生物化学技术原理及应用省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

第一编第一编 概概 述述生物化学技术原理及应用主讲：孙伟第1页第一章第一章 生命大分子物质制备生命大分子物质制备w第一节第一节 材料选择与处理材料选择与处理w第二节第二节 确立测定方法确立测定方法w第三节第三节 细胞破碎细胞破碎w第四节第四节 抽抽 提提w第五节第五节 浓浓 缩缩w第六节第六节 纯化方案设计与评价纯化方案设计与评价w第七节第七节 有效成份纯度和性质分析有效成份纯度和性质分析w第八节第八节 应用实例应用实例第2页w生命大分子物质通常是指：生命大分子物质通常是指：动物、植物和微生物在进行新陈代谢时所产生动物、植物和微生物在进行新陈代谢时所产生蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质(包含酶包含酶包含酶包含酶)和核酸和核酸和核酸和核酸等有机化合物总称。等有机化合物总称。生命科学研究将进入后基因组时代后基因组时代后基因组时代后基因组时代。分离纯化和测试分析蛋白质技术显得十分主要。本章将以蛋白质和核酸为根本讨论其制备普通过程，即材料选择与处理、测定方法确实立、有效成份抽提、粗品纯化和纯品判定(这部分移至后面章节介绍)等步骤。第3页第一节第一节 材料选择与处理材料选择与处理 一、材料选择一、材料选择 A.有效成份有效成份有效成份有效成份 是指欲纯化某种单一生命大分子物质。而有效成份以外其它物质则统称杂质杂质杂质杂质。第4页 B.B.有效成份在材料中存在特点有效成份在材料中存在特点w有效成份含量普通较少有效成份含量普通较少 如胰脏中胰岛素含量小于其鲜重百万分之一。w有效成份稳定性较差有效成份稳定性较差 大多数对酸、碱、高温和高浓度有机溶剂等因子较敏感，易被微生物分解变质。选取材料材料不一样，有效成份含量含量就不一样；选取材料即使相同，不过部位部位或生长久生长久不一样，有效成份含量也不尽相同。第5页 C.C.材料选择应遵照标准材料选择应遵照标准w有效成份含量多、稳定性好w起源丰富、保持新鲜w提取工艺简单w有综合利用价值等 第6页 二、材料处理二、材料处理 选择到适当材料后，应及时使用及时使用及时使用及时使用，或采取冰冻冰冻冰冻冰冻或干燥干燥干燥干燥等方法处理。同时还应将易于去掉非需物质除去。第7页 1 动物脏器动物脏器 (1)冰冻冰冻 应在很短时间内置-10冰库(可短期保留)或-70低温冰箱(数月不变质)贮存。脱脂脱脂 脂肪轻易氧化酸败，造成原料变质，而且还会影响纯化操作和制品得率。普通脱脂方法有：A.人工剥去脏器外脂肪组织；B.浸泡在脂溶性有机溶剂(如丙酮、乙醚)中脱脂；C.采取快速加热(50左右)、快速冷却方法，使熔化油滴冷却后凝聚成油块而被除去；D.利用油脂分离器使油脂与水溶液得以分离。第8页 (2)干燥干燥 A.丙酮液中脱水，干燥后磨粉贮存备用；B.在沸水中蒸煮处理，烘干后能长久保留。第9页 2 植物组织植物组织 A.叶片叶片 用水洗净即可使用；或在l0h内置-4-30冰箱贮藏备用。B.植物种子植物种子 需泡胀或粉碎才可使用。材料含油脂较多时，要进行脱脂处理。第10页 3 微生物微生物 为制备生命大分子物质主要材料之一。用离心法搜集到上清液，可用于制备胞外酶和一些辅基等有效成份；可置低温下短时间贮存。搜集到菌体，经破细胞处理后则可从中提取其它有效成份；或制成冻干粉，在4保留(数月不会变质)。第11页第二节第二节 确立测定方法确立测定方法 一、目标与要求一、目标与要求 测定哪些材料含有目标有效成份？哪些材料含量丰富？提纯过程纯度是否逐步增加？要确立专一、准确、灵敏和简便测定方法。因为：有效成份在原材料中含量较低；底物要专一性。第12页二、惯用测定方法二、惯用测定方法 1 1.光谱法光谱法2 2.电化学法电化学法3 3.生物活性检测法生物活性检测法4 4.免疫分析法免疫分析法5 5.