黄嘌呤氧化酶及其抑制剂的研究进展.pdf

作者简介：刘依（2001），女，汉族，江西吉安人，本科生，研究方向为药物化学；李健（1981），通讯作者，男，汉族，山东齐河，博士，教授，研究方向为人类重大疾病相关药靶的结构解析及基于结构的药物发现与设计。黄嘌呤氧化酶及其抑制剂的研究进展 刘 依 周 箭 李 健 叶和杨（通讯作者）赣南医科大学，江西 赣州 341000 摘要：摘要：黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XOD)是参与嘌呤分解代谢过程中的关键酶，在生物体内的主要功能是催化次黄嘌呤与黄嘌呤(Xanthine，XAN)转化成尿酸。当 XOD 被激活使嘌呤代谢失调会导致尿酸在体内大量生成与堆积，而尿酸在体内的溶解度是有限的，过量的尿酸不仅以结晶的形式在体内析出形成痛风石，还会通过细胞表面的转运体进入细胞，严重的损伤细胞的功能。尿酸在体内积累无法及时排出还是导致高尿酸血症与心血管疾病（高血压和慢性肾病）、退行性病变及肿瘤等疾病产生的主要原因。XOD 抑制剂可以降低体内该酶的活性，减少尿酸的形成。因此，XOD 被认为是极具潜力的药物靶点。近年来对 XOD 的研究以及 XOD 与疾病之间的关系成为研究热点。本文综述了 XOD 的结构、生物学功能、介导的相关疾病及治疗，并且总结了 XOD 抑制剂的研究进展，可为后续相关研究提供重要参考依据。关键词：关键词：黄嘌呤氧化酶；高尿酸血症；尿酸；黄嘌呤氧化酶抑制剂；心血管疾病；氧化应激 中图分类号：中图分类号：R73 XOD 属于钼蛋白质家族，参与多种分解代谢过程，能广泛地催化嘌呤、嘧啶、喋呤和醛类发生羟基化反应1，主要分布在毛细血管的内皮细胞、小静脉、小动脉和心肌、骨骼肌中的平滑肌细胞中，在人体心、肝、肺等组织细胞质内也都有分布，是体内核酸代谢中一种重要的酶，可催化次黄嘌呤氧化为 XAN，亦可使 XAN氧化成为尿酸1-3。XAN 主要在人体肝脏器官中经过 XOD催化以后生成尿酸。正常情况下尿酸会随尿液排出体外4，当嘌呤代谢失衡尿酸在体内堆积形成尿酸盐，尿酸盐从超饱和细胞外液沉积于组织或器官就会导致体内血清尿酸(Serum Uric Acid，SUA)稳态改变从而引发高尿酸(high uric acid，HUA)，SUA 通过调节炎症反应、氧化应激、胰岛素抵抗/糖尿病、内质网应激、内皮功能障碍等分子信号促进心血管疾病、糖尿病、代谢综合征、冠心病、肾功能衰竭、心肌梗死、高血压和脑卒中的发生和发展5，6(如图 1)。另外当 XOD 催化过程中产生的活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)过量会导致抗氧化防御系统之间不平衡会引发多种疾病和增加衰老4，7。目前临床上靶向抑制 XOD 降低体内的尿酸含量药物有别嘌醇、非布司他和苯溴马隆等8，但是这些药物只能起到短暂的缓解症状的效果，且有很多毒副作用，因此研究新的低毒高效的 XOD 抑制剂具有重要意义。XOD 在体内与多种疾病密切相关，其作为极具潜力的重要药物靶点，同时也为心血管疾病的治疗提供了新的治疗策略。图 1 因嘌呤代谢失衡而引起的高尿酸并发症 1 XOD 的结构及形式 XOD 全长 1333 个氨基酸，分子量为 145-150 kDa，是一种复合型核黄素蛋白，在细胞内以同源二聚体的形式存在3。XOD 的 C 端连有 1 个钼蝶呤中心(Molybdopterin，Mo-pterin)，由 15 个氨基酸残基组 成，上 面 结 合 了 鸟 嘌 呤、二 氧 硫 代 钼 离 子(Dioxathion Molybdenum Ion，MOS)及膦酸单酯(Phosphoric acid monoester，MTE)，是 XOD 氧化嘌呤产生尿酸的关键活性位点；N 端连有 2 个铁硫簇中心(2Fe-2S，cluster)，每个铁-硫中心口袋由 19 个氨基酸残基组成，参与氧化过程中电子转移反应和构成 1 个 黄 素 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)中心区域9。