-基因工程载体.pptx

14 基因工程载体载体载体：这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能的：这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能的DNA大分子称之为大分子称之为载体（载体（vector）。）。作为一个理想的载体，应具备以下条件：作为一个理想的载体，应具备以下条件：（1）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达；（2）具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源DNA片段插入其中；（3）具有容易检测的筛选标记；（4）载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝；（5）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。2载体的种类：1.克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可；2.表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子；3.穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。3一、质粒的一般特性一、质粒的一般特性n n(一)质粒的分布、大小、数目n n质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于某些真核细胞（酵母的（酵母的22环状质粒）。环状质粒）。n n质粒DNA分子量范围为1200106Da。n n一个细胞内的质粒数量变化也很大，有1至几个的，也有几十个的，甚至有数百个。（这取决于质粒的复制类型。如果质粒的复制是严紧型的，每个（这取决于质粒的复制类型。如果质粒的复制是严紧型的，每个细胞只有细胞只有1 1个至几个质拉；如果质粒的复制是松弛型的，每个细胞个至几个质拉；如果质粒的复制是松弛型的，每个细胞中质粒有中质粒有10-20010-200拷贝数。）拷贝数。）4(二)质粒DNA的构型n n三种不同的构型：n n当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形共价闭合环形DNA(cccDNA)DNA(cccDNA)，这样的，这样的DNADNA通常呈现超螺旋通常呈现超螺旋的的SCSC构型；构型；n n如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环开环DNA(ocDNA)DNA(ocDNA)。n n若质粒若质粒DNADNA的双链均发生断裂而形成线形分子，则通称为的双链均发生断裂而形成线形分子，则通称为L L构型构型。5单链切割连接单链切割连接共价闭合环形DNA（SC型）开环DNA（oc型）线性DNA（L型）环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型6(三)质粒DNA的理化性质n n质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。n n能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，n n在一定在一定pHpH下可解离而带电荷下可解离而带电荷n n能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。n n比较能抗切割和抗变性。比较能抗切割和抗变性。7(四)质粒DNA的生物学特性 (1)(1)寄生性：寄生性：质粒只能在宿主的细胞内复制。质粒只能在宿主的细胞内复制。(2)(2)稳定性：稳定性：每种质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。每种质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。(3)(3)同源性：同源性：不同质粒之间可能存在一定的同源区。不同质粒之间可能存在一定的同源区。(4)(4)重组性：重组性：两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质粒两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质粒处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与染色处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与染色体之间的重组。体之间的重组。