实验计划书.doc

实验计划书（初定)
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xxxx年xx月xx号
此为初步计划书，还有很多不成熟甚至错误之处,望老师给予指出!
I 总体计划
本实验总体上分为三大步.(1）生理实验部分：本部分主要进行papaya硬度和细胞壁相关酶类活性的测定。（2)分子实验部分：本部分主要是获得papaya细胞壁相关酶类的基因序列以及由RNA差异表达谱获得细胞壁代谢酶基因等的表达特征.（3）验证实验部分：本部分主要通过实时荧光定量PCR的方法（Real time Q—PCR)验证并初步确定与“橡皮化”相关的细胞壁代谢酶基因的家族成员.
生理实验部分是第一步需要实施的,也是比较独立的部分，初步定为40天左右的时间结束.分子实验和验证实验部分是本实验的核心，这两部分紧密结合，需要同步进行，首先是各种样本（CK，ETH,1—MCP)的获得,随后是各样本的RNA提取，然后委托深圳华大基因公司进行转录组测序并从转录组中筛选细胞壁代谢相关的基因序列，采用5RACE及3RACE的方法，获得这些基因的全长序列以及构建差异表达谱进行相关差异基因筛选等生物信息分析，最后通过实时荧光定量PCR的方法(Real time Q—PCR)验证并初步确定与“橡皮化”相关的细胞壁代谢酶基因的家族成员。
II 详细计划
一，买果。
二,采后预处理：
采后立即运回实验室,剔除病果和机械损伤果，选用形状、大小、外观颜色相对一致的番木瓜果实，剪留0。5cm长果柄为实验材料。先用1。0 g/L的次氯酸钠溶液洗果10 min,再用0。5g/L的施保功溶液浸泡果实10 min，取出晾干后备用。
三，样品分组（四组）：
1。对照组:果实用PE（聚乙烯）保鲜袋包装，轻绑袋口，置于低温（15℃）的恒温箱中贮藏。
2.1。0μl/L的1—MCP处理(橡皮化果实）：在室温条件下（25℃),用浓度1.0μl/L的1—MCP密闭熏蒸处理果实24 h,取出果实后用PE保鲜袋包装,轻绑袋口,置于15℃（冷藏)、RH（相对湿度）为90%的条件下贮藏。
3.0.5 g/L的乙烯利处理：在室温条件下（25℃)，用浓度0。5 g/L的乙烯利处理果实3分钟,取出果实后用PE保鲜袋包装,轻绑袋口，置于15℃(冷藏）、RH为90％的条件下贮藏。
四,实验过程：
贮藏过程中每隔2d（催熟果实）和5d取样一次，鲜果或-70℃贮存，为以后进行基因表达水平的研究.
取样的同时,进行以下生理指标的测定:
1。果实硬度：
使用果实硬度计（FHM-1型,日本产)进行测定。
2。PG(多聚半乳糖醛酸酶)活性：
称取1g果肉,加入5mL(先加3 mL，后用2mL冲洗) 0。05mol/L，pH4。6的柠檬酸缓冲液低温存放（含5%NaCl和1。8 mM的EDTA（乙二胺四乙酸）)，冰浴研磨匀浆。然后在10000转离心30min，将上清液进行透析,用0.05mol/L，pH4。6的柠檬酸缓冲液作为透析液，透析液不含EDTA和NaCl。透析条件:4℃条件下放24小时,中间换一次缓析液，透析完的溶液用于酶活力的测定。该操作在冰浴下进行。
PG活性测定：PG 活性测定以1％ 多聚半乳糖醛酸 （PGA ， 美国Sigma 公司) 为底物， 反应混合液为:1％ PGA0。5 mL、醋酸钠缓冲液（pH 4。6)1。5 mL、酶提取液0。5 mL， 0。5 mL的水(总反应体系为3mL）, 40 ℃反应60 min， 立即加入1mLDNS （3， 5—二硝基水杨酸）终止反应.再加入沸水中煮沸10 min 后冷却，于波长540 nm 下定量分析酶水解生成的半乳糖醛酸含量.以3mL蒸馏水+1 mLDNS作为对照（CK)。以每小时释放1mg 的D—半乳糖醛酸（美国Sigma 公司） 为1 个酶活性单位（U)。以标准D—半乳糖醛酸绘制标准曲线。试验重复3 次。对照不加酶液，以缓冲液代替。
3。PME（果胶甲酯酶）酶活性：
取2g果肉，加3mL 预冷的1 mol/L NaCl 和2 g PVP（聚乙烯基吡咯烷酮）置于研钵中，充分研磨后,转移到离心管中，再用2mL NaCl润洗,倒入离心管中，于冰浴中放置1小时,每隔20 min震荡一次,在4℃下,10000转离心30 min，收集上清液，用0。01 mol/L NaOH调至pH为7.5， 于4℃保存备用。测定:在试管中依次加入1。5mL 0.5% (w/v）的果胶放冰箱备用，有效期5天、0。5 mL0.01％溴麝香酚兰指示剂棕色瓶（pH为7。5）,1。0 mL水，0。5 mL酶液（酶液最后加入），总反应体系为3.5 mL .立即将试管放入37℃的水浴锅中30 min，以蒸馏水为CK。取出试管后冷却,迅速测定其在620 nm波长一分钟内的变化.以每min变化0.01为一个活力单位（U),以U/ g.FW表示。
4.纤维素酶（CX)：
取0。625g羧甲基纤维素钠溶于0.2 mol/L（pH为4。6)的醋酸钠缓冲液中，加几滴氢氧化钠调PH值到7。0，放低温下溶解,定容至100 mL。
酶液的制备同PG。
活性测定：反应体系为1 mL CMC（羧甲基纤维素钠）溶液，酶液1 mL，醋酸钠缓冲液（pH 4。6）1。0 mL(总反应体系为3mL），40 ℃保温60 min，取出加入3,5一二硝基水杨酸(DNS）1 mL终止反应;加入沸水中煮沸5 min，冷却后用分光光度计在540nm处比色测定吸光度值.以3mL蒸馏水+1 mLDNS作为对照（CK)。每小时由底物生产1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）.
