实用pcr流程表.doc

临床PCR检验流程记录表
检验日期: 检验项目: HBV—DNA 扩增仪中保存文件名
使用说明:①严格按单一流向进行实验，即试剂准备区→标本制备区→扩增区，严禁逆向移动。本记录表的流向亦遵循此流程;②各项工作执行后在相应项目前的方框内打“√”；③本记录表最后归档保存在PCR实验室扩增区的专用文件夹中，以备查找。
实验前准备
□试剂在有效期内 □扩增仪、加样器、金属浴、温湿度计等仪器在校准有效期内（校准之日起1年）
□生物安全柜的滤膜在使用有效期内 □离心管、带滤芯吸头已经过质检合格
□各区按消毒液配制SOP配制500mg/L含氯消毒液、2000mg/L含氯消毒液和70％酒精,即用即配.
□打开通风设备
操作者

试剂准备区
实验前:□更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套 □实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭）
冰箱温度:冷藏室（2~8℃）℃； 冷冻室（-20±2℃)℃
实验室温度℃（允许范围：15～30℃);相对湿度：（允许范围：30％～70％）
PCR试剂来源： 试剂厂家：口 深圳匹基生物工程有限公司批号:
检验项目：HBV—DNA 本次实验用量： 人份； 剩余量: 人份
其他有关试剂配制：
仪器设备使用：离心机：□正常 □不正常 ； 振荡器：□正常 □不正常；
生物安全柜： 口 正常 口不正常
实验后：□按实验室清洁消毒SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上.
□按实验室废弃物处理SOP处理实验废弃物。
操作者

检验日期:检验项目：HBV-DNA
样本处理区
实验前：□更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套 □实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70％酒精或水擦拭）
冰箱温度：冷藏室(2~8℃)℃; 冷冻室（-20±2℃）℃
实验室温度℃（允许范围:15～30℃)；相对湿度：（允许范围：30％～70％）
HBV-DNA阳性室内质控物来源：浓度及批号：扩增位置:
HBV—DNA阴性室内质控物来源：批号:扩增位置：
所处理的HBV—DNA标本(对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置:
1
9
17
25
33
41
49
57
65
73
81
89
2
10
18
26
34
42
50
58
66
74
82
90
3
11
19
27
35
43
51
59
67
75
83
91
4
12
20
28
36
44
52
60
68
76
84
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5
13
21
29
37
45
53
61
69
77
85
93
6
14
22
30
38
46
54
62
70
78
86
94
7
15
23
31
39
47
55
63
71
79
87
95
8
16
24
32
40
48
56
64
72
80
88
96
核酸提取及加样过程：□按乙型肝炎病毒DNA荧光定量PCR操作程序SOP进行。
仪器设备使用: 生物安全柜： □正常 □不正常; 恒温金属浴：℃；
离心机: □正常 □不正常； 振荡器： □正常 □不正常；
低温离心机:制冷:□正常 □不正常; 离心：□正常 □不正常
实验后：□按实验室清洁消毒SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上。
□按实验室废弃物处理SOP处理实验废弃物。
口 使用后标本冷冻保存3个月,以备复查。
操作者
检验日期： 检验项目:HBV—DNA
扩增及产物分析区
实验前：□更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套 □实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70％酒精或水擦拭)
实验室温度℃(允许范围:15～30℃）；相对湿度：（允许范围：30%～70%）
LightCycler扩增仪操作：□开机自检及运行正常； □ 按LightCycler操作使用SOP进行编程、参数设定
HBV—DNA 标准曲线计算值:Slope 值： Intercept值: r2值：
室内质控结果：阴性质控物结果：;阳性质控物结果：
口填写室内质控记录、质控图;　 是否失控：口否 　口是
室内质控结果:阴性质控物结果：；阳性质控物结果:
口填写室内质控记录、质控图；　 是否失控：口否 　口是
失控原因及分析：　（失控判断标准及原因分析按室内质控SOP进行）
实验结果：见所附扩增仪打印结果
实验结果有效性判断：□有效 □无效(依据实验结果有效性判断SOP进行）
实验后：□按实验室清洁消毒SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上。
□按实验室废弃物处理SOP处理实验废弃物.
操作者