XOD 的 4 个氧化还原中心分别为 Mo-pterin、2 个2Fe-2S和 FAD，在 XOD中以线性的方式排列。五种小分子配体 FAD、MTE、喋呤-2，4-二酮(Pteridine-2，4-dione，LUZ)、MOS及2Fe-2S构成 XOD 的中心结构，423 位到 433 位的氨 基酸形成的环构成 FAD 周围结合区域3(如图 2)。XOD 和黄嘌呤脱氢酶(xanthine dehydrogenase，XDH)是黄嘌呤氧化还原酶的两种形式，二者是可以相互转化并催化相同的反应10。XDH 在还原之外的环境中半胱氨酸残基容易被氧化，在 FAD 周围形成二硫键，很快转化为 XOD 的形式；另外 XDH 也可以在缺血或缺氧条件下，通过钙或氢硫基氧化完成构象变化。这两种转化都是可逆性的，通过 1、4-二硫代三醇进行轻度还原可以重新获得 XDH；还有一种转化途径是由蛋白酶(如胰酶)水解经过有限裂解的方式形成不可逆性转化11。XOD 和 XDH 都能催化次黄嘌呤转化为 XAN 继而生成尿酸，具有相同的电子传递系统，但是电子受体发生 了 改 变，XDH 优 选 烟 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD+)作为电子传递系统最终的电子受体底物，而 XOD 电子受体区域中 NAD+结合区转变成为与 O2反应的构型只接受氧气。电子受体改变的原因可能有四点：1)可能是靠近FAD 结合位点附近的柔环氨基酸的构型发生改变，溶剂通道被打开有利于 O2进入活性位点；2)FAD 结合区域氨基酸电荷组成和静电环境发生改变导致与 O2的反应活性增加并且阻塞 NAD+进入活性位点；3)结合 NAD+的柔环(Loop L493-M503)的支撑作用丧失，NAD+结合能力下降；4)FAD 结构域微环境发生改变，增强与 O2的反应活性10。推测 Loop-Q422-K432 区域可能是 XDH 转化成 XOD 电子受体区域关键氨基酸残基，也可能是改造 XOD 酶学特性的关键。注：（PDB ID：3ETR），从 423-433 位的氨基酸环（紫色）代表 FAD 周围的结合区域 图 2 黄嘌呤氧化酶中心结构域的晶体结构示意图 2 XOD 的生理学功能 XOD 在衰老以及死亡的红细胞、白细胞以及呼吸道上皮细胞内发挥重要作用12。衰老或者死亡细胞的细胞核里面的蛋白质经过分解代谢会产生嘌呤，另外 ATP的分解也会产生嘌呤，这部分内源性嘌呤占据了体内嘌呤的大部分，大量嘌呤产物需要酶来进行消化，而XOD 在体内主要功能就是催化 XAN 和次黄嘌呤生成尿酸(如图 3)。在钼辅助因子(Molybdenum Cofactor，Moco)的辅助下 XOD 催化 XAN 向尿酸的转化1。这个过程主要分为四步：首先，Moco 羟基上的质子传递到 Glu1261，活化的羟基亲核攻击 XAN，然后，氢化物从四面体中间体转移到 Moco 的硫原子上，从而将 Mo(VI)还原为Mo(IV)，同时产生的电子经由 FAD 和铁硫中心传递给氧分子，氧分子与 H+结合后形成过氧化氢。第三步，通过抗生素抗性基因 880 质子化形成一个尿酸子，反应完成以后，FAD 被还原为黄素腺嘌呤二核苷酸递氢体(Flavine adenine dinucleotide，FADH)，氧化 Mo(IV)还原为 Mo(VI)的初始氧化态进入下一轮循环，反应完成1，13。