(5)(5)不相容性：不相容性：有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿主有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中。该不相容性的分子基础主要是由于它们在复制功能之间细胞中。该不相容性的分子基础主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。的相互干扰造成的。8n n(6)(6)传递性传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的质粒带有一套与传递有关的基因。质粒带有一套与传递有关的基因。n n(7)(7)消除性消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将其去除。其去除。n n(8)(8)复制类型复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制。合成的严格控制。n n(9)(9)表现型表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗性等。性等。9(五)质粒的命名原则n n1976年提出一种质粒命名的原则，用小写字母p代表质粒，在p字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称。如pUC118,字母p代表质粒，UC是构建该质粒的研究人员的姓名，118代表构建的一系列质粒的编号。10二、组建理想质粒载体必须具备的条件n n(一)质粒拷贝数较高n n质粒拷贝数是指生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。11根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：n n严紧型严紧型n n松弛型松弛型 高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可高达高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可高达10-6010-60份拷贝，这类质粒被称为份拷贝，这类质粒被称为“松弛型松弛型”复制控制的质粒复制控制的质粒(relaxed plasmid)(relaxed plasmid)。低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有1-31-3份的拷贝，称这类质粒为份的拷贝，称这类质粒为“严紧型严紧型”复复制控制的质粒制控制的质粒(stringent plasmid)(stringent plasmid)；12(二)分子量较小低分子量的质粒如下优点低分子量的质粒如下优点 通常拷贝数较高通常拷贝数较高 克隆时所预期的基因表达产物的数量较大克隆时所预期的基因表达产物的数量较大 限制酶的切点相应减少，有可能找到合适的单一限制限制酶的切点相应减少，有可能找到合适的单一限制酶切点，便于制作酶切图谱。酶切点，便于制作酶切图谱。外源外源DNADNA容量较大，容量较大，容易转化，当质粒大于容易转化，当质粒大于15kb15kb时，将成为转化效率的制时，将成为转化效率的制约因素。约因素。遗传工程操作时容易拿捏，容易分离，不易断裂。遗传工程操作时容易拿捏，容易分离，不易断裂。13(三)带有可供选择的标记n n常采用的标记是对某种抗生素的抗性，如氨卞青霉素抗性(Ampr)、卡那霉素抗性(Kanr)、四环素抗性(Tetr)等，而且希望各抗性基因内有若干单一的限制酶切点。n n在克隆时通过单一酶切点插入外源基因，使该抗性基因失活、宿主菌变为对该抗生素敏感的菌株，这样较易检查到克隆是否成功。14-半乳糖苷酶筛选系统：n n载体上带有一个来自大肠杆菌的载体上带有一个来自大肠杆菌的laclac操纵子的操纵子的DNADNA区段，这一区段区段，这一区段编码编码-半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段。半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段。IPTG(IPTG(异丙基异丙基-D-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷)可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的编码的-半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补(-(-互补互补)。故。故暴露于诱导物暴露于诱导物IPTGIPTG的细菌含有编码的细菌含有编码laclacZ Z的质粒可同时合成该酶的的质粒可同时合成该酶的两种片段，该菌在其生色底物两种片段，该菌在其生色底物X-gal(5-X-gal(5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-半乳半乳糖苷糖苷)的培养基上生长，将形成蓝色茵落。