糖的组织化学省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

组织化学组织化学 histochemistry特殊染色特殊染色,经过应用一些能与组织经过应用一些能与组织细胞化学成份特异性结合显色试细胞化学成份特异性结合显色试剂剂,定位地显示病变组织细胞特殊定位地显示病变组织细胞特殊化学成份化学成份,同时又能保留原有形态同时又能保留原有形态改变改变,到达形态与代谢结合到达形态与代谢结合.可用于检测细胞内酶类、糖类、可用于检测细胞内酶类、糖类、脂类、核酸、一些金属元素等。脂类、核酸、一些金属元素等。第1页糖糖 组组 织织 化化 学学第2页糖分类糖分类1.单糖和双糖单糖和双糖2.多糖：淀粉、纤维素、糖原多糖：淀粉、纤维素、糖原3.粘液物质（粘多糖）粘液物质（粘多糖）中性粘多糖中性粘多糖 酸性粘多糖酸性粘多糖4.糖蛋白糖蛋白 粘蛋白粘蛋白 氨基己糖氨基己糖4%糖蛋白糖蛋白 氨基己糖氨基己糖4%5.糖脂糖脂 含有半乳糖含有半乳糖,脂肪酸脂肪酸,神经氨基醇神经氨基醇第3页糖糖 原原第4页一一.糖原概念糖原概念l 由多糖衍化而来，是天然存在于动物组由多糖衍化而来，是天然存在于动物组织内多糖织内多糖l 分布：胞浆内分布：胞浆内 肝、心肌、骨骼肌肝、心肌、骨骼肌l 同种葡萄糖聚合物同种葡萄糖聚合物l 作为糖原染色切片，必须冰冻或经特殊作为糖原染色切片，必须冰冻或经特殊固定液固定后进行切片固定液固定后进行切片第5页二二.固定剂选取固定剂选取1.Carnoy（冷冷4）无水乙醇无水乙醇 60ml 预防糖原溶于水预防糖原溶于水 氯氯 仿仿 30ml 增加渗透力增加渗透力 冰冰 醋醋 酸酸 10ml 抵消乙醇对组织抵消乙醇对组织 收缩、硬脆作用收缩、硬脆作用 *优点：固定快速，保留肝糖原优点：固定快速，保留肝糖原 第6页2.Gendre（冷冷4）苦味酸无水乙醇饱和液苦味酸无水乙醇饱和液 80ml 甲醛甲醛 15ml 冰醋酸冰醋酸 5ml临用前混合配制临用前混合配制第7页3.Lillie固定液（固定液（AAF）无水乙醇无水乙醇 85ml 冰醋酸冰醋酸 5ml 甲醛甲醛 10ml 固定液预冷固定液预冷4，固定，固定24h后，后，95%乙乙醇脱水，包埋醇脱水，包埋第8页三三.固定中注意事项固定中注意事项1.尽可能取小块新鲜组织及时固定，不用尽可能取小块新鲜组织及时固定，不用水溶性固定液水溶性固定液2.应用含酒精溶液作为固定液，但最好不应用含酒精溶液作为固定液，但最好不单独使用乙醇固定，以乙醇为溶剂混合单独使用乙醇固定，以乙醇为溶剂混合固定液固定为佳固定液固定为佳3.固定原理：使糖原与固定液之间相结合固定原理：使糖原与固定液之间相结合蛋白质凝固，糖原被周围凝固蛋白质膜蛋白质凝固，糖原被周围凝固蛋白质膜保护起来，保护起来，第9页四四.显示糖原方法显示糖原方法 1.碘染色碘染色 2.胭脂红染色胭脂红染色*3.过碘酸过碘酸-Schiff 反应反应 4.银浸染法银浸染法第10页过碘酸过碘酸-Schiff 反应反应Periodicacid-Schiff,PAS第11页(一）染色原理一）染色原理过碘酸是一个强氧化剂，能氧化糖分子，过碘酸是一个强氧化剂，能氧化糖分子，使相邻二个碳原子上羟基（使相邻二个碳原子上羟基（-OH）变为变为醛基（醛基（-COOH）第12页Schiff氏试剂是付品红（碱性品红）经氏试剂是付品红（碱性品红）经SO2作用后，形成无色溶液作用后，形成无色溶液付品红付品红Schiff试剂试剂第13页当当Schiff氏试剂与醛基作用后，形成含有氏试剂与醛基作用后，形成含有发色基团化合物，展现紫红色沉淀发色基团化合物，展现紫红色沉淀第14页*PAS反应基本原理反应基本原理 1.