嘌呤在被分解代谢的同时还会产生氧自由基和一氧化氮自由基，氧自由基和 H2O2进一步发生反应转化为对细胞更有害的细胞毒性氧化剂过氧硝酸盐(ONOO)、羟基阴离子(OH)和次氯酸，对机体产生很大的损伤，包括破坏细胞的成分、细胞外基质等，使微血管系统的通透性增加，这对细胞内的蛋白质和核酸大分子具有较大的杀伤力14，虽然一氧化氮自由基可以有效的扩张血管，有助于血管舒张和血压调节，但是对肾脏会产生严重危害2，因此 XOD 与炎症、内皮激活、白细胞激活和血管张力调节密切相关。图 3 XOD 在催化过程中的生物学功能和电子转移示意图 3 XOD 参与的病理过程 3.1 XOD 与氧化应激 高尿酸血症患者体内堆积的大量尿酸可刺激各种细胞（如脂肪细胞和血管内皮细胞）中由氮氧化合物(nitrogen oxides，NOX)衍生的大量活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)增加19，当抗氧化防御系统之间不平衡，机体长时间暴露于高浓度的 ROS 可能会诱发多种疾病。此外，XOD 衍生的 O2-和 H2O2都可以介导蛋白质和脂质氧化，内皮细胞(Endothelial Cells，EC)表面上的扩散和迁移能力因氧化应激反应大幅度下降，内皮一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase，NOS)活性降低导致 EC 的衰老和凋亡2，19。此外 XOD 通过与糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)的相互作用然后结合到内皮细胞表面上，催化反应形成尿酸，内皮细胞表面上表达的尿酸转运蛋白(Voltage-driven Urate Transporters，URATv1)被激活后，尿酸通过 URATv1吸收到内皮细胞中会引起氧化应激，降低内皮 NO 生物利用度，抑制 NO 依赖性血管平滑肌细胞松弛而导致内皮功能障碍增加血管张力，并可能导致动脉硬化19，20。上述表明 XOD 通过与内皮糖萼结合升高 HUA 含量使血管室中的氧化剂负荷增加，血管稳态遭到破坏（如图 4）。另外 XOD 发生氧化反应时 ROS 的过度和持续形成是癌症，心脏病，炎性疾病，多器官功能障碍，衰老和神经发生性疾病的关键因素18。超氧化物已被证明在心肌梗塞后的心室重构和心律失常中起主要作用10。当 XOD 衍生的过氧化氢产量的增加，同时会伴随着凋亡和促肥大性途径的上调。图 4 XOD 过表达导致内皮细胞损伤和许多细胞内生物学过程的失衡 3.2 XOD 与癌症 XOD 在体内催化嘌呤生成尿酸的反应失衡后导致尿酸水平大幅度升高是诱发痛风最重要的生化基础和最危险的因素，而尿酸在组织内形成结晶会引发高尿酸血症18。此外 XOD 还参与细胞凋亡和细胞分化，研究表明了 XOD 活性和蛋白表达在多种肿瘤发展中有明显失调的现象，包括肠癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肝癌等5，15。XOD 表达下调会激活 TGF-信号通路，促进癌细胞的迁移和侵袭，在肝癌中 XOD 的活性与正常组织相比明显降低，通过提高 XOD 在体内相关组织中的表达将有利于抑制肝癌细胞发生多种恶性表型16。XOD 催化产生的 ROS 对癌症形成和癌症微环境中信号的传导起着重要作用：一方面，XOD 催化产生的ROS 会导致 DNA 损伤和基因组的不稳定，引起癌症的发生。另一方面，肿瘤细胞中 NOX 被过度激活，肿瘤细胞产生大量的 ROS，调节癌症环境中的信号转导，会促进癌细胞的生长发展。但 XOD 发生氧化反应产生低至中等浓度的 ROS 可以被免疫系统用作攻击和杀死病原体的一种方式，以剂量依赖的方式抑制几种革兰氏阴性和阳性细菌病原体。