将一连串克隆位点克隆的培养基上生长，将形成蓝色茵落。将一连串克隆位点克隆入入-半乳糖苷酶氨基端的基因中，外源半乳糖苷酶氨基端的基因中，外源DNADNA插入质粒的多克隆位插入质粒的多克隆位点后可使点后可使-半乳糖苷酶的氨基端片段灭活，从而破坏了半乳糖苷酶的氨基端片段灭活，从而破坏了-互补互补作用。因此，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。利用这种筛作用。因此，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子从空载体中筛选出来。选方法可方便地将含目的基因的重组子从空载体中筛选出来。15lacZ-半乳糖苷酶半乳糖苷酶分解分解半乳糖半乳糖iPO调控蛋白调控蛋白P大肠杆菌的大肠杆菌的-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ系统系统16a-互补显色反应（蓝白斑筛选）互补显色反应（蓝白斑筛选）lacZ-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-分解半乳糖分解半乳糖iPO调控蛋白调控蛋白P-肽段肽段分解分解X-gal产物呈现蓝色产物呈现蓝色诱导剂诱导剂IPTG-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ突变体突变体M1517(四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点n n单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入；n n较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地供带有不同末端的外源基因插入。目前常用载体上的多克隆位点(MCS)即具有该功能。18(五)具有复制起始点(origin,ori)n n这是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，也是决定质这是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，也是决定质粒拷贝数的重要元件可使繁殖后的细胞维持一定数量粒拷贝数的重要元件可使繁殖后的细胞维持一定数量的质粒拷贝数。的质粒拷贝数。n n例如含例如含ColE1ColE1或或pMB1pMB1复制起始点复制起始点的质粒即为的质粒即为松弛型质粒松弛型质粒。n n在一般情况下，一个质粒只含有一个复制起始点，构成在一般情况下，一个质粒只含有一个复制起始点，构成一个独立的复制子。一个独立的复制子。穿梭质粒含有两个复制子，穿梭质粒含有两个复制子，一个是一个是原核生物复制子、另一为真核生物复制子，以确保其在原核生物复制子、另一为真核生物复制子，以确保其在两类细胞中均能得到扩增。两类细胞中均能得到扩增。19三、常用的质粒载体n npSC101质粒载体是第一个成功用于克隆真核DNA的大肠杆菌质粒载体。n npBR322是用人工方法构建的符合理想质粒载体条件的好载体，一度曾得到广泛的应用。n n(一)克隆载体201.质粒质粒重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制松弛型复制松弛型复制松弛型复制 pBR322pBR322：氯霉素可扩增氯霉素可扩增氯霉素可扩增氯霉素可扩增拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数 50-100/50-100/cellcell用于基因克隆用于基因克隆用于基因克隆用于基因克隆 21222.pUC质粒载体 (1)来自pBR322质粒的复制起点(ori)；(2)氨卞青霉素抗性基因(Ampr)，但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制酶的单识别位点；(3)大肠杆菌-半乳糖苷酶(lacZ)的启动子及其编码该基因氨基端-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ1基因；(4)多克隆位点(MCS)区段：位于lacZ 基因中的靠近5端，内含十几个单一的限制性内切酶识别切割位点，使含有不同粘端的目的DNA片段可方便地定向插入载体中。但它并不破坏lacZ 基因的功能。