全身过表达人METRNL基因小鼠模型的构建与验证 (1).pdf

论著 全身过表达人METRNL基因小鼠模型的构建与验证王雪莲1，郑斯莉2，李志勇2，罗亨宇2，缪朝玉1,2（1.上海大学医学院,上海 200444；2.海军军医大学药理学教研室,上海 200433）摘要目的构建全身过表达人 METRNL 基因的小鼠模型（R26-L-METRNL+/-小鼠）。方法基于 Cre-loxP 系统利用 Dppa3-Cre 小鼠和实验室前期构建的人 METRNL 基因条件性过表达（R26-LSL-METRNL+/-）小鼠进行交配繁殖，得到目标R26-L-METRNL+/-小鼠。将该目标小鼠进行基因型鉴定，收集其血液及心、肝、脾、肺、肾、脑、白色脂肪和肌肉组织，利用实时荧光定量 PCR 技术、蛋白免疫印迹实验和血清酶联免疫吸附实验，考察人 METRNL 基因在小鼠的表达情况。结果R26-L-METRNL+/-小鼠的人 METRNL 在组织 mRNA 水平、组织蛋白水平和血液蛋白浓度方面都有显著表达，远高于野生对照组小鼠。结论R26-L-METRNL+/-小鼠模型构建成功。关键词 分泌蛋白；全身过表达；小鼠文章编号 2097-2024（2024）05-0198-05DOI 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014ConstructionandvalidationofamousemodelwithsystemicoverexpressionofhumanMETRNLgeneWANG Xuelian1,ZHENG Sili2,LI Zhiyong2,LUO Hengyu2,MIAO Chaoyu1,2（1.School of Medicine,Shanghai University,Shanghai 200444,China;2.Department of Pharmacology,Naval Medical University,Shanghai 200433,China）AbstractObjectiveTo generate mice with whole-body overexpression of human METRNL gene.MethodsBased onCre-loxP system,Dppa3-Cre mice were mated with Rosa26-LSL-METRNL knock-in mice（R26-LSL-METRNL+/-）to generate R26-L-METRNL+/-mice.The genotypes of the offsprings were identified,and tissues of the blood,heart,liver,spleen,lung,kidney,brain,white adipose and muscle were collected.The expression of human METRNL gene in mice was investigated by quantitative real-time PCR,western blot and enzyme linked immunosorbent assay.Results Compared with wild type control mice,humanMETRNL in R26-L-METRNL+/-mice significantly expressed at both mRNA and protein levels in tissues,with abundant METRNLprotein in blood.ConclusionThe mouse model overexpressing human METRNL gene（R26-L-METRNL+/-mouse）was successfullyconstructed.Keywords METRNL；systemic overexpression；mouseMETRNL（Meteorin-like）是一个新发现的分泌蛋白，为神经营养调节因子 Meteorin 的同源蛋白。