经过过碘酸氧化作用，将糖分子经过过碘酸氧化作用，将糖分子中碳键打断，游离出醛基中碳键打断，游离出醛基 2.醛基与醛基与Schiff试剂反应显出红色试剂反应显出红色沉淀沉淀第15页(二二)染色步骤染色步骤1.切片脱蜡至水切片脱蜡至水2.1%过碘酸溶液内氧化过碘酸溶液内氧化5-10min3.流水洗流水洗5min,再用蒸馏水洗再用蒸馏水洗4.用用Schiff试剂处理试剂处理10-20min5.流水洗流水洗10min6.复染复染(可用可用Mayer明矾苏木素或甲基绿衬染细明矾苏木素或甲基绿衬染细胞核胞核)7.脱水、透明、封片脱水、透明、封片第16页切片经二甲苯和各级酒精复水后，入0.5%过碘酸溶液中作用15分钟，取出后水洗。第17页切片充分洗净后入Schiffs试剂中进行显色。作用15分钟左右，将切片取出水洗，为洗去非特异性着色，将切处理品入三级新配制亚硫酸中进行冲洗，取出后水洗，镜检。第18页 肝糖原肝糖原-PAS染色染色 X200第19页 肝糖原肝糖原-PAS+苏木素复染苏木素复染 X200第20页【结果】【结果】胞浆内胞浆内PAS阳性物质呈紫红色，颗粒状阳性物质呈紫红色，颗粒状或均质团块状，胞核呈蓝色或绿色或均质团块状，胞核呈蓝色或绿色 红色深浅反应含糖原量多少红色深浅反应含糖原量多少【对照】【对照】采取淀粉酶或唾液酶消化切片采取淀粉酶或唾液酶消化切片 对照片对照片PAS（-），），未处理片（未处理片（+）第21页PAS反应阳性物质反应阳性物质物质类别物质类别举例举例染色强度染色强度多糖多糖糖原糖原强强中性粘液物质中性粘液物质结肠杯状细胞结肠杯状细胞强强一些酸性粘液物质酸性非硫酸性含酸性非硫酸性含唾液粘多糖唾液粘多糖中中基底膜基底膜肾小球基底膜肾小球基底膜中中色素色素脂褐素脂褐素中中脂质脂质脑苷脂脑苷脂中中淀粉样物淀粉样物淀粉样物淀粉样物弱弱软骨软骨软骨软骨弱弱真菌真菌曲菌曲菌强强脑垂体脑垂体粘液样细胞粘液样细胞强强第22页This normal glomerulus is stained with PAS to highlight basement membranes.The capillary loops of the glomerulus are well-defined and thin.第23页A888 kidney 11-PAS第24页A888 kidney 14-PAS第25页（三）（三）PAS反应应用反应应用证实与判别细胞内空泡样变性证实与判别细胞内空泡样变性 （水变性、脂肪变性、糖原）（水变性、脂肪变性、糖原）心肌病变及其它心血管疾病诊疗和研究心肌病变及其它心血管疾病诊疗和研究糖原累积病诊疗及研究糖原累积病诊疗及研究糖尿病诊疗及研究糖尿病诊疗及研究一些肿瘤诊疗与判别一些肿瘤诊疗与判别第26页肝细胞水变性肝细胞水变性第27页肝脂肪变性肝脂肪变性(石蜡切片石蜡切片)第28页肝脂肪变性肝脂肪变性(冰冻切片冰冻切片)脂肪特染：苏丹脂肪特染：苏丹III第29页糖原累积症糖原累积症第30页 PAS（+）PAS（-）肝细胞癌肝细胞癌 胆管癌胆管癌 横纹肌瘤横纹肌瘤 颗粒细胞肌母细胞瘤颗粒细胞肌母细胞瘤 Ewing肉瘤肉瘤 骨网织细胞肉瘤骨网织细胞肉瘤 第31页（四）注意事项（四）注意事项1.