23pUC18 pUC18/19/19：拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数 2000-3000/2000-3000/2000-3000/2000-3000/cellcellcellcell用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（装有多克隆位点（装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCSMCSMCSMCS）正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZlacZlacZ 24pUC18质粒载体n n优点优点:n n(1)具有更小的分子量 在基础上构建在基础上构建pUCpUC质粒载体时，仅保留下质粒载体时，仅保留下pBR322pBR322的氨卞青霉素抗的氨卞青霉素抗性基因及复制起点，使其分子大小相应地缩小了许多如性基因及复制起点，使其分子大小相应地缩小了许多如pUC8pUC8为为2750bp2750bp，pUC18pUC18为为2686bp2686bp。n n更高的拷贝数：pBR322pBR322质粒的复制起点内部发生了自发的突质粒的复制起点内部发生了自发的突变，即变，即roprop基因的缺失。由于该基因编码的共基因的缺失。由于该基因编码的共6363个氨基酸组成的个氨基酸组成的RopRop蛋白质，是控制质粒复制的特殊因子，因此它的缺失使得蛋白质，是控制质粒复制的特殊因子，因此它的缺失使得pUC8pUC8质粒的拷贝数比带有质粒的拷贝数比带有pMBlpMBl或或ColE1ColE1复制起点的质粒载体都要高得多，复制起点的质粒载体都要高得多，n n平均每个细胞即可达平均每个细胞即可达500-700500-700个拷贝。所以由个拷贝。所以由pUC8pUC8质粒重组体转化质粒重组体转化的大肠杆菌细胞，可获得高产量的克隆的大肠杆菌细胞，可获得高产量的克隆DNADNA分子。分子。25(2)便于重组子的检测:n npUC18质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用。因此，在应用pUC18质粒为载体的重组实验中，可用X-gal显色法一步实现对重组子克隆的鉴定。26lacZlacZN端端 C端端缺陷型大肠杆菌缺陷型大肠杆菌完整的完整的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶27pUC18 pUC18/19/19：正选择标记正选择标记 lacZlacZ 的显色原理的显色原理pUC18pUC18/19/19PlacPlaclacZlacZ MCSMCSb-b-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的a-a-肽段肽段a ab b5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚基吲哚基-b-D-b-D-半乳糖苷半乳糖苷X-galX-gal28(3)具有多克隆位点(MCS)区段n npUC18质粒载体具有与M13mP8噬菌体载体相同的多克隆位点(MCS)区段，它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。因此，克隆在MCS当中的外源DNA片段，可以方便地从pUC18质粒载体转移到M13mp8载体上，n n也正是由于具有MCS序列，可以使具两种不同粘性末端(如EcoRI和BamHl)的外源DNA片段，无需借助其它操作而直接克隆到pUCl8质粒载体上。293.pGEM系列n总长度为2743bpn含有一个氨卞青霉素抗性编码基因和一个lacZ编码基因n一段含有EcoR I、Sat I、Kpn I、Ava I、Sma I、BamH I、XbaI、Sall、AccI、Hinc I、Pst II、Sph I和Hind II等识别序列的多克隆位点。n此序列结构几乎与pUC18克隆载体的完全一样。30pGEM系列与pUC系列之间的主要差别npGEM具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。n由于这两个启动子分别位于Lac z基因中多克隆位点区的两侧，故若在反应体系中加入纯化的识别T7或SP6启动子的RNA聚合酶，便可将已克隆的外源基因在体外转录出相应的mRNA。n质粒载体pGEM-3Z和pGEM-4Z在结构上基本相似，两者之间的差别仅仅在于SP6和T7这两个启动子的位置互换、方向相反而已。