2014 年，本实验室首次报道 METRNL 是一个新的脂肪因子，由于其在皮下白色脂肪组织中表达很丰富，故也称为 Subfatin1。10 年来，我们对 METRNL的功能进行了多方面的探索，并不断扩展 METRNL的研究工具与平台。我们的研究已发现，该蛋白参与调节机体多种病理生理过程，比如：脂肪细胞METRNL 可促进白色脂肪分化、脂质代谢并抑制脂肪炎症，从而抵抗高脂饮食诱导的胰岛素抵抗2；肠上皮细胞 METRNL 参与调节肠道抗菌肽的平衡3，且肠道 METRNL 缺乏会加重溃疡性结肠炎4；此外，METRNL 促进小鼠皮肤创伤愈合5，并能对抗D-半乳糖诱导的衰老小鼠的认知功能障碍6。最近，我们新报道了血液 METRNL 的主要分泌来源是血管内皮细胞，并发现内皮细胞 METRNL 对维持血管内皮正常功能和对抗动脉粥样硬化具有重要作用7。在这些研究中，我们构建 METRNL 基因的全身性和各种组织特异性的敲除小鼠，以及多种双基因敲除小鼠，并在体外细胞实验中充分利用METRNL 重组蛋白探索相关治疗学意义。除了本实验室，全球其他多个实验室也展开了对 METRNL的功能探索，并发现 METRNL 在能量代谢8-9、炎 基金项目国家自然科学基金重点项目（82030110，82330117）；国家自然科学基金青年科学基金项目（82104165）；上海市青年科技英才扬帆计划（21YF1457600）作者简介王雪莲，硕士研究生，研究方向：心脑血管药理学，Tel：[phone]，Email：通信作者缪朝玉，教授，博士生导师，研究方向：心脑血管药理学，Email： 药学实践与服务2024 年 5 月 25 日第 42 卷第 5 期 198Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.5，May 25，2024 症10-11、心脏疾病12-13等多种病理生理过程中发挥积极作用。尽管目前有很多关于 METRNL 的研究结果提示，该蛋白具有非常好的临床治疗潜力，但有关整体 METRNL 治疗学探索不多，尤其是长期治疗研究几乎没有。主要原因之一是市场 METRNL 重组蛋白价格昂贵，而且我们前期研究结果发现：对C57BL/6J 小鼠单次静脉注射 1.75 g METRNL 重组蛋白后，血清 METRNL 在 15 min 后急剧升高（226 ng/ml），接着在 4 h 内迅速下降约 90%。虽然在注射后 24 h 仍明显高于基础水平，但此时血中METRNL 浓度已下降约 97%2。因此，以重组蛋白给药方式在动物整体水平研究 METRNL 的治疗学作用，尤其是长期治疗学作用将产生巨大经济成本。另一方面，对于一些已经体现 METRNL 治疗潜力的疾病（如动脉粥样硬化），疾病发展缓慢，短期给予 METRNL 重组蛋白很难起到治疗作用。因此，本研究旨在构建一株长期稳定高表达METRNL 的小鼠作为 METRNL 的治疗学研究工具，并对该小鼠高表达 METRNL 的情况进行验证。1材料与方法 1.1 实验试剂和仪器鼠尾 DNA 提取试剂盒（CW2094S）购自北京康伟试剂生物科技有限公司；5 PrimeScript RTMaster Mix（Takara 公司）；小鼠Tubulin 抗体（AT819，碧云天公司）；通用型 RNA 提取试剂盒（AG21022，艾瑞克生物科技）；Human Meteorin-like/METRNLDuoSet ELISA 试剂盒（DY7867-05，R&D system 公司）；山羊抗兔 IgG（ab175471）、山羊抗小鼠 IgG（ab216772）、抗 METRNL 抗体（ab235775）购自Abcam 公司。LightCycler96 实时荧光定量 PCR 仪（Roche公司）；TP600PCR 仪（Takara 公司）；5200S 化学发光分析系统（Tanon 公司）。1.2 实验动物人 METRNL 基 因 条 件 性 过 表 达（R26-LSL-METRNL+/-）小鼠为实验室前期构建所得。SPF 级8 周龄 C57BL/6J 小鼠和 Dppa-Cre 小鼠购自上海南方模式生物技术有限公司。所有实验小鼠均饲养在独立通气笼盒（IVC）系统中，温度（242），相对湿度为 40%60%，饲养期间笼盒内保持清洁，小鼠在笼内自由活动、进食及饮水，动物房内照明系统为自动控制（12 h 照明、12 h 黑暗）。