铃形进行拉伸试验。对制备的壳聚糖铜离子水凝胶的力学性能进行研究，不同铜离子浓度条件下制备的水凝胶的强度如图 所示。从图可以看出，随着铜离子浓度的增加，由于 与壳聚糖的配位作用增强，壳聚糖铜离子水凝胶的拉伸强度逐渐增大，最大力学强度达到 ，所形成的水凝胶的刚性增强，弹性形变能力变弱；同时铜离子水凝胶的力学强度在铜离子浓度较低时（），其强度增长速率比较慢（从 到 ）；当 时，水凝胶的力学强度迅速增大（从 到 ）。这是因为在铜离子浓度较低时，壳聚糖的物理交联作用及分子链之间的缠结作用比铜离子与壳聚糖氨基配位作用对其力学强度有更大贡献，由于壳聚糖的物理交联和分子链缠结属于物理作用力，因而其力学强度较小，增长速度较为缓慢；在铜离子浓度较大时，铜离子与壳聚糖氨基配位作用起到主导作用，同时还有壳聚糖的物理交联作用、分子链间的缠结作用以及部分氢键的形成对其力学强度也有较大贡献，因而表现为力学性能较快的增长速率和较高的力学强度。其拉伸强度接近由 等报道的壳聚糖 甘油磷酸酯二钠 棒石（）水凝胶的最大力学强度。图 不同铜离子浓度的壳聚糖铜离子水凝胶的力学强度 水凝胶生物抗菌性能分析图 为壳聚糖水凝胶和壳聚糖铜离子水凝胶对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的抗菌性能，壳聚糖水凝胶对菌种的活性测试中没有观察到抑菌圈，说明壳聚糖水凝胶抗菌性能差；壳聚糖铜离子水凝胶对革兰氏阴性大肠杆菌（）、金黄色葡萄球菌（）、金黄色葡萄球菌亚种（）的活性测试中也没有观察到抑菌圈，说明壳聚糖铜离子水凝胶抗菌性能差。相反，在铜绿假单胞菌（）的琼脂平板上能观察到明显的抑菌圈，说明由于水凝胶中的 带正电，和带负电的细菌易结合，并且易穿透细菌的细胞壁，与细胞内的 和 结合，破坏细菌的蛋白质和呼吸酶从而使细菌的蛋白质发生变性，而蛋白质是生命活动的主要承担者，进而造成细菌的死亡。这说明壳聚糖铜离子水凝胶对铜绿假单胞菌具有出色的抗菌性能，使得它具有治愈该类细菌的伤口感染的潜力。小结高浓度的壳聚糖铜离子水凝胶具有较高的力北京生物医学工程 第 卷图 壳聚糖水凝胶和壳聚糖铜离子水凝胶的抗菌性能 学性能，其拉伸强度明显高于纯壳聚糖水凝胶；并且壳聚糖铜离子水凝胶具有优异的抗铜绿假单胞菌性能，使其在生物医学贯通伤等方面表现出潜在的应用价值。因壳聚糖铜离子水凝胶良好的生物抗菌活性，使其具有用作伤口敷料等生物材料的潜力。下一步将对壳聚糖铜离子水凝胶进行细胞毒性、生物相容性等方面的研究。参考文献 陈曦，俞明珠，刘剑，等绿色化学方法合成儿茶酚 壳聚糖水凝胶的应用厦门大学学报（自然科学版），（）：，（），（）：，（），（）：，：（）（），：，（）：，（）：，：陈煜，刘云飞，唐焕林，等致孔法制备新型 大孔高吸水树脂化工学报，（）：，（）：杨龙强，李荣春，梁少平 新型壳聚糖双季铵盐的制备及其抗氧化活性 应用化学，（）：，（）：，：，：，（）：，：，：张娟，李梦玉，刘思敏，等羟丁基壳聚糖护创敷料无菌检查方法的建立 北京生物医学工程，（）：，（）：张娟，岳卫华 银离子水凝胶涂层导尿管抑菌效力定量检查方法的建立 北京生物医学工程，（）：，（）：陈煜，奚廷斐，张送根，等北京市医用高分子材料在医疗器械产业发展中的现状调研 北京生物医学工程，（）：，（）：（收稿，修回）第 期 李鹏，等：基于铜离子交联改善壳聚糖水凝胶力学性能和抗菌性能的研究