生物传感器生物传感器第13页 1 光谱法光谱法(1)(1)吸收光谱法吸收光谱法直接测定法；直接测定法；比色法比色法(2)(2)荧光法荧光法(3)(3)浊度法浊度法 特点：测定时所需样品量较少，但往往能产生比较高消光值；且操作简单，反应快速、灵敏；结果也较准确，第14页 (1)吸收光谱法吸收光谱法 直接测定法、比色法直接测定法、比色法 直接测定法直接测定法 将待测物(如核酸、蛋白质)配制成一定浓度溶液后，移至对应波长分光光度计中，即可从测定消光值换算换算出待测物含量含量。第15页 A.A.测定核酸含量测定核酸含量 组成核酸碱基组分是分光光度计测定核酸含量依据。在测定过程中，DNA或RNA溶液浓度增加或降低，会使其在波长260nm消光值(A260)随之增加或降低，二者之间成正比关系。第16页 通常1个A260值分别相当于 双链DNA 50gml 单链DNA 37gml 单链RNA 40gml 用A260A280比值可确定DNA和RNA纯度：纯DNA比值为1.8 纯RNA比值为2.0 当此比值分别小于1.8和2.0时，表明样品中已污染了蛋白质或酚类等物质。第17页 B.测定蛋白质含量及纯度测定蛋白质含量及纯度 蛋白质(包含酶和肽)溶液A280值主要是由组成蛋白质组分色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)消光值决定，胱氨酸贡献很小。第18页 比色法比色法 将待测物(如蛋白质、核酸、糖类)与相关试剂(见表1-2)或酶底物作用后，依据展现颜色或形成产物特征，移至对应波长分光光计中，即可从测定消光值换算出待测物含量。比如：邻苯二酚邻苯二酚(在在275275nmnm有吸收峰有吸收峰)+邻苯二酚邻苯二酚-2-2,3-,3-双加氧酶双加氧酶 黄色黄色-羟基粘康酸半醛羟基粘康酸半醛(在在375375nmnm有吸收峰有吸收峰)经过检测375nm消光值升高即可换算出所用酶活力。第19页 还可用不一样消光值之间比值判定一些物质纯度 比如 纯细胞色素c还原型A550氧化型A280比值为1.25 1.28。假如比值过高或过低，就表明细胞色素C中污染了杂质。第20页 (2)(2)荧光法荧光法 特点：荧光法准确性、重复性和灵敏度比吸收光谱法好。当分析物含量低、用吸收光谱法不能检测时，改用荧光法却能求得满意结果。如：NAD(菸酰胺腺嘌呤二核苷酸)（辅酶）NADP(菸酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)（辅酶）因为NADH2和NADPH2发荧光，用于偶联NADH2(或NADPH2)氧化或NAD(或NADP)还原反应系统进行荧光测定。第21页 例子：谷草转氨酶(GOT)活力测定w采取与苹果酸脱氢酶（MDH)相偶联反应进行。天冬氨酸+-酮戊二酸 GOT 草酰乙酸+谷氨酸 草酰乙酸+NADH+H+MDH L-苹果酸+NAD+w每生成1分子草酰乙酸分子草酰乙酸就消耗消耗1分子NADH，这么GOT活力就可经过测定NADH在340nm消光值下降来求得。第22页 (3)(3)浊度法浊度法 极稀悬浮液悬浮液可采取此法测定，即测定悬浮液在不被吸收波长下表观消光值。比如 伴刀豆球蛋白(Concanavalin,ConA)活力测定方法之一就是采取此法(A420)。培养液中细菌生长浓度(A600)也可用此法测定。第23页 2 电化学法电化学法 有些反应过程会放出质子氢(H+)，可用灵敏pH计或NaOH溶液滴定等方法追踪其改变，从而计算出欲测物含量含量含量含量或活力活力活力活力。比如：葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，用NaOH溶液滴定该酸含量，便可求出葡萄糖氧化酶活力。第24页 3 生物活性检测法生物活性检测法 大多数生命物质，尤其是一些激素类激素类激素类激素类物质，当把它们注射入动物特定器官时，所属机体将发生对应改变，而且二者间有一定相关性。依据这一性质设计方法，即可对生命活性物质进行检测。