动物实验标准均依照国家实验动物护理使用卫生指南，并经过海军军医大学医学研究伦理委员会批准指导。1.3 实验方法 1.3.1 动物基因型鉴定将剪刀消毒后剪取小鼠尾尖约 3 mm，剪碎，按照 DNA 提取试剂盒的说明书方法提取 DNA 之后，对目的基因进行 PCR 扩增，各引物序列见表 1。表1PCR 扩增实验中的引物序列 基因名称上游引物（53）下游引物（53）R26-WTTCAGATTCTTTTATAGGGGACACATAAAGGCCACTCAATGCTCACTAAR26-L-METRNLAAAGTCCCGGAAAGGAGCTGGAGGCTCCATCCAGCAAGTTR26-StopGGGCAACGTGCTGGTTATTGACTTGCCCCTTGCTCCATAC内参基因TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGTGATCCACCTGTCTCTGCCTTCCDppa-CreTGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGTGACCTTGCATTCCTTTGGCGAGAG 将 PCR 产物进行 1.2%琼脂糖凝胶电泳，上样量为每孔 6 l，电泳条件为 100 V，30 min，结束后进行拍照、分析。1.3.2 小鼠取材将小鼠称重后，腹腔注射 1%戊巴比妥钠溶液（100 mg/kg），待小鼠处于深度麻醉后，打开其胸腔，自上下腔静脉汇合处缓慢抽取血液，并转移至1.5 ml EP 管静置于室温。迅速剪取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、白色脂肪和肌肉组织，放入组织冻存管扔进液氮速冻，待取材结束后及时转入80 超低温冰箱储存。血液于室温静置 2 h 后离心：4，3 000g，15 min，分离血清，储存至80 超低温冰箱。1.3.3 实时荧光定量 PCR 实验使用 RNA 提取试剂盒提取组织 RNA，将得到的 RNA 进行浓度测定与吸光度测定后进行逆转录，得到 cDNA 用于实时荧光定量 PCR 实验，各引物序列见表 2。1.3.4 蛋白免疫印迹实验取适量组织至 2 ml 高速离心管，加入蛋白裂解液后，使用高通量匀浆仪匀浆 240 s。取出高速离心管，离心：12 000 g，20 min。将上清液转移至 药学实践与服务2024 年 5 月 25 日第 42 卷第 5 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.5，May 25，2024199 另一干净 1.5 ml EP 管中，进行蛋白浓度测定，剩余样品加入 5 蛋白上样缓冲液，97 变性 10 min得到蛋白样品。使用 10%SDS-PAGE 凝胶进行电泳，电泳条件为：150 V，60 min。使用 PVDF 膜进行转膜，转膜条件为 100 V，60 min。转膜结束后，使用快速封闭液封闭 15 min，之后使用 1TBST 缓冲液洗膜，5 min 3 次。加入一抗（11 000 稀释）4 孵育过夜。次日去除一抗孵育液，使用 1 TBST 缓冲液洗膜，5 min 3 次。加入二抗孵育液（12 000 稀释）常温孵育 1 h，用1 TBST 缓冲液洗去二抗，5 min 4 次，结束后即可进行扫膜。1.3.5 血清酶联免疫吸附实验使用酶联免疫吸附实验试剂盒（DY7867-05）测定小鼠血清中的 METRNL 水平，具体操作按照试剂盒说明书进行。1.3.6 统计学分析实验数据使用 GraphPad Prism 8.0 进行统计分析。两组间的比较使用双尾 t 检验，P0.05 视为差异有统计学意义。2结果 2.1 全身过表达人 METRNL 基因小鼠的构建和基因型鉴定本研究基于前期构建好的人 METRNL 基因条件性过表达小鼠（简称为 R26-LSL-METRNL+/-小鼠）和 Cre-LoxP 技术，最终获得全身过表达人 METRNL基因小鼠（简称为 R26-L-METRNL+/-小鼠），具体构建策略如图 1 所示。