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细胞工程 知识点总结一、细胞工程(Cell Engineering)：在体外对生物的细胞进行生长与分化的调控、遗传重组与改良，使其生产出人类所需要的产品。包括:细胞培养、细胞融合、细胞器移植、核质移植、染色体移植、转基因等产品：生物的组织、器官、个体；抗体、多肽药物、蛋白质、酶； 天然药物、色素、香精；等二、生物工程包括：发酵工程、酶工程、细胞工程、基因工程、蛋白质工程.三、1996年Dolly羊的克隆是通过核移植技术，最后在体内生长、分化、发育而成的。四、植物组织培养：在人工培养基上无菌培养整株植物或植物的器官、组织、细胞或原生质体。又称为无菌培养(aseptic culture）、离体培养（in vitro culture）。五、植物组织培养的类型:1、植株培养（Plant Culture）:在容器（玻璃瓶、透明塑料瓶等）中无菌培养完整的植株.植株来源：由种子无菌萌发而来；通过植物器官、组织、细胞再生而来。在快速繁殖中，后期的成苗和壮苗阶段属于植株培养。(一般时间较短）2、胚培养（Embryo Culture）：无菌培养植物的成熟胚或未成熟胚，使其形成正常的植株。目的:促进胚的提早萌发，缩短育苗时间； 克服远源杂种胚的夭折，以获得新的育种材料； 在科学研究中，用胚培养所得到的幼苗作为其它试验的材料.3、器官培养（Organ Culture）：无菌培养植物的根、茎、叶、芽、花、果等器官，使其增殖或形成其它的组织或器官等。4、组织培养(Tissue Culture）：指无菌培养植物各种组织（如分生组织、形成层、木质部、韧皮部、皮层、薄壁组织、胚乳等),或由外植体分化形成的愈伤组织(callus），使其增殖或者分化。 注：Callus(愈伤组织）：具有旺盛分裂能力，但没有组织和器官分化的细胞群。5、花药与花粉培养：无菌培养植物的花药（带花粉)或花粉，形成单倍体植株。补充：有效的育种辅助手段：单倍体植株获得以后，通过染色体加倍，即得到可以稳定遗传的纯和二倍体，缩短植物育种年限.6、细胞培养：（Cell Culture）：无菌培养植物的单细胞或小细胞团。细胞培养可用于:植物克隆； 细胞系的诱变和变异体的筛选； 生产有用化合物（useful chemicals)。7、原生质体培养（Protoplast Culture）：将无细胞壁的原生质体培养成愈伤组织或植株。(注：由于无细胞壁的障碍，原生质体是实现远源植物间大规模遗传物质重组的良好体系.)六、植物组织培养简史1838年：Schwann 和Schleiden在细胞学说基础上提出了细胞全能性（totipotency）假说：一个高等生物（动物和植物)身上所有的体细胞(somatic cells）均来自一个共同的细胞合子（受精卵）;在适当的条件下,一个体细胞应能像合子一样具有发育成一个完整个体的能力。细胞全能性假说是开展植物组织培养研究的理论基础；验证细胞全能性假说是开展植物组织培养研究的动力。哈布兰特：植物组织培养研究第一人；1902年，德国植物学家Haberlandt根据Schwann和Schleiden创立的细胞学说提出了细胞全能型（totipotency）理论。1934年，美国植物生理学家White由培养番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系。1937年,White研配了综合培养基（White培养基）,并发现了B族维生素和生长素。1952年，Morel和Martin首次证实，通过茎尖分生组织离体培养，可以由已受病毒侵染的大丽花中获得无病毒植株。19581959年，Reinert和Steward分别报道,在胡萝卜素愈伤组织培养中形成了体细胞胚，该实验第一次证明了植物细胞的全能性。