如：在某个动物器官中注射某种激素，使器官细胞加速分裂，经过检测细胞数量改变来推测激素生物活性。第25页 4 免疫分析法免疫分析法 采取抗体与抗原抗体与抗原抗体与抗原抗体与抗原之间发生特异反应，并结合放射性同位素标识或酶标识，就可对相关物质进行灵敏定性或(和)定量分析(详见第十九章)。5 生物传感器生物传感器 用生物传感器中敏感膜（敏感膜（敏感膜（敏感膜（含有分子识别功效生物活性材料如酶、蛋白、抗体、生物膜和微生物等作为敏感元件）与待测溶液中某一物质物质物质物质进行反应，即可经过显示器反应出有效成份数量(详见第十七章)。第26页第三节第三节 细胞破碎细胞破碎 细胞是生物体结构和功效结构和功效结构和功效结构和功效基本单位。有效成份能够分泌于细胞外分泌于细胞外，也有存在于细胞内。存在于细胞内。如淀粉酶和蛋白酶等就是分泌在胞外培养液中，用适当溶剂可直接提取。存在于细胞内存在于细胞内酶又有游离酶有游离酶和结合酶结合酶之分，前者游离游离在细胞质中在细胞质中，后者则与细胞器紧密结合与细胞器紧密结合(如氧化还原酶和有机磷水解酶等)。第27页w欲提取存在于细胞内物质时，必须把细胞破碎把细胞破碎把细胞破碎把细胞破碎（个别则例外如采取Mg2+溶液提取酶蛋白）。w动物脏器细胞膜比较脆弱细胞膜比较脆弱细胞膜比较脆弱细胞膜比较脆弱，极易破损，往往在组织绞碎或提取时就被破坏了。w植物和微生物细胞壁较牢靠细胞壁较牢靠细胞壁较牢靠细胞壁较牢靠，需要在提取前进行专门破细胞操作。第28页一、机械破碎一、机械破碎1 研磨法研磨法剪碎动物组织置研钵中，用研磨棒研碎。用匀浆器匀浆器处理，也能把动物细胞破碎。大规模生产时，可用电动研磨法电动研磨法。细菌和组织细胞破碎均可用此法。2 组织捣碎器法组织捣碎器法这是一个猛烈破碎细胞方法。捣碎器(8 00010000r/min)处理3045s，植物和动物细胞能完全破碎。第29页3 超声波法超声波法 它是借助声波声波声波声波振动力破碎细胞壁和细胞器有效方法。4 压榨法压榨法 此法是一个温和、彻底破碎细胞方法。用1.771083.54108Pa压力迫使几十毫升细胞悬液细胞悬液细胞悬液细胞悬液经过一个小孔小孔小孔小孔(20kDa)或甘油中。10ml抽提液可在1h内浓缩到几乎无水程度。这种方法浓缩速度与透析袋表面积以及PEG数量有亲密关系。B.真空透析 第46页五、减压蒸馏法五、减压蒸馏法当真空度较高时溶液沸点可控制在当真空度较高时溶液沸点可控制在3030以下。以下。这种方法普通适合用于常温下稳定性好物质。这种方法普通适合用于常温下稳定性好物质。第47页 六、冰冻干燥法 冰冻抽提液在真空状态下，能够由固体直接变为气体固体直接变为气体固体直接变为气体固体直接变为气体。用此原理进行浓缩，有效成份几乎不会破坏。冻干机 冻干机主要由：低温干燥箱、真空泵和冷冻机组成。第48页第六节第六节 纯化方案设计与评价纯化方案设计与评价 纯化方案：纯化方案：是指在纯化某一物质过程中，将几个分离方法(如沉淀法、离子交换层析、葡聚糖凝胶等)有机地互补联合、灵活应用总称。第49页 一、纯化方案设计一、纯化方案设计 依据抽提液中有效成份有效成份有效成份有效成份和杂质杂质杂质杂质之间理化性质差异性，从很多方法中挑选出两种、两种以上乃至更各种分离方法组成一个纯化方案。各分离方法排布：普通地，先先先先选取粗放、快速、有利于缩小样品体积和后工序处理方法；后后后后选取准确、费时和需样品量少方法。第50页 二、纯化方案评价二、纯化方案评价 对纯化方案评价，实质上是对组成纯化方案每一个分离方法评价。这种评价仅采取理论分析是远远不够，只有经过实践检验才能正确得出。第51页 方法：纯化过程每一步搜集到溶液要进行：w w有效成份有效成份有效成份有效成份含量测定；并计算：w w比活力比活力比活力比活力(活力单位数毫克蛋白)w w纯化倍数纯化倍数纯化倍数纯化倍数(每步比活力粗抽提液比活力)w w收得率收得率收得率收得率 (每步总活力/粗抽提液总活力）100 视纯化倍数纯化倍数纯化倍数纯化倍数大小，收得率收得率收得率收得率高低，就能初步确定每种分离方法应用价值应用价值应用价值应用价值。