Exon 2Exon 1Exon 1Exon 1CAGMETRNL-3XFlagWpre-pAWpre-pAWpre-pALoxPExon 2Exon 2CAGCAGSTOPSTOPRosa 26 位点靶向载体3靶向等位基因4Cre重组酶METRNL-3XFlagMETRNL-3XFlag图 1全身过表达人METRNL基因小鼠的构建策略 R26-LSL-METRNL+/-小鼠是前期通过 CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建而成，即在其中一个 Rosa26基因位点定点插入了CAG-LoxP-Stop-LoxP-METRNL-3XFlag-Wpre-pA 表达框，且该表达框的终止密码子 Stop 两侧插有同向 LoxP 位点，可基于 Cre-loxP系统在 Cre 酶的作用下，将 LoxP 位点之间的序列切除，只留下一个 LoxP 位点，最终达到人 METRNL基因过表达的目的。在该小鼠的名称“R26-LSL-METRNL+/-”中，“+”表示有外源基因表达框的插入，“-”表示无外源基因表达框插入。Dppa3-Cre 小鼠是由 Dppa3 基因启动子介导Cre 重组酶在全身表达的工具鼠，将 R26-LSL-METRNL+/-小鼠和 Dppa3-Cre 小鼠杂交，可获得R26-L-METRNL+/-小鼠，具体繁殖方法如图 2 所示。其中，野生对照小鼠简写为 R26-WT，表示在 Rosa26位点没有外源人 METRNL 基因表达框的插入。在繁殖过程中进行基因型鉴定时，需确认外源人 METRNL 基因表达框、终止密码子 Stop 和 Dppa-Cre 基因的存在情况。采用相应基因上下游引物分别进行鼠尾基因型鉴定，外源性表达框阳性条带为 699 bp，对应野生型序列条带为 996 bp，终止密码子 Stop 阳性条带为 408 bp，Cre 基因阳性条带为100 bp。如图 3 所示，泳道 1 为 R26-LSL-METRNL+/-小鼠，泳道2 为R26-L-METRNL+/-小鼠，泳道3 为R26-WT 小鼠，泳道 4 为 R26-L-METRNL+/-Cre 小鼠，泳道 5 为 R26-WT;Cre 小鼠。表2实时荧光定量 PCR 实验中的引物序列 基因名称上游引物（53）下游引物（53）人 METRNLACCAGCGACTTCGTAATTCACCAGCTCCACGTCATGGGTG小鼠 GapdhGTATGACTCCACTCACGGCAAAGGTCTCGCTCCTGGAAGATG 药学实践与服务2024 年 5 月 25 日第 42 卷第 5 期 200Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.5，May 25，2024 2.2 R26-L-METRNL+/-小鼠各组织人METRNL mRNA表达为 验 证 R26-L-METRNL+/-小 鼠 是 否 存 在 人METRNL 基因过表达，本研究首先利用实时荧光定量 PCR 技术检测了该小鼠各组织中人 METRNLmRNA 的表达情况。如图 4 所示，以 R26-WT 小鼠白色脂肪的人 METRNL mRNA 表达量为 1，肝、脾、肺、肾、白色脂肪和脑组织的相对表达量分别为 94 008.6、618.1、88 537.3、68 897.9、32 386.3和 24 816.5。该结果说明，R26-L-METRNL+/-小鼠在组织 mRNA 水平上实现了人 METRNL 基因过表达。2.3 R26-L-METRNL+/-小鼠各组织人 METRNL 蛋白表达接着，本研究提取各组织的蛋白，使用蛋白免疫印迹实验方法验证 R26-L-METRNL+/-小鼠各组织中人 METRNL 蛋白表达情况。在该实验中，所用METRNL 抗体可同时抗人和小鼠的 METRNL 蛋白。如图5 所示，METRNL 蛋白在R26-L-METRNL+/-小鼠的心、肝、脾、肺和肌肉组织中的含量明显高于 R26-WT 小鼠，而在肾组织中 METRNL 抗体的结合效果不佳，且并未发现两组小鼠肾 METRNL蛋白存在明显差异。该结果提示，R26-L-METRNL+/-小鼠在组织蛋白水平上实现了人 METRNL 基因过表达。2.4 R26-L-METRNL+/-小鼠血清中人 METRNL 蛋白水平由于 METRNL 为分泌性蛋白，本研究最后使用 ELISA 方法测定 R26-L-METRNL+/-小鼠及其对照小鼠血清中人 METRNL 蛋白水平。