桃愈伤组织和果实瞬时转化体系的优化.pdf

北京农学院学报2 0 2 4，39（1)：13-17Journal of Beijing University of Agriculturehttp:/doi:10.13473/ki.issn.1002-3186.2024.0103桃愈伤组织和果实瞬时转化体系的优化杨海清1，吴凡颖，王睿琦1，常明明，肖婷婷3，刘悦萍2*（1北京市平谷区果品产业服务中心，北京10 12 0 0；2 北京农学院生物与资源环境学院农业农村部华北都市农业重点实验室；3.北京农学院植物科学技术学院，北京10 2 2 0 6）摘要：【目的】为建立和优化桃愈伤组织和果实瞬时转化体系。【方法】筛选桃愈伤组织诱导的最佳外植体及培养条件，优化桃愈伤组织和离体果实进行农杆菌瞬时转化的体系。【结果】采用叶片、茎段和种胚为外植体均诱导出愈伤组织，叶片最高诱导率为8 5.8%，用种胚诱导愈伤可达到95.8%的诱导率，且形成的愈伤组织更松散。后续的继代培养中使用4g/LPVP处理可以缓解愈伤组织的褐化。桃愈伤组织采用浸染液法，果块采用真空和注射法均可成功转化，不同转化方法共培养3d为荧光检测的最佳条件。【结论】优化了桃愈伤组织的诱导条件，建立了较为稳定的桃瞬时转化体系，为桃基因的快速验证奠定了技术基础。关键词：桃；愈伤组织；诱导；瞬时转化中图分类号：S662.1文章编号：10 0 2-318 6（2 0 2 4）0 1-0 0 13-0 5文献标志码：AOptimization of transient transformation system in peach callus and fruitYANG Haiqing,WU Fanying,WANG Ruiqi,CHANG Mingming,XIAO Tingting,LIU Yueping*(1.Fruit Industry Serve Center of Pinggu District,Beijing,l01200,China;2.College of Biological and ResourceEnvironment/Key Laboratory for Northern Urban Agriculture of Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China;3.College of Plant Science and Technology,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)Abstract:ObjectiveJIn order to establish and optimize the transient transformation system of peach callus and fruit.MethodsThe optimal explants and culture conditions for callus induction of peach were screened,and the system of Agrobacterium tran-sient transformation of peach callus and fruit in vitro was optimized.Results The leaves,stems and embryos were used as ex-plants to induce callus.The highest induction rate of leaves was 85.8%,and the induction rate of callus induced by embryo was95.8%,and the formed callus was looser.In subsequent subcultures,PVP treatment with 4 g/L can alleviate the browning ofcallus.The peach callus was successfully transformed by immersion method,and the fruit block could be successfully trans-formed by vacuum and injection method.The best condition for fluorescence detection was co-culture for 3 days with differenttransformation