主要机制是 XOD 催化次黄嘌呤还原产生抗菌物质过氧化氢以杀伤癌细胞，并且 XOD 的杀菌活性也可能因产生过氧亚硝酸盐的能力而增强17，这意味 XOD 可能成为未来癌症治疗的一个新方向。4 药物治疗 目前临床上使用的以 XOD 为靶点缓解痛风的药物主要有别嘌呤醇和非布司他。嘌呤类似物别嘌醇是第一个 XOD 抑制剂药物，别嘌醇通过与酶中的钼结合被XOD 水解生成氧嘌呤醇继而由肾脏缓慢排出体外达到抑制 XOD 的作用，但在治疗痛风和原发性和继发性高尿酸血症等疾病上存在很大风险6。托吡司他是另一种有效的 XOD 抑制剂，除了与钼形成共价键，还通过与周围氨基酸的氢键、疏水相互作用和-堆积相互作用降低 XOD 的活性22。非布司他是一种非嘌呤、选择性黄嘌呤氧化酶抑制剂，服用非布司他可以快速降低尿酸，但是会引起的痛风发作和增加血管风险，通过使用秋水仙碱或非甾体类抗炎药可以进行预防23，促尿酸排泄药以丙磺舒(probenecid)和苯溴马隆(enzbromarone)为代表24(如图 5)，它们分别与别嘌呤醇联合治疗痛风或高尿酸血症效果更佳，另外，阿罗芬酸和非布司他联合治疗能更有效降低尿酸，减少血管 ROS 和机械能量解偶联25。但是这些药物痘存在一定副作用，因此研究新的低毒高效的 XOD 抑制剂具有重要意义。5 靶向 XOD 的小分子抑制剂 靶向抑制 XOD 的生物活性的小分子结构大多是氮杂环芳香化合物，整体可分为 7 类：吡唑并嘧啶类、嘌呤类、黄酮类、苯基吡唑类、噻唑类、蝶啶类和芳 图 5 痛风临床治疗药物主要成分的化学结构 基三唑类。巴比妥类及其同系物硫代巴比妥类是一类能够影响神经传递的杂环类药物，是 20 世纪开发具有中枢神经系统抑制活性的新衍生物的关键分子26。有研究表示所有的双硫代巴比妥酸盐在 30 M 浓度下均表现出良好的抗氧化性能和出色的抑制 XOD 活性的能力，效果最好的双硫代巴比妥酸盐在体外显示出 IC50为 1.79 M(图 6，A)，比别嘌呤醇抑制活性高 10 倍26。并且双巴比妥酸盐和双硫代巴比妥酸盐以中等至优异的反应收率容易且直接地合成。目前很多合成的复合物都具有很好的抑制 XOD 的活性，比如具有 3-甲基-4-硫代-1H-四氢吡喃螺环-5-乙内酰脲的 Pt(IV)复合物16是一种有效的 XOD 抑制剂，IC50值为 19.33 M；以3-cyano-1H-indol-5-yl 作为关键部分合成的小分子抑制剂（图 6，B）(IC50=0.62 M)体外抑制活性比别嘌醇高(IC50=8.91 M)14.4 倍27；N-（1-丙基-3-氰基-1H-吲哚-5-基）-1H-咪唑-4-甲酰胺(图 6，C)(IC50=18 nM)与托吡司他(IC50=13 nM)抑制 XOD 活性相当，结构中主要是氰基和 Asn768 残基之间存在稳定的氢键使XOD 结构趋于紧密导致 XOD 不易与底物结合，为进一步探索基于酰胺的 XOD 抑制剂提供了极好的线索28；构效关系和分子模型研究证明羟基和氨基可作为药效团元素设计 2-苯基嘧啶黄嘌呤氧化酶抑制剂，优化后的化合物(图 6，D)表现出很强的 XOD 抑制剂效力29，IC50值为 46 nM。天然药用植物中蕴含多种药用成分，它们的毒副作用相对较小，成为研究者寻找 XOD 抑制剂药源的重要方向。如土茯苓(Tuckahoe，SGR)(图 6，E)是经常被用作抗高尿酸血症药物的中药，在缓解关节疼痛、去氧和抗HUA方面都具有不错的效果，IC50为13.96 M，从 SGR 中分离出的化合物 5-O-caffeoylshikimic acid(5OCSA)可以在体内抑制肝脏和血清中XOD的活性并同时降低 SUA 水平，5OCSA 抑制作用的具体表现为5OCSA 的二羟基环己烯-1-羧酸环夹在氨基酸残基Phe914 和 Phe1009 之间，通过 Lys771、Ala1079、Val1011 和 Thr1010 与 XOD 形成氢键，二羟基苯基环位于钼中心，5OCSA 通过与其活性位点结合来抑制 XOD活性30。