如图 6 所示，可成功检测到 R26-L-METRNL+/-小鼠血液中的人 METRNL，浓度在 1 100.31 579.3 pg/ml，而在R26-WT 小鼠血液中检测不到人 METRNL。该结果说明，R26-L-METRNL+/-小鼠的血液中存在大量人 METRNL 蛋白，提示 R26-L-METRNL+/-小鼠实现了人 METRNL 基因过表达。3讨论和总结本研究利用 Dppa-Cre 小鼠和实验室前期构建的 R26-LSL-METRNL+/-小鼠进行杂交繁殖，最终获得 R26-L-METRNL+/-小鼠。该小鼠与 R26-LSL-METRNL+/-小鼠都在 Rosa26 基因位点含有外源性基因表达框，不同的是在 R26-L-METRNL+/-小鼠外源表达框中的终止密码子 Stop 被 Cre 酶成功切除，因此 R26-L-METRNL+/-小鼠可实现全身细胞过表达人 METRNL。本研究从 mRNA 水平、组织蛋白水平和血清蛋白水平考察了 R26-L-METRNL+/-小鼠过表达METRNL 的情况。由于该小鼠插入的外源 METRNL基因是人 METRNL 基因，因此在进行实时荧光定量 PCR 实验时，使用的是人 METRNL 引物和小鼠Gapdh 引物。类似地，在 ELISA 实验中，使用的是检测人 METRNL 的试剂盒。由于没有特异性抗人的 METRNL 抗体，因此在蛋白免疫印迹实验中使用的是可同时抗人和小鼠的 METRNL 抗体，而内参使用的是抗鼠的 Tubulin 抗体。本研究结果显示，R26-L-METRNL+/-小鼠的各组织存在人 METRNLmRNA 高表达，虽然各组织的表达量有所波动，但都比 R26-L-WT 小鼠的表达量高几千倍甚至是数十万倍。蛋白免疫印迹实验结果显示，在 R26-L-R26-LSL-METRNL+/-Dppa3-CreR26-L-METRNL+/-;Dppa3-CreR26-L-METRNL+/-R26-L-METRNL+/-C57BL/6JR26-WT图 2全身过表达人METRNL基因小鼠的培育流程 12345内参基因(324 bp)Dppa3-Cre(100 bp)R26-L-METRNL+/-(699 bp)R26-WT(996 bp)R26-Stop(408 bp)图 3DNA 电泳条带图 肝脾肺肾脂肪脑R26-WT*METRNL相对表达量200 000150 000100 00050 00005R26-L-METRNL+/-*xs图 4R26-L-METRNL+/-小鼠各组织的METRNLmRNA 相对表达量(n=56，)*P0.05，*P0.01，*P0.001，与 R26-WT 组比较。药学实践与服务2024 年 5 月 25 日第 42 卷第 5 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.5，May 25，2024201 METRNL+/-小鼠的心、肝、脾、肺、肌肉组织存在明显升高的 METRNL 蛋白水平，但该实验中检测的METRNL 蛋白量升高倍数不多，可能与使用的METRNL 抗体可以同时抗人和小鼠的 METRNL有关。另外，我们也注意到两组小鼠肾组织的METRNL 蛋白水平并没有明显差异，并且两组条带都非常微弱，为确证实验结果，我们进行了重复实验，得出相同结果。经过分析可能是因为该METRNL 抗体对肾组织蛋白的亲和力不是很高，导致检测出的蛋白绝对量都太低而使两组之间很难出现差异。在血清水平，本研究结果提示 R26-L-METRNL+/-小鼠的血液中存在大量人 METRNL 蛋白，而 R26-L-WT 小鼠血中检测不到该蛋白，说明R26-L-METRNL+/-小鼠成功过表达人 METRNL，并可以成功分泌至血液中。