纤维素酶活力（U/g）=〔葡萄糖含量(mg）×酶液提取总体积（mL）×5.56〕/〔反应液中酶液加入量（mL)×样品重(g）×时间（h)〕
式中5.56--1 mg葡萄糖的微摩尔数（1000/180=5。56）；
用3， 5-二硝基水杨酸测定生成的葡萄糖做标准曲线.
5。内切木聚糖酶活性：
酶液的制备同PG。
活性测定:反应体系为1 mL5mg/mL的燕麦木聚糖溶液，酶液1 mL,醋酸钠缓冲液(pH 4。6）1。0 mL（总反应体系为3mL），40 ℃保温60 min,取出加入3，5一二硝基水杨酸（DNS)1 mL终止反应；加入沸水中煮沸5 min，冷却后用分光光度计在540nm处比色测定吸光度值。以3mL蒸馏水+1 mLDNS作为对照（CK)。
在特定条件下， 每分钟水解木聚糖形成1μmol木糖(还原糖)所需酶量为1个酶活力单位（U )。
6.内切葡聚糖酶活性：
酶液的制备同PG。
活性测定：反应体系为1 mL1%昆布多糖，酶液1 mL，醋酸钠缓冲液（pH 4。6）1。0 mL(总反应体系为3mL)，40 ℃保温60 min，取出加入3，5一二硝基水杨酸(DNS）1 mL终止反应；加入沸水中煮沸10 min，冷却后用分光光度计在540nm处比色测定吸光度值。以3mL蒸馏水+1 mLDNS作为对照(CK）.
1min 生成1μg还原糖定义为1个酶活力单位。
7.b—半乳糖苷酶活性：
酶液的制备同PG。
活性测定：反应体系为1 mL20mmol/L邻硝基苯B—D—吡喃半乳糖( ONPG） 底物溶液，酶液1 mL，柠檬酸钠缓冲液（pH 4。6）1。0 mL(总反应体系为3mL），40℃保温60 min,取出加入0.5mol/L 碳酸钠冷1 mL终止反应；后用分光光度计在420nm处比色测定吸光度值。以3mL蒸馏水+1 mL0。5mol/L 冷碳酸钠作为对照（CK）。
酶活力单位U 定义为标准条件下（pH 值为4.6，40℃）每分钟催化生成1μmol产物邻硝基苯酚( ONP) 所需的酶量为1个单位.
五，关键基因的表达调控研究：
1,RNA的提取、转录组测序
用Trizol法分别提取各处理样品的总RNA,将各样品的总RNA混合后，采用Oligo(dT）富集mRNA,参照打断—反转录—高通量测序的方法进行转录组测序，通过生物信息分析，拼接组装得到大量的EST序列，委托深圳华大基因研究院进行转录组测序。从转录组中筛选细胞壁代谢相关的基因序列，采用5RACE及3RACE的方法,获得这些基因的全长序列。
Trizol法
⑴、准备试剂：
氯仿,异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0。5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制).
⑵、操作步骤:
①。 匀浆处理:
a。 组织 将组织在液氮中磨碎,每50—100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅.
b. 单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积（即3。5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染.
c。 细胞悬液 离心收集细胞,每5—10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
②. 将匀浆样品在室温（15—30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
③。 可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪，多糖或胞外物质(肌肉，植物结节部分等）可于2—8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA.处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除.取澄清的匀浆液进行下一步操作。
④。 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
⑤。 2—8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层.RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
⑥。 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后.用异丙醇沉淀水相中的RNA.每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
⑦。 2—8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
⑧。 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2—8℃不超过7500×g离心5分钟,弃上清.
⑨. 室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可。不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0。5℅SDS,用枪头吸打几次,55—60℃放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液.RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，—70℃保存。
2，构建 “橡皮化"程度不同的RNA差异表达谱，筛选与果实“橡皮化"相关的基因家族成员
提取各处理的RNA，委托深圳华大基因公司构建差异表达谱及进行相关差异基因筛选等生物信息分析。
通过RNA-Seq（RNA测序),构建不同处理的RNA差异表达谱。分析差异表达基因中的细胞壁代谢酶基因等的表达特征，并采用Northern杂交和实时荧光定量PCR（RT-qPCR)等方法验证，初步获得与“橡皮化”相关的细胞壁代谢酶基因的家族成员。
六，应用实时荧光定量PCR的方法（Real time Q-PCR)对不同处理果实的关键酶进行基因表达水平(mRNA）的定量分析。