1962年，Murashige和Skook发表了著名的植物组织培养基-MS培养基.1967年,Bourgin和Nitsh等通过花粉粒培养获得烟草单倍体植株.七、植物组织培养技术的应用1、植物科学研究的有效手段;2、快速繁育植物的优良品种；3、挽救和保存植物的优良品种,挽救濒危植物资源；4、在植物性状改良上的应用 胚培养可克服远源杂交不孕的困难; 花药（花粉）培养可大大缩短育种年限； 原生质体融合技术可克服有性杂交不亲和，创造远源杂种、甚至新的物种； 单细胞培养技术可用于突变体的筛选; 植物转基因技术为人们定向、快速改良植物性状、培育新品种提供了方便（但植物转基因必须依赖于植物组织培养技术植物离体再生技术）.5、生产有用物质（useful chemicals)八、植物组织培养技术的优点1、不受气候、季节和地理位置的影响;2、不受病虫害的影响；3、植物生长发育过程容易调控，容易根据市场需求调节生产；4、效率高、质量好。九、植物组织培养的设施1、试剂与设备化学试剂（用于配制培养基）无机试剂：硝酸钾、硝酸铵、硝酸钙、硫酸钾、硫酸镁、硫酸铵、硫酸铜、硫酸亚铁、磷酸氢二钾、氯化钙、硼酸、钼酸钠等。有机试剂：维生素（B1、 B6、烟酸、生物素)、氨基酸、糖（碳源）、植物激素、凝固剂以及其它一些物质。无菌设备 灭菌锅（autoclave）:最常用消毒的工具。 种类多：手提式（如常见的医用消毒锅，体积小）、立式（体积中等）和卧式(有中型和大型）之分；有自热式（带有加热装置）和外热式（无加热装置，需要从外部加热，如煤气、电炉、蒸气等）之分。使用什么样的灭菌锅，要根据植物组织培养的目的和规模而定。 超净工作台（laminar air-flow cabinet）：用于对植物材料进行无菌操作。超净工作台=空气过滤器，空气经过12次粗滤后，最后通过孔径为0。2-0.4m的滤网。是细胞工程中必不可少的一种设备。超净工作台可以分为双人和单人、单面和双面、水平风和垂直风等类型。培养室(Culture room)植物材料需要在一个可控温、控光、洁净的地方进行培养。如规模小，则有12个培养箱即可。培养箱体积小，不占地方，控温、控光条件好，很适合于摸索植物材料的培养条件和科学研究。缺点是空间小、价格昂贵（7000-10000元/台）。2、培养室所需要的设备培养架：培养架的设计既要考虑充分利用培养室的空间，也要考虑取放材料方便；加温/降温设备：空调；光照和控光设备。分为光培养室和暗培养室。光培养室常用日光灯照明，并安置控制光照时间的自动开关。3、培养容器玻璃容器：如试管、三角瓶、果酱瓶、罐头瓶、饮料瓶等.玻璃瓶耐高温消毒、透明（便于观察），且为惰性物质，对植物材料的生长影响小，是组培中用得最广的容器，但容易破碎.透明塑料容器:轻巧，不易破碎，但不耐反复高温消毒，而且有些塑料容器在高温消毒时会释放一些有害的物质，影响材料的生长.容器封口：良好的封口用品要求做到既可以防止污染和容器内水分的过分散失，又要做到透水、透气。棉塞、锡箔纸、耐高温的塑料纸(如培养食用菌的聚丙烯塑料袋）。其中以棉塞是最好。现在也有专用的封口膜和瓶塞.4、其它仪器和设备天平：需要1台万分之一的精密分析天平和百分比之一或十分之一的普通天平.冰箱：用于储藏一些不宜在常温下较长时间放置的药品和试剂，如维生素、氨基酸、激素、微量元素等.酸度计：植物的生长需要一定的pH值，因此需要对培养基的pH值进行测定、调节.酸度计测定pH值精度高，准确，但比较烦琐。如不是进行要求很高的培养(如单细胞培养、原生质体培养）或进行不同pH值对植物材料生长的影响，可以用pH试纸代替。蒸馏水器或者去离子水生产装置酒精灯解剖刀和镊子 摇床十、植物组织培养室的设计植物组织培养工作按内容不同可以分为3个的过程:1.培养基的准备:包括试剂的配制、容器的洗涤、培养基的制备与消毒等；2. 植物材料的无菌操作；3。植物材料的培养、观察与分析。植物组织培养要求无菌，因此，在设计植物组织培养实验室时既要考虑各环节的衔接,又要避免不必要的交叉,特别是商业化组培苗生产,更要特别注意防止污染。