CDGSH铁硫结构域1在肺纤维化和铁死亡中的作用与机制.pdf

基金项目：山东省自然科学基金（）通信作者：刘乃国，：铁硫结构域 在肺纤维化和铁死亡中的作用与机制庞昕洳刘乃国滨州医学院附属医院医学研究中心山东 滨州 【摘要】目的探讨 铁硫结构域 （）基因在肺纤维化和铁死亡中的作用及其氧化应激相关机制。方法将 细胞分为对照组、组、组、组、组共五组，采用 和 技术研究 基因抑制与否对肺纤维化和铁死亡的影响及其机制，加深对肺纤维化与铁死亡关系的认识。结果 和铁死亡诱导剂 处理均可降低 细胞中 钙粘蛋白（）和 的表达，增加 含量、线粒体活性氧（）、羟基壬烯醛（）和 平滑肌肌动蛋白（）的表达。处理抑制了 的表达，增加了 、含量和 的表达水平，降低了 的表达水平。结论 可通过降低 水平，减少氧化应激和脂质过氧化作用，抑制肺纤维化和铁死亡。【关键词】肺纤维化；铁死亡；上皮间质转化（）；【中图分类号】【文献标志码】【文章编号】（）：，【】：，（），（），（），（）（），【】；（）；肺纤维化是一种慢性致死性间质性肺疾病，以细胞外基质异常沉积和肺泡结构严重破坏为特征 。目前，肺纤维化疾病预后极差，治愈率低。因此，寻找新的治疗靶点及治疗策略具有重要意义。铁死亡是一种铁依赖性程序性细胞死亡 ，在形态方面主要表现为线粒体膜收缩，膜密度增加，线粒体嵴减少，核膜完整 ，在生物化学方面表现为铁超载、活性氧（，）水平升高、脂质过氧化产物的积累 。是公认的铁死亡小分子诱导剂 。经博来霉素处理的肺泡 型细胞出现铁积累，铁超载导致线粒体损伤，诱发铁死亡，最终发展为肺纤维化 。铁硫结构域（，）基因位于染色体 ，该基因编码的 蛋白相对分子质滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，量约为 ，是锚定在线粒体外膜上的铁硫蛋白 ，调节线粒体的生物学功能以及线粒体中铁和 的水平 。的缺失导致线粒体铁超载和氧化损伤 。抑制 可增强 介导的线粒体脂质过氧化，进一步促进铁死亡 。稳定 的铁硫簇可能会阻碍线粒体对铁的摄取、脂质过氧化和铁死亡 。虽然铁代谢与肺纤维化和铁死亡密切相关，但铁代谢相关基因 在肺纤维化中的作用尚未见报道，肺纤维化与铁死亡的关系也不清楚。本研究旨在以人类非小细胞肺癌细胞（细胞）为研究对象，研究 在肺纤维化和铁死亡中的作用及其氧化应激相关机制，为丰富肺纤维化的发病机制和寻找新的治疗策略提供科学依据。材料与方法 细胞培养 细胞（普诺赛生命科技有限公司，中国），培养于 基础培养基（普诺赛生命科技有限公司）（公司，德国）培养基中。在 培养箱中，培养。当培养细胞融合度达到 左右时，用 胰蛋白酶消化细胞，进行传代。细胞分组及处理 细胞培养 后随机分为对照组（组）、组（组）、组（组）、组（组）、组（组）组。本研究所用的药物浓度如下：（公 司，德 国），（公司，德国），（公司，美国）。在倒置显微镜下观察细胞形态。分别在处理后 、收集细胞，用于进一步检测。荧光定量 检测使用 试剂（赛默飞公司，中国）提取细胞中总 ，再将提取的总 反转录为 。以 为内参检测 平滑肌肌动蛋白（，）、钙粘蛋白（，）、的表达，反应条件为：，共 个循环。各个基因引物序列见表 。表 用于实时定量 的引物序列基因名称引物（）产物长度 ：测定收集各组 细胞，提取总蛋白，蛋白按每孔 进行上样，用 凝胶进行电泳分离，转移到硝酸纤维素膜上，分别用 一抗（稀释比例为 ）和 一抗（稀释比例为 ）进行 孵育过夜，加入羊抗兔或羊抗鼠偶联二抗，室温孵育 ，使用 化学发光系统进行显影，软件分析条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。细胞活力检测 细胞接种于 孔培养板，各处理组分别于 、后，将 增强 溶液（伊莱瑞特生物科技有限公司，中国）依次加入相应的孔中，在 、条件下孵育 ，使用酶标仪（公司）在 波长处测量吸光度。