pGEM-3ZpGEM-3Z：多拷贝多拷贝多拷贝多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（装有多克隆位点（装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCSMCSMCSMCS）正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZlacZlacZ 用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达 注意：注意：注意：注意：T7T7T7T7和和和和SP6SP6SP6SP6启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体DNADNADNADNA编码的编码的编码的编码的RNARNARNARNA聚合聚合聚合聚合2743 bp2743 bp2743 bp2743 bpMCSMCSMCSMCSlacZlacZlacZlacZ P P P PT7T7orioriorioriApApApAprrpGEM-3ZpGEM-3ZpGEM-3ZpGEM-3ZP P P PSP6SP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNARNARNARNA聚合酶，如聚合酶，如聚合酶，如聚合酶，如：E.coliE.coliE.coliE.coli BL21 BL21 BL21 BL21（DE3DE3DE3DE3）等等等等32(二)表达载体n n条件：一个强启动子及其两侧的调控序列;n n有SD序列且该序列与起始密码于ATG之间要有合适的距离n n在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架；外源基因下游有转录终止子等。331.pKK表达质粒载体 n npKKpKKpKKpKK启动子为启动子为PtacPtac，由大肠杆菌强启动子，由大肠杆菌强启动子PtrpPtrp和和PlacPlac杂合杂合组成。组成。n npKK233-3pKK233-3表达载体含有表达载体含有tactac启动子、启动子、lacElacE的的RBSRBS、pUC18pUC18的的多克隆位点，在远端还有一个多克隆位点，在远端还有一个rrnBrrnB的转录终止信号。的转录终止信号。n npKK233pKK2332 2，它的特点是，它的特点是RBSRBS的下游的下游8 8个核苷酸处有一个个核苷酸处有一个ATGATG序列，该序列，该ATGATG和它的前后核苷酸和它的前后核苷酸(CCATGG)(CCATGG)一起又组成一起又组成了了Nco INco I位点，其后又有可供插入用的位点，其后又有可供插入用的Pst IPst I及及HindIIIHindIII位位点，最后接上点，最后接上rrn Brrn B的转录终止信号。的转录终止信号。34n n外源外源DNADNA可有可有3 3种插人法种插人法将将Nco INco I位点切开补齐后与外源位点切开补齐后与外源DNADNA平端连接；平端连接；如外源如外源DNADNA亦含翻译起始亦含翻译起始ATGATG，Nco INco I位点则可直接连接，位点则可直接连接，如为其他位点可加入如为其他位点可加入Nco INco I接头后连接接头后连接(使用使用8 8，1010或或1212个个核苷酸的核苷酸的NcoINcoI接头以获得正确的读码框架接头以获得正确的读码框架)；使用使用Pst IPst I或或HindHind皿位点，但此时会在表达蛋白的皿位点，但此时会在表达蛋白的N-N-末端末端增加增加2-52-5个氨基酸。较新的表达载体是个氨基酸。较新的表达载体是pKK388-IpKK388-I，它亦含，它亦含有有tactac启动子及启动子及rrnBrrnB抗终止序列、抗终止序列、RBSRBS以及下游以及下游8 8个核苷酸个核苷酸处的处的Nco INco I位点，紧接着是来自位点，紧接着是来自pUCl8pUCl8的多位接头，最后的多位接头，最后是是rrnBrrnB的转录终止信号。的转录终止信号。352.融合表达载体系统 n n组成成分：含有启动子(tac)及lac操纵基因、SD序列 谷胱苷肽巯基转移酶(GST)基因，而克隆的外源基因则与GST基因相连。当基因表达时，表达产物为谷胱苷肽巯基转移酶与目的基因的融合体。36该载体具有以下优点：该载体具有以下优点：可诱导，能高效表达所需基因或基因片段。IPTG可诱导tac启动子进行高效表达。融合蛋白极易纯化。谷胱苷肽巯基转移酶GST分子量为25kDa，作为一种酶在大肠杆菌表达或与外源基因融合表达时，与自然界存在的酶具有相同的酶活性，用亲和层析法(G1utathione Sepharose 4B)极易从裂解液中分离纯化出融合蛋白，也可用显色法或免疫学方法方便地检测外源蛋白的表达量。37可方便地从融合蛋白中获取单一外源蛋白。在pGEX多克隆位点上游有一个位点特异的蛋白酶(如凝血酶、prescission protease，Factor Xa)识别和切割位点，可方便地将所需蛋白从融合蛋白中切出并纯化。所以，近年来该系统已广泛地应用于基因表达、分子免疫学、疫苗生产及DNA蛋白质相互作用的研究等。38QIAexpress 6His表达系统n该系统为Ni-NTA基质对带6个组氨酸残基的重组蛋白质具有亲和层析的高效原核表达系统，n优点：6His比其它标记更小，可用于任何表达系统，包括酵母、杆状病毒和哺乳动物细胞表达系统，不影响蛋白质的结构和功能，无需蛋白酶把6His切除。生理pH条件下6His不带电荷，所以不影响蛋白质的分泌。