methods.ConclusionThe induction conditions of peach callus were optimized and a relatively stable peach tran-sient transformation system was established,which laid a technical foundation for the rapid verification of peach genes.Keywords:peach;callus;induction;transient transformation桃是中国重要的果树资源之一，随着桃树栽培面积和产量的提升，人们的消费需求逐渐呈现多样化趋势，但品种的退化使桃的口感、产量等方面均受到影响，想要提升品质，增加品种的多样性，满足消费者的需求，就需要对桃的种质进行创新，挖掘优质基因，繁育新品种。稳定的转化体系是开展遗传学研究的前提，同时也是基因功能验证的一种手段C1.27。对于桃的遗收稿日期：2 0 2 3-11-0 3基金项目：北京市农林科学院植物保护研究所合作项目“生物制剂防治桃树病害效果评价”第一作者：杨海清（19 7 8 一），内蒙古人，高级工程师，硕士研究生，研究方向为果树栽培与植保技术研究推广，E-mail:yanghaiqingl15 通信作者：刘悦萍（197 6 一），女，内蒙古人，教授，博士，研究方向为果实优质生态安全，E-mail：c a u p i n g s i-14传转化研究约有三十多年的历史，Smigocki 和Hammerschlag通过诱导愈伤组织和体细胞胚胎发生途径获得了转化成功的桃植株，且其表现形式与野生型相比有明显区别3,Perez-cleme用胚胎、子叶为外植体，获得转化的桃植株4，但是这些转化方法存在效率低，工作量大等困难，在随后的桃研究中并未被广泛应用，因此目前还未能在桃上建立起一个稳定的转化体系，仍在使用异源转化方式间接进行基因功能的验证。对于无稳定转化体系的植物，可以考虑使用瞬时转化体系来做相关研究，瞬时转化方式是外源目的基因未整合到植物基因组上,T-DNA片段游离在细胞中进行瞬时表达。目前对瞬时转化体系所采用的植物组织形态、部位、侵染方式有较多的研究5.6 。其中愈伤组织被广泛用作一种瞬时转化系统来鉴定目的基因的功能，尤其是与黄酮类代谢有关的基因。瞬时转化体系是基因功能研究的一个辅助手段，该试验进行了桃愈伤组织的诱导及培养条件的优化，建立了以桃愈伤组织和果实为工具的瞬时转化体系。研究结果为桃种质资源的创新及功能基因的验证提供技术与理论基础。1材料与方法1.1材料桃果实来源于北京市平谷区大华山镇后北宫村果园。用于瞬时转化的为绿化9号”桃果实（Pr u n u s p e r s i c a），于2 0 2 1年8 月（盛花期后111d118d)采摘。采摘时选取未摘袋，没有病虫害和机械损伤的果实。果肉愈伤诱导选用早熟品种桃突围作为外植体。选取盆栽毛桃砧木叶片、茎段为外植体。用于种胚愈伤诱导的桃品种为中桃2 4号，收集于2021年5月（盛花期后3555d，硬核期）。供试菌株：成功转人pCAMBIAsuper1300-GFP过表达载体的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefa-ciens)GV3101。1.2方法1.2.1愈伤组织培养毛桃砧木桃苗的叶片、叶柄和茎段首先在配置好的7 5%酒精溶液中进行30s的表面消毒,再用3%的次氯酸钠溶液，消毒外植体15min，加入Tween20充分混匀后，用无菌水洗去多余的消毒液，此过程重复6 次。将消毒后的外植体夹出放置在无菌滤纸上吸去残留的水分，茎段和叶柄切成12 cm长至少含有1个腋芽的小段，北京农学院学报叶片垂直叶脉切成1cm叶段，气孔朝上接种到愈伤诱导培养基上。早熟品种桃突围的果肉作为外植体进行培养时，先将整个桃果实表面的桃毛洗去，用7 5%的酒精继续清洗掉表面污垢后，浸泡在3%的次氯酸钠溶液中消毒30 min，加人Tween20洗净后用无菌水洗6 8 次用无菌手套取出，使用灭菌后的刀片削去部分果皮,在果肉上划出0.5cm的方格，以1 mm厚度逐个切下后放在愈伤诱导培养基上培养。硬核期的中桃2 4号 种子用来诱导桃种胚愈伤。砸开果核取出种子，用7 5%的酒精溶液消毒1min,再使用3%次氯酸钠二次消毒30 min，最后用无菌水洗去多余的消毒液，重复6 次。将消毒后的种子夹出放置在无菌滤纸上，将表面多余的水分吸去，剥去种皮后，用尖头镊子夹下种胚，将其放置在种胚愈伤诱导培养基上在黑暗条件下培养。