MACS磁珠分选.doc

MACS磁珠分选免疫磁珠法分离细胞原理免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。一、 磁性细胞标记方式应用MACS技术进行磁性细胞分选最重要的一点是高质量的标记。要尽可能地增强阳性细胞的标记，并减弱背景染色。有两种基本的磁性标记方式：直接标记和间接标记。1、直接磁性细胞标记（Direct magnetic cell labeling）（磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞）直接标记是最快速、最特异的磁性标记方法。目前有多种分选人、小鼠、大鼠以及非人类灵长类细胞的MACS直标微珠可供选用。2、间接磁性细胞标记（Indirect magnetic cell labeling）（磁珠结合不需要的细胞，游离于磁场的细胞为所需细胞）间接磁性细胞标记需要联合使用单克隆或者多克隆抗体和MACS间标微珠。未结合抗体、生物素化抗体或者荧光素标记抗体均可作为一抗标记细胞，再使用抗免疫球蛋白微珠、抗生物素或链霉亲和素微珠、抗荧光素微珠作为二抗磁性标记细胞。几乎针对任何种系任何细胞的任何一种单抗或多抗，均可用于间接标记。间接标记主要在如下情况时选用：当没有直标磁珠时；需要用几种抗体的混合物同时分选或去除多种类型的细胞；间接标记有放大作用，因此可在磁性分选抗原表达弱的目的细胞时使用；使用自备抗体或者配体的磁珠分选中。（一般而言，阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大，阳性分离法用行更多。）二、MACS分选策略有两种基本的分选策略阳性分选和去除分选。复合分选策略是将两种基本分选策略相结合或者联合使用多选微珠，从而实现细胞亚群的分选。1、阳性分选策略（Positive selection strategy）阳性分选中，目的细胞被磁性标记后，作为阳性标记组分直接分选出来。分选后的细胞不必去除MACS微珠，可立即用于培养或者后续操作。该方法可以将磁性标记的靶细胞富集10000倍。阳性分选策略优点：纯度高，回收率高，操作迅速、简便。2、去除分选策略（Depletion strategy）去除分选是把非目的细胞磁性标记后从细胞混合物中去除的方法，即未磁性标记的细胞为目的细胞。MACS分选柱技术加上强磁性标记可以去除高达4个对数级的细胞。去除分选策略适用范围：去除不需要的细胞；缺乏针对目的细胞的特异性抗体（如肿瘤细胞）；不需要抗体和目的细胞结合，即细胞不被激惹（如T细胞、B细胞、NK细胞功能分析）；复合分选的一部分。 3、复合分选策略联合使用两种以上分选策略，主要用于细胞亚群的分选或者得到高纯度非常稀有的细胞。（1）去除后再阳性分选（Depletion followed by positive selection）细胞亚群的分选，可以先磁性标记非目的细胞，去除分选后对阴性组分再行磁性标记和阳性分选。适用范围：在细胞悬液中，非目的细胞也表达用来阳性选择目的细胞的抗原，就需要先去除这群非目的细胞；如果要分选非常稀有细胞，先从细胞悬液中去除非目的细胞，在富集细胞的基础上，进行阳性分选，可获得高纯度目的细胞。（2）多重分选策略（MultiSort Strategy）MACS多重分选是一种根据多种表面标志磁性分选细胞的技术。多重分选中，首先用MACS多选微珠标记目的细胞，进行第一参数阳性分选。然后细胞与多选解离试剂共同孵育，后者可以将微珠从抗体上酶性解离下来。接着使用针对另一细胞表面标志的抗体微珠复合物磁性标记阳性分选细胞。二次标记的细胞可以再次进行阳性分选或者去除分选。三、磁分离细胞的重要指标纯度和得率，这取决于磁珠所连接单抗的特异性和磁珠大小（磁性），然而太大的磁珠会影响细胞活性，也无法直接上流式。四、目前市场上有2种磁性细胞分离系统1、Small particles (50 nm) MACS2、Large particles (12004500 nm) others（如Dynal）五、小磁珠1、优点（1）对细胞温和，不影响分离细胞的后续培养。（2）可直接上流式检测，不影响散射光。2、缺点（1）需要很强的磁场来分离细胞。（2）分离速度很慢，得率不高。（3）一次性的分离柱，不能在普通试管进行。（4）成本昂贵。六、大磁珠1、优点（1）技术简单，分离可在试管中完成。（2）易于增减细胞用量。（3）速度快，得率高（4）成本低2、缺点（1）对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不利于分离后培养。（2）纯度低。（3）容易阻塞FCM的喷嘴。磁珠分选细胞注意事项磁珠分选细胞注意事项1、待分选细胞中如有贴壁细胞，建议在分选前先贴壁培养去除，或者提高EDTA浓度。2、抗体包被磁珠对死细胞常有非特异性结合。因而分选前去除死细胞。3、新鲜分离骨髓细胞，先用胶原酶、DNA酶、胰酶联合消化，可使细胞团块解聚，从而提高分离效率。 4、上分离柱前，充分振荡，混悬细胞，打散细胞团块。5、用分离柱分选，应用真空抽滤水，减少水中气泡，使分离柱不被气泡阻滞。6、细胞悬液加入分离柱中时，应将滴管伸至底壁后加入，避免将细悬液沿管壁流入，使管壁残流末分选细胞，以致后继洗柱过程中，因疏忽末被洗下，最后导致纯度不高。洗柱时，应在前次液体充分流尽后，再加洗液。 7、分选细胞量应根据说明书控制，不超量。8、孵育时间和温度应按说明书进行，延长孵育时间、提高温度会增加非特异结合。9、先用抗体阻断Fc受体，可降低非特异性结合。免疫磁珠分离法用的分离柱不同的厂家生产的磁珠的大小，性能有可能不同。比如MACS的磁珠小，用分离柱分离。而BD产的磁珠是中号的，磁力大，不用分离柱，普通小试管加上分离器就可以分离细胞。如果都是用分离柱，厂商不同的话，最好看看说明，磁珠大小，磁力等性状如何，是否相似。当然，最好还是试一下就知道了。（除了美天旎的是小磁珠，别的几乎都是大磁珠）我曾经清洗后重复利用的分离柱，感觉死的细胞会增加。看实验需要了，最好用新的。MACS 的根Dynal的不一样，MACS 是一個磁性column，而Dynal 只是外面依個磁性的eppendorf 座而已。Miltenyi的柱子回收方法 准备使用回收的柱子时，抗体孵育始，即将柱子置于新鲜的75%酒精中，柱的容器内盛满酒精，自动流下，既消毒，又de-gas，去除气泡十分关键。洗抗体时，即开始洗柱子，将回收柱架于消毒过的长试管口上。换新的酒精自然滴下，换PBS+0.1%FBS冲洗之，最后用MACS Buffer冲洗。柱子准备完毕，准备上柱的细胞也就同时准备好了。回收方法将长试管注满PBS，回抽柱子的活塞，倒出回抽液。倒入新的PBS，打出之；重复两次-此时基本上将柱子内的杂细胞除尽。再抽、打两三次无水酒精或95%酒精，然后置于50-60度烘箱，过夜，即能防止生锈。此法回收的柱子可用2-5次。本人用回收的柱子分离血CD4细胞，纯度90%。