因5His免疫原性差，所以无需去除6His,重组蛋白可直接用作抗原产生所需抗体。39一、噬菌体n n噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。n n基因组长度：约为50kb的双链DNA分子，实际大小为48502bp。n nDNA是线状双链分子带有单链的互补末端，末端长12个核苷酸，称为粘性末端，简写cos，12个碱基的序列为5-GGGCGGCGACCT-3。当噬菌体感染宿主细胞后，双链DNA分子通过cos而成环状。40图图3-1 噬菌体基因组结构噬菌体基因组结构n n61个基因，每个基因平均为1000bp，其中32个较为重要，它们的分布和排列与其功能有一定关系。41基因组分为几个不连续的区域，三个片段组成：n n（1 1）左臂，）左臂，19.6kb19.6kb，含噬菌体头、尾蛋白质编码基因，含噬菌体头、尾蛋白质编码基因，A AJ J的的1212基因都是基因都是构成外壳蛋白的基因，其中构成外壳蛋白的基因，其中A AE5E5个基因与头部形成有关，个基因与头部形成有关，G GJ5J5个基因与尾个基因与尾部形成有关。部形成有关。n n噬菌体左右两臂包含了噬菌体左右两臂包含了复制和成熟所必须的全部机能蛋白编码，而复制和成熟所必须的全部机能蛋白编码，而中央片段为非必中央片段为非必需区需区，即位于，即位于J J基因和基因和N N基因之间的片段可被其他大肠杆菌基因之间的片段可被其他大肠杆菌DNADNA片段所替换。片段所替换。（2 2）中央片段，）中央片段，12kb12kb24kb24kb，含，含PLPL控制控制redred和和gamgam基因。基因。n n（3 3）右臂，）右臂，9kb9kb11kb11kb，含，含DNADNA复制和溶菌有关的蛋白编码基因。与裂解有关的复制和溶菌有关的蛋白编码基因。与裂解有关的S S和和n nR R基因、与基因、与DNADNA复制有关的复制有关的OO基因和基因和P P基因等也都分别聚集在一起。基因等也都分别聚集在一起。42n n噬菌体感染大肠杆菌后呈现两种类型的生长方式，即溶菌性反应与溶源性反应。n n在感染早期，当 噬菌体 DNA 进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状 DNA 分子，而后在宿主细胞的 DNA 连接酶和旋促酶（gyrase）作用下，形成封闭的环状 DNA 分子，充当转录的模板。43噬菌体的两条复制途径：n n（一）裂解生长：（一）裂解生长：噬菌体立即进行PL和PR启动子启动的N和ro基因转录。早期转录产生的N蛋白可使RNA聚合酶越过早期终止子而启动O、P和Q基因转录。O、P产物与复制有关，Q基因蛋白则与噬菌体的头、尾部包装和溶菌有关。DNA进入复制和滚环式复制，同时进行包装，最后导致细菌溶解，释放出子代噬菌体。经过 4045min 的生长循环，释放出约 100 个感染性噬菌体颗粒（每个细胞），成熟后使细菌裂解，释放出许多新的有感染能力的病毒颗粒。n n感染细菌后，感染细菌后，噬菌体的噬菌体的c c基因产物基因产物 抑制蛋白结合于抑制蛋白结合于OLOL和和OROR操纵子操纵子，阻断早期转录，阻断早期转录，噬菌体则关闭自己的大部分基因并噬菌体则关闭自己的大部分基因并整合到宿主染色体整合到宿主染色体，然后象细菌染色体上的基因一样，然后象细菌染色体上的基因一样进行复制，并传递给下一代细菌。进行复制，并传递给下一代细菌。（二）溶源性生长：44噬菌体的缺陷与改造 噬菌体的改造噬菌体的改造噬菌体的改造噬菌体的改造 基因组太大（基因组太大（49kb）；）；酶酶切切点点太太多多，它它有有5个个BamH1位位点点（GGATCC），6个个Bg位位点点（AGATCT），），5个个EcoR位点（位点（GAATTC）。）。野生型只能接纳一定长度的野生型只能接纳一定长度的DNA。若相当于。若相当于噬菌体的噬菌体的75-105%，那么只能接纳那么只能接纳49kb5%=2.45kb的的DNA。切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）；或更大）；去处太多的酶位点，每种酶只留去处太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口；个切口；增加标记基因（增加标记基因（remarke gene）。）。(4)(4)引入无义突变引入无义突变噬菌体的缺陷：噬菌体的缺陷：45二、噬菌体载体n n野生型噬菌体具有大而复杂的基因组，必须经过改造才野生型噬菌体具有大而复杂的基因组，必须经过改造才能用作载体：能用作载体：n n现在用的现在用的载体大都载体大都减少或增加某些限制性内切酶减少或增加某些限制性内切酶的的酶切位点酶切位点：野生型有：野生型有6565种限制酶酶切点，除种限制酶酶切点，除ApaApa、NaeNae、NarNar、NheNhe、Sna BSna B、XbaXba和和XhoXho等等7 7种限种限制酶各有一个切点外，其余都多于制酶各有一个切点外，其余都多于2 2个。