葛根中也存在抑制 XOD 活性的物质31，主要活性成分是异黄酮类化合物包括葛根素、黄豆苷、黄豆苷元和染料木黄酮，这 4 种抑制剂均具有一定的保护作用。葛根中的活性成分与 XOD 结合后，XOD 将葛根素 包 裹 在 中 心，残 基 中Phe798-Leu814和Glu1065-Ser1075 区域的二级结构发生显著的变化，部分螺旋(helix)展开变为环(loop)，对于残基 Glu1065到 Ser1075 的区域，部分 loop 变为 helix，并且活性口袋残基 Arg880 与 Thr1010 之间距离明显变小，Glu802 与 Thr1010 之间的距离明显增加，这种构象变化不利于暴露 XOD 的活性空腔，XOD 的二级结构趋向紧密会降低酶与 XAN 的结合机率，达到降低酶催化能力的效果31。表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)(图 6，F)是另一种具有多种生物活性的 XOD 抑制剂，ECG-XOD 复合物之间通过形成氢键和范德华力增强与 XOD 结合的稳定性，使 XOD 构象更加致密21。XOD的一些疏水性氨基酸残基包围 ECG，ECG 的酚羟基与XOD 的 Lys57、Asp59、Ala304、Ser306、Ser307、Val345残基形成氢键，并与 Ala282 和 Cys303 残基形成-烷基碳键，抑制 XOD 催化活性的机制总结为 ECG 占据了 XOD 中 FAD 位点附近的疏水空腔，阻碍 XAN 的进入和催化产物的释放，抑制尿酸的形成21，并且可以减少氧自由基的产生，因此 ECG 还具有良好的抗氧化能力，被确定为混合 XOD 抑制剂，IC50值为(19.330.45 M)。聚多巴胺(polydopamine，PDA)修饰的中空纤维固定化 XOD 已成功应用于评估 8 种黄酮类化合物的抑制活性。已经测得槲皮素、芹菜素、葛根素和表没食子儿茶素对 XOD 具有良好的抑制作用，抑制率分别为(79.863.50)%、(80.980.64)%、(61.156.26)%和(54.920.41)%。此外，PDA 修饰的中空纤维固定化XOD 在连续 7 个循环后仍能保持其初始固定化酶活性的 50%以上。分子对接分析验证了这四种活性化合物都可以与 XOD 活性位点的氨基酸残基结合32，由此可知PDA 修饰的中空纤维固定化 XOD 是一种从天然产物中初步筛选 XOD 抑制剂的有效方法，为从黄酮类化合物 中筛选潜在的 XOD 抑制剂提供了一个可靠的方法。图 6 XOD 抑制剂的结构和生物活性 6 展望 体内嘌呤代谢失调导致血尿酸浓度显著增高可引起多种代谢性疾病，表现为痛风等，目前用于治疗普通痛风患者的最有效药物是别嘌呤醇和非布索坦，虽然它们的疗效较佳，但其易引起肝肾损害等毒副作用，不适合患者长期服用，存在着用药安全。因此，为了长期治疗或预防高尿酸血症及其相关的疾病，XOD 成为相关疾病治疗重要的药物靶点，通过发现并设计、优化小分子抑制剂来调节 XOD 活性减少尿酸产生，减少反应产生 ROS 引起氧化应激对人体产生刺激，并且对基于非布司他为母核结构进一步研究为新型 XOD 抑制剂先导物的设计与筛选提供新思路。此外，利用自然资源开发药品越来越受到关注，各种植物提取物具有显着的 XOD 抑制潜力为药物研发指引方向。我们希望在不久的将来会出现一系列新的替代化合物，更加安全、健康、有效地降低体内尿酸含量，预防和治疗与内皮功能相关的疾病，并研发出有效性、耐受性和安全性更好的新型抗痛风药物。参考文献 1 Hille 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