在培养过程中加人不同浓度的PVP（聚乙烯吡咯烷酮），继代10 d后观察愈伤组织褐化情况。1.2.2桃种胚愈伤组织瞬时转化选取继代培养10d后，表面呈现嫩黄色且较为松软的桃种胚愈伤组织作为转化材料。将愈伤组织浸泡侵染菌液中，并在室温2 5摇床上以10 0 r/min的转速感染30min。感染后，将其放置在灭菌后的滤纸上去除残留的细菌溶液，并在共培养基上黑暗培养一定时间(2/3/4 d)后观察。1.2.3桃果实和果块瞬时转化注射桃果实：在转化前通过注射有色墨水进行扩散试验，通过液体扩散程度选择最适注射量。利用注射法将适量的侵染菌液注射到桃果实的腹缝线两侧区域，用保鲜膜包裹整个桃果实，在室温下避光3d和4d。真空转化桃果块：将整个桃果实进行表面消毒，在超净台中去除果皮，选择桃果实腹缝线两侧区域的果肉，切取1 cmX1 cm的薄片，放在侵染菌液中，使用真空干燥仪抽真空30 s,直到果块沉到管底，取出转化后的果块在灭菌后的滤纸上去除多余的残留液体，放在共培养培养基上暗培养3d和4d。共培养结束后，将桃果实在注射处纵切，从菌液扩散区域切取1cmX1cm的薄片，在ZEISS体式荧光显微镜下检测荧光，真空转化的果块用无菌水冲去表面杂质后在ZEISS下观察。若细胞呈现多层，可选择用果胶酶及纤维素酶浸泡一段时间，以分离多层细胞，便于观察。第39卷2024年第1期2结果与分析2.1桃愈伤组织诱导最适外植体选择选择合适培养基配方诱导桃不同外植体2 530d后，除果肉没有成功诱导出愈伤外，其他外植体均能够产生愈伤组织。桃果肉、盆栽桃苗叶片、茎尖以及硬核期的桃种胚愈伤组织的诱导率不同，如表1所示。其中叶片的诱导率较高，愈伤组织体积较大，且颜色较浅（图1-C)；茎段外植体形成的愈伤组织体积小（图1-B),硬度较大；种胚的诱导率最A杨海清等：桃愈伤组织和果实瞬时转化体系的优化外植体数外植体Number ofExplantexplants叶片225果肉120茎段60种胚48BC15高，为95.8%，且形成的愈伤组织更软也更松散（图1-D,图 2)。表1桃不同外植体的愈伤组织诱导率Tab.1Callus induction rate of different explants of peachD愈伤数Number ofcallus19304246诱导率Inductionrate/%85.80.070.095.8注：A.桃果肉愈伤；B.桃盆栽苗茎段愈伤；C.桃盆栽苗叶片愈伤;D.硬核期桃胚愈伤图1桃不同外植体愈伤组织诱导情况Note:A.The callus of peach flesh;B.The callus of peach potted seedling stem;C.The callus of peach potted seedling leave;D.The cal-lus of peach embryo in stone hardening stageFig.1 Callus induction rate of different explants of peachABCD注：A，B,C,D 分别表示培养10 d,20d,30d和继代培养10 d后的桃种胚愈伤图2 以桃种胚为外植体诱导的愈伤组织生长情况Note:A,B,C,D Peach embryo callus after 10 days,20 days,30 days of culture,after subculture for 10 dFig.2 Callus growth induced by peach embryo as explant2.2不同浓度PVP对桃愈伤组织褐化的影响桃种胚诱导出的愈伤组织是用来转化的优良材料，但是随着培养时间及继代次数的增加，褐化程度也会增加（图3），这严重地影响了转化效率。PVP是一种吸附剂,能够专一地吸附酚类物质,缓A解愈伤组织在培养过程中的褐化现象，因此，在培养过程中加人不同浓度的PVP,继代10 d后观察。结果表明，添加4g/L的PVP可以有效抑制褐化影响，且对愈伤组织生长的影响较小（图3-C)。BCDE注:A.CK;B.2 g/L PVP;C.4 g/L PVP;D.6 g/L PVP;E.8 g/L PVP图3不同浓度PVP处理对桃愈伤组织褐化的影响Fig.3Effects of different concentrations of PVP on callus browning162.3桃种胚愈伤瞬时转化体系的优化利用浸泡法转化继代10 d后的桃种胚愈伤，黑暗条件下共培养2 d、3d 和4d后，在体式荧光显微2dBrightfield北京农学院学报镜下可见2 d时出现荧光，在3d时达到最强，4d时荧光强度减弱（图4），说明最佳共培养时间为3 d。