有些酶切点在个。有些酶切点在增殖所必需的基因区域内。增殖所必需的基因区域内。n n将将噬菌体的噬菌体的非必需区做部分切除非必需区做部分切除n n插入了某种插入了某种报告基因报告基因461.噬菌体载体的类型n n两种类型：置换型 插入型置换型载体：可被外源DNA置换的噬菌体非必需区两侧有一对限制性酶切位点的载体，称为置换型载体。插入型载体：有一类只含一个限制性位点可供插入外源DNA的载体，这类噬菌体载体称插入型载体。47置换置换型载体n特殊性质：特殊性质：中间区域约长18kb，这一段DNA可以被外源置换而不会影响噬菌体裂解生长的能力。只有DNA的长度大于野生型噬菌体DNA长度的75而不超过其105时，才能被包装成噬菌体颗粒，当DNA的长度短于野生型的75%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降，因此要求载体DNA和外源DNA长度之和在3953kb之间。48这一特殊性质作为选择标记：n重组子被包装：当EcoR切开DNA后，目的基因可以连接于左右两臂之间，形成足够长度的DNA片段而被包装。n非重组子不被包装：如果没有外源DNA插入，由左右两臂直接融合起来的缺损基因，由于长度不足，不能包装。49Xgal蓝色噬菌斑试验n区分重组噬菌体形成的噬菌斑和重新恢复的载体噬菌体形成的噬菌斑的方法：n噬菌体载体带有编码-半乳糖苷酶的基因，当这种噬菌体感染lac宿主细胞并在含有X-gal的培养基上生长时，半乳糖苷酶与X-gal反应的产物为不溶性的靛蓝染料。蓝色噬菌斑蓝色噬菌斑-含有中间片段的不带有外源基因的噬菌体形成含有中间片段的不带有外源基因的噬菌体形成 无色透明噬菌斑无色透明噬菌斑-含外源含外源DNADNA的重组噬菌体形成的噬菌斑的重组噬菌体形成的噬菌斑50加装选择标记加装选择标记加装选择标记加装选择标记 lacZlacZlacZlacZlacZlacZ基因编码基因编码基因编码基因编码b-b-b-b-半乳糖苷酶，能催化无色的半乳糖苷酶，能催化无色的半乳糖苷酶，能催化无色的半乳糖苷酶，能催化无色的X-X-X-X-galgalgalgal生成蓝色化合物。当外源基因插入到生成蓝色化合物。当外源基因插入到生成蓝色化合物。当外源基因插入到生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZlacZlacZlacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体空载体空载体空载体l-DNAl-DNAl-DNAl-DNA则产生蓝色透明斑则产生蓝色透明斑则产生蓝色透明斑则产生蓝色透明斑51n nEg.凯伦噬菌体载体 n n这类载体有插入型的，如Charon2；也有替换型的，如Charon30。在基因操作中用途很广。n nCharon载体上具有适当数量的限制酶切位点，带有来自大肠杆菌的-半乳糖苷酶基因lacZ（中央区段）。插入基因经包装后，可通过蓝/白斑筛选阳性克隆。n nCharon载体的特点是容量大，对研究大范围内的染色体结构很有用处。52插入型载体：插入型载体：n有一类只含一个限制性位点可供插入外源DNA的载体，这类噬菌体载体称插入型载体。失去了非必需区仅保留了EcoR的单一切点切点又位于报告基因上，故在切开DNA并插入外源基因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选可插入长度为10kb的外源DNA53插入型载体插入型载体-gt-gt系列系列nc基因内保留Hind和EcoR单酶切位点，当有外源DNA在这酶切位点插入时，使c基因失活，感染hf-大肠杆菌后可形成空斑。54插入型载体插入型载体-gt-gt系列系列-gtll-gtlln n在噬菌体在噬菌体DNADNA插入的插入的lacZlacZ基因末端设有单一的基因末端设有单一的EcoREcoR酶切位点酶切位点。在此处插入外源基因，可表达在此处插入外源基因，可表达-半乳糖苷酶的融合蛋白半乳糖苷酶的融合蛋白，利用，利用特异性抗体或特异性抗体或DNADNA测序方法可测序方法可筛选重组筛选重组DNADNA。这类载体适宜构建。这类载体适宜构建cDNAcDNA文库文库55注意：噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能：38kb 52kb。体外包装：噬菌载体+尾部蛋白+头部蛋白 噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。19781978年年CollinsCollins和和HohnHohn构建一种新型的大肠杆菌克隆载体，命名为构建一种新型的大肠杆菌克隆载体，命名为cosmid(cosmid(柯斯质粒柯斯质粒)，又，又叫粘粒。叫粘粒。柯斯质粒（柯斯质粒（cosmidcosmid）=cos=cos序列序列+质粒。质粒。实际是质粒的衍生物，它是用正常的质粒同实际是质粒的衍生物，它是用正常的质粒同 噬菌体的噬菌体的coscos位点构成。