最好是三部分工作相互独立.十一、植物组织培养基1、培养基的组成培养基的重要性：植物材料生长的营养来源；调节植物材料生长与分化的主要途径。培养基的种类：共同之处:含有植物生长发育所必须的营养物质和生物活性物质；不同之处：营养物质的浓度不同。培养基的组分：水：要求纯净。应用蒸馏水、去离子水、而不用自来水；无机营养成分：大量元素: 大量元素：C， H, O， N， P， K， Ca， Mg， S； 微量元素:Fe, Cl， Cu， Mo， B, Zn, Mn; 不同培养基的无机盐（特别是大量元素）的浓度差异很大有机营养:维生素和氨基酸的总成 常用：肌醇、烟酸、维生素B6、维生素B1和甘氨酸等； 其它的维生素：维生素M（叶酸）、维生素B2（核黄素）、泛酸钙等; 其它氨基酸：谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺等； 关于培养基中有机成分的复杂性，要视材料培养难易而定。难培养的材料，则要增加有机成分的种类.碳源：最常用的糖是蔗糖（sucrose），但也有用葡萄糖(glucose)、果糖(fructose）或其它的糖（lactose, maltose），有时几种糖混用。糖是营养物质，但不是越多越好。培养基中糖的用量大多在1060g/L，一般为2030 g/L.植物生长物质:植物激素和植物生长调节剂的总称植物激素:植物合成的、微量就有显著效应的物质。植物生长调节剂：人工合成的、具有植物激素相似作用的物质。根据功能不同，植物生长物质共分为五大类：（1）生长素（Auxins）：吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸(IBA）、萘乙酸（NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸;生长素的作用:促进细胞分裂、增殖,导致愈伤组织的形成； 2，4DNAAIAA,IBA 控制器官的分化，诱导根的形成； IBANAAIAA（2）细胞分裂素（Cytokinins）：玉米素（ZT)、6-苄基氨基嘌呤（6-BA，BA,BAP)、激动素（KT)；细胞分裂素的作用：促进细胞分裂、增殖，导致愈伤组织的形成； 控制器官的分化，诱导芽的形成和增殖。（3）赤霉素的生理作用：赤霉素最显著的作用是促进细胞的伸长，也有打破种子休眠的作用.在植物组织培养中使用赤霉素主要是促进芽或茎的伸长.赤霉素对热不稳定，故不宜用高温法消毒。（4）乙烯的生理作用:促进果实成熟,加速植物衰老。植物组织培养极少使用乙烯（乙烯利)，相反，而是尽量控制乙烯的产生。（5）脱落酸(ABA）的生理作用：促进植物衰老的激素，植物组织培养很少用。在胚状体的诱导和培养中常常使用脱落酸，促进胚状体的成熟。（6）凝固剂：在植物组织培养中，琼脂（agar）是最常用的凝固剂，用量为612g/L。另外还有phytagel, Gelrite, 4g/L。（7）有机附加物 （Organic additives)水解酪蛋白、水解乳蛋白、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物：用量为0.110g/L，一般为0.53 g/L。椰子汁：100-200ml/L。这些物质的成分复杂、不明确,统称为有机附加物。当材料生长不好时，加入这些物质往往可以会明显改善材料的生长状况。（8)其他物质:防止与减缓植物材料褐化的物质：1）抗氧化剂：抗坏血酸(Vc)、L半光氨酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等。2)吸附剂：活性炭、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。活性炭吸附无选择性；改善培养效果、促进生根。 