CK第39卷3d4dGFP3mm注：CK：不含菌体的渗透液图4浸泡法转化桃种胚愈伤后GFP荧光检测Note:CK:Penetrant fluid without bacteriaFig.4 GFP fluorescence detection after transformation of peach embryo callus by soaking method2.4桃果块瞬时转化体系的优化桃果实的瞬时转化结果显示，注射0.1mL时能够有效扩散（图5），且较少的注射量可以防止果实在共培养期间腐烂。结果表明，真空和注射均成功转化，体视显微镜结果显示，维管组织部分的荧光较明显，且共培养3d时的强度最高（图6-A，图7-A）；激光共聚焦结果显示，真空转化的果块共培养3d时荧光更强，且细胞轮廓显示的更为完整（图7-B）。所以利用真空转化的方法,转化后共培养3d为荧光检测的最佳条件。0.1 mLAB注：A.注射溶液后整果扩散情况；B.沿注射针孔纵切观察到的溶液扩散图5桃果实注射溶液扩散情况Note:A.Diffusion of the whole fruit after injection of solu-tion;B.Solution diffusion observed longitudinally along the in-jection pinholeFig.5Injection diffusion of peach fruitA0.2 mLB0.3 mL0.5mLCK3d4d4mm注：CK：不含菌体的渗透液图6 注射法转化桃果实后GFP荧光检测Note:CK:Penetrant fluid without bacteriaFig.6 GFP fluorescence detection of transformed peach fruit by injection150m2024年第1期杨海清等：桃愈伤组织和果实瞬时转化体系的优化A17BCK3d4d4mmCK：不含菌体的渗透液图7 真空法转化桃果块后GFP荧光检测CK:Penetrant fluid without bacteriaFig.7 GFP fluorescence detection of transformed peach fruit blocks by vacuum method3 讨 论桃的愈伤组织诱导常用外植体一般为叶盘8 、茎段 或种胚10 ，也有部分研究使用果肉进行诱导16 。该试验对比了4种外植体的愈伤诱导率，培养30 d后发现果肉外植体没有诱导出愈伤组织（图1）。叶盘、茎段及种胚外植体均被诱导出了愈伤，但茎段愈伤较硬，在后续的培养中生长速度较慢，叶盘与种胚外植体诱导率较高，为8 5.8%和9 5.8%（表1），叶盘愈伤生长速度较快，愈伤组织体积大，种胚愈伤相比以上两者更为松软（图2）。桃愈伤在后续的继代培养过程中容易褐化，这是桃愈伤培养技术面临的主要问题，对于褐化的抑制是获得优质愈伤组织的关键12 ,PVP是一种抗褐化剂，可以专一吸附愈伤在生长过程中产生的酚类物质13，该试验通过设置不同PVP浓度，发现使用4g/L的PVP处理后的愈伤组织褐化程度得到了缓解，细胞团呈现黄色，且与对照组相比,生长量也有所提升（图3）。桃诱导生芽的 WOX基因在再生过程中难以被激活，导致再生体系建立困难14，目前在桃上还未能建立起一个稳定高效的遗传转化体系，所以对于桃的功能基因研究多使用瞬时转化。虽然瞬时转化过程存在可变因素较多，不能获得长期培养材料的缺点，但具有效率高、操作简便等优点，目前在苹果15、荔枝16 一些木本植物的研究中也在广泛使用。该试验优化了桃瞬时转化技术，采用果实注射、真空转化和愈伤侵染三种方式。愈伤组织的侵150m染选用的是种胚愈伤，参照苹果17 及板栗18 的愈伤组织转化方法进行改良，在转化后进行了一定天数的暗培养，随后检测荧光信号，发现2 d时能够在部分愈伤组织中检测到荧光，荧光强度在3d时最强（图4）。注射法转化的桃果实能够在扩散区检测到绿色荧光，真空转化的桃果块也可以检测到荧光，且维管组织的荧光更强，激光共聚焦显微镜结果显示,共培养3d时能够在细胞壁中检测到明显荧光，且呈现出较为完整的细胞轮廓（图6，图7)。该研究对桃愈伤组织诱导和瞬时转化技术进行了优化，研究结果对桃功能基因鉴定奠定了良好技术基础。参考文献：1 RADCHUK V,KORKHOVOY V.The RolB gene promotesrooting in vitro and increases fresh root 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