位点构成。三、柯斯质粒三、柯斯质粒三、柯斯质粒三、柯斯质粒561.1.粘粒的组成及性质：粘粒的组成及性质：n它的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段 DNA 克隆的最大 DNA 片段可达45kbn质粒复制起点（colE1）象质粒一样转化和增殖n抗性标记amprn cos位点n有的粘粒载体含有两个cos位点57pHC79pHC79pHC79pHC796400 bp6400 bp6400 bp6400 bpTcTcTcTcrrl fragmentl fragmentl fragmentl fragmentcoscoscoscosorioriorioriApApApAprrPstIPstIPstIPstIBamHIBamHIBamHIBamHISalISalISalISalIl-DNA l-DNA l-DNA l-DNA coscoscoscos序列和质粒复制子的序列和质粒复制子的序列和质粒复制子的序列和质粒复制子的coscoscoscos site-carrying plasmid site-carrying plasmid site-carrying plasmid site-carrying plasmid 1.8 1.8 1.8 1.8 kbkbkbkb的的的的l-DNAl-DNAl-DNAl-DNA片段片段片段片段+pBR322pBR322pBR322pBR322片段片段片段片段 装载范围为装载范围为装载范围为装载范围为31-45 31-45 31-45 31-45 kbkbkbkb582.柯斯质粒pHC79系n n由质粒由质粒pBR322pBR322和和噬菌体的噬菌体的coscos位点的一段位点的一段DNADNA构成，全长构成，全长43kb43kb。n n在包装时，在包装时，coscos位点打开而产生位点打开而产生噬菌体的粘性末端。由于噬菌体的粘性末端。由于pHC79pHC79有有pBR322DNApBR322DNA，所以也就有氨苄青霉素抗性和四环素抗性两个标记。，所以也就有氨苄青霉素抗性和四环素抗性两个标记。n n凡具有凡具有coscos位点的任何位点的任何DNADNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体的颗粒。噬菌体的颗粒。n n因此，插入柯斯质粒的外源因此，插入柯斯质粒的外源DNADNA可大于可大于40kb40kb。重组的柯斯质粒可象。重组的柯斯质粒可象噬菌体一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。如把宿主菌噬菌体一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。如把宿主菌在含氯霉素的培养基中生长，柯斯质粒可以扩增到宿主细胞在含氯霉素的培养基中生长，柯斯质粒可以扩增到宿主细胞DNADNA总总量的量的50%50%左右。左右。593.柯斯质粒有以下优越性：n n 能象-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞；n n可以装载比质粒或-DNA大得多的外源DNA片段，如cos区及附近顺序长为1.7 kb，质粒长为3.3kb，则该柯斯质粒最大可装载46.5kb的外源DNA；n n 由于携带质粒的选择标记，便于筛选；n n 由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。60n n常用的粘性粒有PHC79、PJB8、MUA-3和KOSI等，它们大多具有一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点。采用这种大容量载体不仅可减少构建基因组DNA文库的重组克隆数目，减少工作量，提高筛选时的阳性检出率，而且极其适合高等真核基因的克隆工作。614.采用柯斯质粒作载体的困难n n载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，因此往往会出现载体同载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；62 大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出303045kb45kb的外源的外源DNADNA插入载体插入载体DNADNA，此时，此时，每个载体只可能插每个载体只可能插入一个外源片段入一个外源片段，因为如果二处片段，则将超过包装成，因为如果二处片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度；噬菌体颗粒的限度；63 细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。64四、M13 噬菌体载