过碘酸溶液与过碘酸溶液与Schiff试剂均可重复使用屡次，试剂均可重复使用屡次，用后密封放入冰箱用后密封放入冰箱4保留保留2.新鲜配成溶液与应用过作用时间不一样，新鲜配成溶液与应用过作用时间不一样，刚配成作用时间短，以后逐步延长刚配成作用时间短，以后逐步延长3.过碘酸溶液在作用前应与室温靠近，温度过碘酸溶液在作用前应与室温靠近，温度太低，造成氧化不全，影响效果太低，造成氧化不全，影响效果4.Schiff试剂如呈淡红色，则应弃去重配试剂如呈淡红色，则应弃去重配第32页5.Schiff试剂配法很多，区分不大，能够试剂配法很多，区分不大，能够随意选取随意选取6.Schiff试剂作用时，染色缸必须加盖，试剂作用时，染色缸必须加盖，不然不然Schiff试剂将因试剂将因SO2消失而失效消失而失效第33页Schiff试剂试剂 碱性复红碱性复红 1g 1N盐酸盐酸 20ml 偏重亚硫酸钠偏重亚硫酸钠 1g 重蒸馏水重蒸馏水 200ml第34页粘粘 液液 物物 质质(粘粘 多多 糖糖)第35页 人体各种腺体及其它许多组织、细胞，人体各种腺体及其它许多组织、细胞，如结缔组织、纤维母细胞、软骨基质如结缔组织、纤维母细胞、软骨基质等都能合成和分泌粘液物质，统称为等都能合成和分泌粘液物质，统称为粘多糖粘多糖 或或粘液粘液第36页分类分类中性粘多糖中性粘多糖酸性粘多糖酸性粘多糖 1.硫酸化粘液物质硫酸化粘液物质 结缔组织结缔组织 （强）（强）上皮上皮 （弱）（弱）2.非硫酸化粘液物质非硫酸化粘液物质 含己糖醛酸结缔组织粘液物质含己糖醛酸结缔组织粘液物质 含唾液酸上皮粘液物质含唾液酸上皮粘液物质 第37页粘液物质染色在诊疗中应用粘液物质染色在诊疗中应用1.用于普通粘液性病变观察用于普通粘液性病变观察2.肿瘤诊疗与研究：用显示粘液染色肿瘤诊疗与研究：用显示粘液染色方法进行观察和判别方法进行观察和判别第38页胃粘膜上皮分泌中性粘液，而胃肠上皮化胃粘膜上皮分泌中性粘液，而胃肠上皮化生或肠型胃癌细胞分泌酸性粘液生或肠型胃癌细胞分泌酸性粘液 -AB-PAS染色区分中性与酸性粘多糖染色区分中性与酸性粘多糖酸性粘多糖含有硫酸基团和羧基。用阳离酸性粘多糖含有硫酸基团和羧基。用阳离子染料与酸性基团结合形成盐键而显色。子染料与酸性基团结合形成盐键而显色。利用染液不一样利用染液不一样PH值及不一样电解质浓度，值及不一样电解质浓度，能够区分酸性粘多糖二种基团能够区分酸性粘多糖二种基团 -HID-AB法法第39页1.不一样不一样PH竞争性抑制竞争性抑制 PH2.5时，二种酸性粘多糖均被奥蓝着色时，二种酸性粘多糖均被奥蓝着色 PH1.0时，仅硫酸粘多糖着色时，仅硫酸粘多糖着色第40页2.电解质浓度与粘液物质着色关系电解质浓度与粘液物质着色关系 MgCl2浓度浓度 显示物显示物 0.06M 羧酸和硫酸化粘液羧酸和硫酸化粘液 0.3M 弱和强硫酸化粘液弱和强硫酸化粘液 0.5M 强硫酸化粘液强硫酸化粘液 0.7M 强硫酸化结缔组织粘液强硫酸化结缔组织粘液 0.9M 硫酸角质硫酸角质第41页 显示糖分子和酸性基团显示糖分子和酸性基团 组化方法组化方法第42页1.奥蓝奥蓝-过碘酸过碘酸Schiff氏法氏法（AB-PAS）l【目】鉴别胃粘液（中性粘多糖）和肠【目】鉴别胃粘液（中性粘多糖）和肠粘液（酸性粘多糖）；对鉴定肠上皮化粘液（酸性粘多糖）；对鉴定肠上皮化生有一定意义生有一定意义第43页【染色原理染色原理】奥蓝是一个水溶性氰化亚钛铜盐，带有奥蓝是一个水溶性氰化亚钛铜盐，带有阳电荷，与组织中酸根结合形成盐键。