同时，该实验提示，本研(下转第 222 页)R26-L-METRNL+/-R26-WTMETRNLTubulinR26-L-METRNL+/-R26-WT肾1.51.00.50METRNL相对表达量METRNLMETRNL相对表达量TubulinR26-L-METRNL+/-R26-WTR26-L-METRNL+/-R26-WT心1.00.80.60.40.20*METRNLTubulinR26-L-METRNL+/-R26-WTR26-L-METRNL+/-R26-WT肝METRNL相对表达量1.00.80.60.40.20*R26-L-METRNL+/-R26-WTMETRNLTubulinR26-L-METRNL+/-R26-WT肺METRNL相对表达量1.00.80.60.40.20*R26-L-METRNL+/-R26-WTMETRNLTubulinR26-L-METRNL+/-R26-WT肌肉1.51.00.50METRNL相对表达量*METRNLTubulinR26-L-METRNL+/-R26-WTR26-L-METRNL+/-R26-WT脾1.51.00.50METRNL相对表达量*ABCDEF图 5R26-L-METRNL+/-小鼠各组织的 METRNL蛋白表达情况 xsA.心脏组织；B.肝组织；C.脾组织；D.肺组织；E.肾组织；F.肌肉组织（n=3，）*P0.05，*P0.01，与 R26-WT 组比较。3.5103.01002.51 0002.010 0001.51.00.50METRNL浓度(B/pgml1)吸光度(A,450 nm)2 0001 5001 0005000METRNL浓度(B/pgml1)R26-L-METRNL+/-R26-WTR26-L-METRNL+/-R26-WT*AB xs图 6R26-L-METRNL+/-小鼠及其对照小鼠的血清 METRNL 蛋白水平(n=5，)A.“METRNL 浓度-吸光度”标准曲线（R2=0.992 9）；B.R26-L-METRNL+/-小鼠血清 METRNL 浓度*P 0.001，与 R26-WT 组比较。药学实践与服务2024 年 5 月 25 日第 42 卷第 5 期 202Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.5，May 25，2024 ade and expert insights on their managementJ.Cancer TreatRev,2017,58：70-76.唐淑慧,李丽,侯黎莉.PD-1 抑制剂免疫相关不良反应的研究进展 J.临床与病理杂志,2021,41（3）：720-725.14 CHIEN P L,LIU C F,HUANG H T,et al.Application of artifi-cial intelligence in the establishment of an association model be-tween metabolic syndrome,TCM constitution,and the gui-15dance of medicated diet careJ.Evid Based Complement Alter-nat Med,2021,2021：5530717.罗辉,李玲孺,王琦.气虚质与疾病的相关性:基于 332 项临床研究的文献计量分析 J.天津中医药,2019,36（7）：625-630.16收稿日期 2023-11-14 修回日期 2024-03-01本文编辑 李睿旻 (上接第 202 页)究所使用的人 METRNL ELISA 试剂盒特异性比较好，可以清晰区别人和鼠来源的 METRNL 蛋白。在小鼠培育过程当中，尚未发现R26-L-METRNL+/-小鼠和同窝对照 WT 小鼠在体重、形态等方面有何差异。根据图 2 中 R26-L-METRNL+/-小鼠的培育方式，采用 R26-L-METRNL+/-小鼠与 C57BL/6J 小鼠杂交进行扩大繁殖和保种，基于孟德尔遗传定律，后代鼠中 R26-L-METRNL+/-小鼠理论得率为50%，但实际中，我们发现该小鼠的得率仅为 15%左右，远低于理论值。这一现象非常有趣，因为此前本实验室构建过多种基因工程动物模型，均没有发现类似偏离孟德尔遗传定律的现象，而这一现象是否与 METRNL 蛋白的全身性过表达有关，值得我们进一步研究。【参考文献】LI Z Y,ZHENG S L,WANG P,et al.Subfatin is a noveladipokine and unlike Meteorin in adipose 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