1。 操作步骤：
1.2.1 取n个1.5ml的灭菌离心管，作好标记。（n=样本数+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照）
1.2.2 向上述离心管中分别加入25ul蛋白酶溶液.
1.2.3 分别加入待测样本、HCV阴性对照、HCV临界阳性对照和HCV强阳性对照各200ul。
1.2.4 加入200ul新鲜配制的裂解液工作液，盖上盖子,振荡15秒，充分混匀。（注意:不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中）。
1.2.5 56摄氏度温浴15分钟。瞬时离心，以去除管盖上的滴液。
1.2.6 加入250ul无水乙醇，盖上盖子,彻底混匀（振荡15秒）.在室温下静置5分钟(15—25摄氏度）。注意：如果环境温度超过25摄氏度，无水乙醇需预冷。瞬时离心,以去除管盖上的滴液。
1.2.7 将n个核酸提取柱放入收集管中,小心地将步骤1。2。6中的液体移入核酸提取柱中.盖上盖子，6000＊g离心1分钟.倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中.(如果离心后核酸提取柱中仍有部分液体，以更高的速度再次离心，确保提取柱中无残余的液体)
1.2.8 小心的打开核酸提取柱的盖子,加入500ul洗液1,盖上盖子，6000＊g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
1.2.9 小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液2，盖上盖子，6000＊g离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将提取柱重新放入收集管中.
1.2.10 小心的打开核酸提取柱的盖子,加入500ul无水乙醇，盖上盖子，6000*g离心1分钟，丢弃收集管，将提取柱放入新的收集管中。
1.2.11 20000＊g高速离心3分钟，彻底去除乙醇.
1.2.12 丢弃收集管，将核酸提取柱放入干净的1.5ml离心管中，打开提取柱的盖子,
56摄氏度温浴3分钟,以彻底去除残余的液体。
1。213 将核酸提取柱放入另一干净的1.5ml离心管中，小心打开提取柱的盖子,加入60ul洗脱液（请将洗脱液加到膜的中央）,盖上盖子,室温静置5分钟.20000＊g高速离心1分钟收集滤出液,做好标记，4摄氏度保存备用.提取的病毒核酸应在2小时内用于PCR扩增，或在—70摄氏度下可以保存一个月。
2。 扩增试剂准备（PCR前准备区）
从试剂盒中取出HCV RT—PCR反应液、Enzyme Mix ， 在室温下融化后，2000*g离心5秒。设所需要的PCR反应管数（玻璃毛细管)为n（n=样本数+1管空白对照+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照+4管HCV定量标准品)，每个测试反应体系配制如下表:
试剂
HCV RT—PCR反应液
Enzyme Mix
用量
n＊13ul
n*2ul
计算好各试剂的使用量，加入到一适当体积试管中，充分混匀均匀后2000＊g离心10秒，向各玻璃毛细管中分装15ul，转移至样本处理区。
3. 加样(样本处理区）
吸取10ul样本处理步骤1。2.13中收集得到的RNA溶液及HCV定量标准品分别加入到上述反应管中(空白对照直接加入10ul洗脱液），盖紧反应管管盖，连同Roche专用金属反应管套放在离心机中，于2000*g离心10秒，将毛细管转移到检测区.将毛细管排放好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序.
4. RT—PCR反应(检测区）
4。1 循环条件设置
Program
Cycles
Temperature摄氏度
Incubation Time(min：sec)
Temperature
Transition
Rate（ 摄氏度/sec)
Acquisition
Mode
Analysis
Mode
1
1
50
30:00
20
None
None
2
1
95
15：00
20
None
None
3

45
95
00：05
20
None
Quantification
50
00:30
20
Single
72
00：20
10
None
反应体系为25ul.具体设置方法请参照各仪器使用说明书.
4.2 仪器检测通道选择
选择F1检测通道：HCV内对照(IC）选择F2检测通道。
4.3 样本的设定
在扩增开始前条件设定时，将HCV定量标准品设为“Standard”并输入试剂盒内给定浓度值，待检样本和对照品设定为“Unknown”。
结果分析条件设定
1. 对HCV的曲线和HCV内对照（IC）的曲线进行分别分析。
2. 分析方式选择Fit Points，基线调整选择Arithmetic，阈值（threshold）设定原则以阈值线刚好超过正常HCV阴性对照曲线的最高点，且正常HCV阴性对照病毒滴度为0.0IU/ml为准。具体设置方法请参照各仪器使用说明书.
质控标准
1. 将HCV定量标准品1—4的浓度值输入，仪器将自动以HCV定量标准品的浓度值为横坐标，以其实际测得的外标Ct值为纵坐标给出标准曲线，标准曲线的拟和度绝对值应大于等于0。980,四个HCV定量标准品的Ct值都应<38.0，否则视为定量结果无效。
2. HCV阴性对照、空白对照HCV RNA应为0.0IU/ml;HCV强阳性对照HCV RNA应为5。0E+05—1。0E+07IU/ml；HCV临界阳性对照应为1.0E+03-1.0E+05 IU/ml；且HCV阴性对照、HCV临界阳性对照中HCV内对照(IC）的Ct值都应小于等于33，否则此次实验视为无效.所有实验从样本处理开始重做.
结果判断
1. 检测样本中1.0E+03 IU/ml小于等于HCV RNA小于等于5.0E+07 IU/ml，测定结果有效,可直接报告相应的浓度值.
2. 检测样本中HCV RNA大于5。0E+07 IU/ml，可按实际测得值报告相应的病毒滴度，亦可将该样本用正常人血浆按10倍梯度稀释到本试剂盒定量检测线性范围内后重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正。
3. 检测样本中0。0IU/ml小于HCV RNA小于1.0E+03 IU/ml，且HCV内对照（IC)的Ct值都应小于等于33，表明病毒载量较低，可直接报告浓度值，但注明该病毒滴度量仅供参考。
4. 检测样本中HCV RNA等于0。0IU/ml，且HCV内对照（IC）的Ct值都应小于等于33，应报告为小于试剂盒最低检测限。
5. 检测样本中HCV内对照（IC）的Ct值大于33或Ct值为无数值,且HCV RNA小于等于1.0E+03 IU/ml（包含0。0IU/ml或无数值)时,则此样本的定量结果视为无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。