阳电荷，与组织中酸根结合形成盐键。AB-PAS法：首先酸性粘多糖为奥蓝染法：首先酸性粘多糖为奥蓝染色，不再与色，不再与PAS发生反应；仅中性粘多发生反应；仅中性粘多糖为糖为PAS阳性阳性第44页【染色步骤染色步骤】1.石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗2.1%奥蓝醋酸（奥蓝醋酸（3%）液染）液染30分钟（分钟（PH约约2.5）3.蒸馏水洗蒸馏水洗4.1%过碘酸液氧化过碘酸液氧化5-10min5.蒸馏水洗蒸馏水洗6.Schiff试剂作用试剂作用10-30min7.流水洗流水洗10min8.脱水，透明，封片脱水，透明，封片第45页Alcin blue染色液：染色液：奥蓝奥蓝1g，蒸馏水蒸馏水97ml，冰醋酸冰醋酸3ml 临用前过滤使用，调整临用前过滤使用，调整PH2.5-3之间之间【结果】【结果】中性粘多糖（胃粘液）呈红色，酸性中性粘多糖（胃粘液）呈红色，酸性粘多糖（肠粘液）呈蓝色，酸性和中性粘多糖（肠粘液）呈蓝色，酸性和中性混合粘液呈紫红色混合粘液呈紫红色第46页 AB-PAS X100第47页AB-PAS X200第48页2.高铁双胺高铁双胺-奥蓝法（奥蓝法（HID-AB）法法l【目】【目】l 主要用于鉴别硫酸化粘多糖和唾液酸主要用于鉴别硫酸化粘多糖和唾液酸粘多糖，对确定肠化生类型有一定价值粘多糖，对确定肠化生类型有一定价值l正常胃粘膜上皮，十二指肠腺正常胃粘膜上皮，十二指肠腺中性中性粘液粘液l小肠小肠氮乙酰化唾液酸粘液氮乙酰化唾液酸粘液l大肠大肠氧乙酰化唾液酸粘液和硫酸粘氧乙酰化唾液酸粘液和硫酸粘液液第49页肠型胃癌肠型胃癌 唾液酸粘液唾液酸粘液 硫酸粘液硫酸粘液弥漫型胃癌弥漫型胃癌 中性粘液中性粘液高分化腺癌高分化腺癌 硫酸粘液硫酸粘液中低分化腺癌中低分化腺癌 唾液酸粘液唾液酸粘液大肠型化生大肠型化生 硫酸粘液硫酸粘液小肠型化生小肠型化生 不含硫酸粘液不含硫酸粘液第50页高铁双胺染液高铁双胺染液 N，N-二甲基二甲基-间间-苯二胺二盐酸盐苯二胺二盐酸盐 120mg N，N-二甲基二甲基-对对-苯二胺二盐酸盐苯二胺二盐酸盐 20mg 溶于预热至溶于预热至25蒸馏水蒸馏水50ml中，再加入中，再加入60%FeCl3.6H20 1.5ml (PH1.4-1.5)第51页【染色原理】【染色原理】二胺盐离解后带阳电荷，与硫酸化粘液物质二胺盐离解后带阳电荷，与硫酸化粘液物质结合成复合物而显色。结合成复合物而显色。该反应迟缓，需加入该反应迟缓，需加入FeCl3作为催化剂作为催化剂 FeCl3作用作用 -使二胺盐氧化形成棕黑色阳离子色原，加紧染色使二胺盐氧化形成棕黑色阳离子色原，加紧染色 -使染色液使染色液PH降至降至1.4 以后奥蓝（以后奥蓝（PH2.5）把羧基化唾液酸粘液染把羧基化唾液酸粘液染成蓝色成蓝色 第52页【染色步骤染色步骤】1.切片脱蜡至水切片脱蜡至水2.蒸馏水洗蒸馏水洗3.入双胺溶液入双胺溶液 28 18-二十四小时二十四小时4.自来水稍洗，蒸馏水洗自来水稍洗，蒸馏水洗5.入入3%冰醋酸水溶液（冰醋酸水溶液（PH2.5）3min 6.奥蓝染液奥蓝染液30min7.流水洗流水洗5min8.蒸馏水洗蒸馏水洗9.脱水，透明，封片脱水，透明，封片第53页【结果】【结果】硫酸粘液呈棕黑色，含羧基唾液酸粘液硫酸粘液呈棕黑色，含羧基唾液酸粘液呈蓝色，中性粘液不着色呈蓝色，中性粘液不着色第54页胃胃 -Spicer高铁双胺法高铁双胺法 X200第55页