细胞活力计算公式为：（）（）。线粒体活性氧（）测定不同组 细胞用 试剂工作液（公司，美国）在 避光孵育 ，然后用无血清 培养基洗涤 次。用倒置荧光显微镜拍摄荧光图像（，日本），平均荧光强度用 （）软件量化。细胞内 含量的检测各组细胞在处理 、后收集 细胞，洗涤 次。每个样品加入 缓冲液。混合后置于冰上裂解 ，离心 ，收集上清液。按照 细胞亚铁检测试剂盒（伊莱瑞特生物科技有限公司，中国）的说明测定 水平。使用酶标仪（公司）在 波长处测量吸光度。测定不同浓度下标准样品的吸光度，绘制标准曲线，进而测定样品中的 浓度。羟基壬烯醛（）测定将每组 细胞重悬于 中，用超声波处理器破碎。收集上清液，参照 酶联免疫吸附测定试剂盒（伊莱瑞特生物科技有限公司，中国）的说明测定 水平。用酶标仪（公司）在 处测定反应混合物的光密度（值），用 软件将光密度值转换为 浓度。统计学方法采用 软件分析数据，用 进行绘图。定量数据以（珋 ）表示，进行非参数单因素方差分析，组间比较采用 检验。为差异有统计学意义。结果 各组细胞中 的表达在各时间点 组滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，和 组中 和蛋白质表达水平均显著低于 组的表达（）。组中 及蛋白质表达水平均显著低于 组（）、组（）和 组（）。在处理后 ，与 组比较，组 和蛋白表达量显著降低（），见图 。这说明，处理抑制了 表达，和 处理也 会 抑 制 的 和蛋白表达，且呈现协同作用。和 在各处理组细胞中的表达情况组、组中的 表达量在处理后 高于 组的表达（）。与 组比较，组 表达量在处理后 均升高（），但处理后 、时均降低（）。在处理后 ，组 表达量显著高于 组的表达（），见图 。与 组比较，组 表达量在整个实验过程中均显著降低（）。在处理后 ，组 表达量显著低于 组（）。在处理后 ，组 表达量显著低于 组（），但在处理后 、明显高于 组（）。组各时间点 表达水平均显著低于 组，见图 。检测得到的不同处理组 的蛋白表达；检测各处理组中 蛋白质表达的结果定量并均一化；各组中 表达水平。与 组比较，；与 组比较，；与 组比较，。图 各处理组中 细胞在不同时间点 和蛋白质表达 表达水平；表达水平。与 组比较，；与 组比较，；与 组比较，。图 不同处理后 细胞中 和 表达水平 不同处理后 细胞的形态学变化与 组比较，组、组和 组从处理 开始细胞形态发生明显变化。这些细胞由最初的多边形逐渐转变为成纤维细胞样形态，这提示，细胞形态的改变是由 引起的。组和 组细胞在处理后 开始出现细胞死亡，并呈聚集性细胞死亡现象，细胞死亡数量随着时间的延长逐渐增加，直至 。组细胞在处理后 后出现一定程度的细胞死亡，未见死亡细胞聚集。见图 。细胞活力分析 检测显示，组细胞活力与 组比较无明显变化，从处理后 开始，组细胞活力显著低于 组（）。处理后 ，组细胞活力显著低于 组（），整个时间段细胞活力均低于 组（）。从处理后 开始，组细胞活力显著低于 组（）。见图 。抑制 表达可增强线粒体活性氧（滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，）含量在各时间点 组、组和 组中的 水平均显著高于 组（）。自处理后 ，组的 水平明显高于 组（）和 组（）。从处理后 开始，组 水平显著高于 组，且随时间增加呈上升趋势（）。见图 。抑制 表达可提高细胞内 和 水平与 组比较，组的 水平从处理后 开始显著升高（），从处理后 开始，组的 水平高于 组（）。与 组比较，组 水平在处理后 前升高（），处理后 后低于 组（）。处理后 ，组 水平显著高于 组（）。这说明，抑制 可以导致 水平升高，见图 。与 组比较，处理后 ，组、组、组、组 水平显著升高（）。