第52页w普通认为：凡是在特定试验中能增大纯化倍数和提升收得率方法均属有应用价值。反之，则应用价值不大，也不宜采取。w不过，在纯化过程中，伴随纯化倍数增大，有效成份含量却是逐步降低，收得率也往往100(除非抽提液中存在酶抑制)。w所以，实践中对纯化倍数和收得率要求是依据材料起源难易而改变。若材料起源难，就希望提升收得率；反之，则希望提升纯化倍数(见沉淀法)。第53页 例子 以从赛氏杆菌(Serratia sp)提取L-门冬酰胺酶为例，说明纯化方案与纯化倍数和收得率关系(见表1-7)。第54页表表1-7 L-门冬酰胺酶纯化门冬酰胺酶纯化比活力比活力比活力比活力 =活力单位数毫克蛋白纯化倍数纯化倍数纯化倍数纯化倍数 =每步比活力粗抽提液比活力收得率收得率收得率收得率 =每步总活力/粗抽提液总活力100步骤步骤 总蛋白总蛋白/g 总活力总活力/u 比活力（比活力（u/mg）纯化倍数纯化倍数 收得率收得率/%1.粗抽提液粗抽提液 30 21000 0.7 1 100 2.氯化锰处理氯化锰处理 7.64 15017 2.0 2.8 723.冰冻融解冰冻融解 5.58 14872 2.7 3.8 714.DEAE-纤维纤维 0.113 5025 44.5 63.5 24 素层析素层析5.硫酸铵盐析硫酸铵盐析 0.048 3367 71.7 102.0 176.羟基磷灰石羟基磷灰石 0.016 3133 200.0 286.0 15 柱层析柱层析7.PAGE 0.012 3100 255.0 365.0 15第55页此处，酶含量酶含量酶含量酶含量是用活力单位活力单位活力单位活力单位表示 酶纯度酶纯度酶纯度酶纯度用比活力比活力比活力比活力表示 纯化有效成份有效成份有效成份有效成份不一样，表示其含量和相对纯度单位亦不一样。如纯化物质是胰岛素，其含量含量含量含量将用效价效价效价效价表示，纯度纯度纯度纯度用每毫克蛋白质所含效价每毫克蛋白质所含效价每毫克蛋白质所含效价每毫克蛋白质所含效价单位表示。第56页第七节第七节 有效成份纯度和性质分析有效成份纯度和性质分析 在实践中 惯用于判定生物制品纯度纯度纯度纯度方法有：电泳(见第十八章)、免疫分析(见第十九章)、薄层层析和薄膜层析(见第三章)等。用于检测其含量和性质含量和性质含量和性质含量和性质方法有：光谱法和气相层析(见第二十章)等；用于测定有效成份分子质量分子质量分子质量分子质量方法有：凝胶过滤(见第六章)和电泳法等；用于测定核酸序列核酸序列核酸序列核酸序列方法有：化学直读法、酶解直读法(见第十三章)等；用于测定蛋白质序列蛋白质序列蛋白质序列蛋白质序列方法有：与Endman降解法相结合薄膜层析等。第57页第八节第八节 应用实例应用实例 叶绿体提取与叶绿体提取与4.5S RNA制备制备 叶绿体提取缓冲液：0.3molL甘露糖醇或0.3molL蔗糖 4mmolL EDTA-Na2 50mmolL Tris-HCl(pH80)5mmolL巯基乙醇 0.05牛血清白蛋白 RNA提取缓冲液：50mmolL TrisHCl(pH8.5)50mmolL KCl 4Triton X-100第58页新鲜植物 置4存放12天匀浆处理（盛4倍于植物体积缓冲液捣碎器中高速匀浆处理）纱布过滤（匀浆液经纱布过滤）离心 (200g，5min)搜集上清液继续离心(30 000g，10min)弃上清液在沉淀中含有完整叶绿体物质第59页叶绿体放入缓冲液中，搅拌l0min离心（得上清液）苯酚抽提（上清液3次）加入110体积3molL乙酸钠和2.5倍95乙醇，-20静置过夜，再离心得沉淀接着用95乙醇洗涤干燥后即为4.5S RNA粗制品。第60页 小结小结 生命大分子物质制备生命大分子物质制备:w材料选择与处理材料选择与处理w细胞破碎细胞破碎w抽提抽提w浓缩浓缩w纯化纯化w判定（判定（有效成份纯度和性质分析）第61页