自处理后 开始，组的 水平明显高于 组（）和 组（）。从处理后 开始，组 水平显著高于 组（），见图 。图 不同处理组中 细胞的形态表现 讨论 和 分别诱导 细胞 和铁死亡 上皮间质转 化（，）是肺纤维化发展的关键过程 。转化生长因子 （）诱导 细胞的 通常被用作体外肺纤维化模型 。在 过程中，间充质标志物如 的表达上调，上皮标记蛋白如 的表达下调，导致上皮细胞粘附受损，结构改变，最终促进肺纤维化发展 。本研究中，组、组、组 处理 后，细胞形态都发生了显著变化，由最初的多角形逐渐变为成纤维细胞样形态。这提示，细胞形态的改变主要是由 引起的。此外，处理 细胞后，表达水平显著升高，表达水平明显降低。这提示，处理 细胞后发生 ，可作为体外肺纤维化模型。是一种公认的铁死亡小分子诱导剂 ，。本研究发现，组和 组 细胞出现聚集性细胞死亡，在形态学上表现为细胞收缩变圆，死亡细胞数量随时间增加。与 组比较，组和 组细胞 、和 水平显著升高，细胞活力明显降低。这表明，诱导的 细胞死亡符合铁死亡的形态学和生化特征 ，。这说明，可诱导 细胞发生铁死亡。与 组比较，；与 组比较，。图 不同处理组 细胞活性的变化 不同组线粒体活性氧随时间的荧光图像（，）；各处理组 细胞中线粒体活性氧的相对定量。与 组比较，；与 组比较，；与 组比较，。图 不同处理后 细胞线粒体活性氧水平滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，细胞内 水平；细胞内 含量。与 组比较，；与 组比较，；与 组比较，。图 不同处理组 细胞内 、的表达水平 铁死亡与 诱导 的共同机制 诱导 时，铁蛋白重链（，）水平显著降低，导致细胞内铁超载，进而促进 的产生，导致肺泡上皮细胞损伤 。增加 的产生，是氧化应激的标志，是脂质过氧化的产物 。通过促进 生成、抑制抗氧化酶增加氧化应激，促进 表达，参与纤维化过程 。在铁死亡发生过程中存在铁过载 ，、和 水平增高 。本研究中，与 组比较，组、组和 组的 、和 水平均明显升高，组中 和 水平明显高于 组和 组。这提示，铁超载、线粒体氧化和脂质过氧化升高是 诱导 和 诱导铁死亡的共同机制。在肺纤维化和铁死亡中的作用及可能机制 是线粒体外膜蛋白，维持细胞内铁和活性氧稳态 。调节细胞内游离铁的水平，细胞内较高水平的游离铁会通过芬顿反应促进 的生成 。抑制 导致铁积累和随后的线粒体氧化损伤，促进 诱导的铁死亡 。本研究中，经 和 处理后，的 和蛋白质表达水平显著降低。与 组比较，组 表达水平及细胞内 、水平显著升高，而 表达量明显降低。这说明，抑制 可提高 、和 水平，增强氧化应激和脂质过氧化，促进肺纤维化和铁死亡，可能通过降低 水平、抑制氧化应激和脂质过氧化作用来抑制铁死亡和肺纤维化。此外，与 组和 组比较，组 的表达水平明显降低。这提示，与 在抑制 表达方面可能具有协同作用。综上所述，和 分别诱导 细胞 和铁死亡。、水平升高是 诱导 细胞的 和 诱导的铁死亡的共同机制。可通过降低 水平、抑制氧化应激和脂质过氧化作用抑制肺纤维化和铁死亡。参考文献 ，（），（）：，：，：，（）：，：，（）：，（）：，：，：，（）：孙露露，刘乃国 铁死亡相关基因的研究进展 国际遗传学杂志，（）：，（），（）：，（）：（下转第 页）滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，：，：，（）：，（）：，：，：，：，（）：，（）：（收稿日期：）（本文责编：李林）（上接第 页），（），（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：（收稿日期：）（本文责编：李林）滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，