PVP专一吸附酚类物质。2、培养基母液的配制为了便于培养基的配制，实际操作过程中可以先将常用的成分配成一定浓度的母液（stock solution），然后在配各种试验培养基时取一定量的母液稀释。可以配成母液的是无机盐、有机成分和植物激素等.（1）无机盐母液的配制 大量元素母液的配制： 大量元素浓度比较高，故母液浓度(倍数)不能过大，否则溶解不完全,容易析出（特别是冬天),使用很不方便，一般为20、50或100倍. 另一个要考虑的问题是高浓度时有些离子之间发生会发生相互作用，形成沉淀，如SO42-、PO43-和Ca2+之间。因此，在母液浓度较高时,Ca盐要与硫酸盐、磷酸盐分开.母液浓度高时MgSO4和CaCl2要分开.如把KNO3、NH4NO3和CaCl22H2O配在一起(母液 I）,MgSO47H2O和KH2PO4配在一起（母液 II) ，这样,即使母液浓度达到100倍也不会出现沉淀。 微量元素母液的配制: 除铁盐外,其它微量元素可以全部配在一起，浓度常为100-200倍。 因为Fe2+容易变成Fe3+而形成沉淀，不利于植物材料的吸收，所以把FeSO4同Na2EDTA配在一起，形成络合铁。这种络合铁长期稳定,植物利用度高。其母液浓度为100200倍。配法是先分别将FeSO4和Na2EDTA溶解，然后等体积混合，边混合边搅拌，混合液为黄色。微量元素母液和铁盐要放在冰箱中保存。（2）有机成分母液的配制一种培养基的有机成分（氨基酸和维生素） 可以配在一起,100-200倍。有机成分母液应放在冰箱中保存，否则容易生霉、变质。（3)植物激素母液的配制每种植物激素要单独配一种母液，浓度为0。51.0mg/mL。激素不易溶于水,但易溶乙醇、二甲基亚砜，故可以用乙醇、二甲基亚砜先溶，再用水定容。对于生长素类激素，可以用稀碱助溶；对于细胞分裂素类激素，可以用稀酸助溶。激素母液也应在低温下保存。注意:无论是配哪种母液，各成分只有完全溶解后才能混合；各种母液都要帖上标签，标明成分、浓度和配制的时间！3、培养基的制备(1）根据植物材料、培养目的设计好试验培养基的配方（如选用何种基本培养基，糖、植物激素、琼脂和其它成分的浓度）,并且要准确无误的写在实验记录本上；(2)根据培养基的体积和母液浓度,求出各种成分的用量；（3)根据计算出来的结果，配成各种培养基.4、培养基的消毒培养基做好以后,要及时消毒，否则细菌和真菌极易在培养基滋生.这不仅会改变培养基的成分，而且菌物还会产生有毒的物质。培养基的消毒方法有如下几种：1）高温灭菌法：简单、易行；一次可以灭菌大量的培养基，最常用.所用的温度是121，压力是1.11.2大气压。高温消毒时应注意的问题：一定要先排气10 min，否则不能消毒不彻底；高温消毒后，培养基的pH值会下降0.2-0。5个pH单位；高温消毒过程中，培养基中有些物质会被破坏或发生沉淀.如蔗糖会水解成葡萄糖和果糖，葡萄糖变成葡萄糖酸等；有些物质甚至几乎完全被破坏，如赤霉素、玉米素等。物质破坏程度与消毒时间和压力有关.2） 过滤灭菌法除了高温消毒外，过滤消毒也是常用的消毒方法.由于过滤消毒不会破坏培养基的成分和改变培养基的pH值，所以在原生质体培养、单细胞培养时常用过滤消毒法对培养基进行灭菌。如果培养基中要使用一些热不稳定的物质，如ZT、GA3、核黄素等，则这些物质也要用过滤消毒法灭菌，其它成分可用高温消毒法灭菌。过滤灭菌的操作:先将微孔滤膜（孔径0.20.45 mm，用前最好在蒸馏水中浸泡数小时)装入滤头中，用纸或布将其包好，再高温灭菌；在超净工作台上取出滤头，用注射器吸取培养基或溶液，将注射器接在滤头入口端，推动注射器使培养基或溶液从滤头出口处流出,并用无菌容器收集滤液。过滤灭菌时要注意:溶液中的成分必须完全溶解，不能有悬浮物或沉淀物,否则会堵塞微孔滤膜。如确有悬浮物或沉淀物，应先离心。要注意滤膜是否破裂（使用时可根据经验判断；使用完后可检查滤膜）。过滤时不要用力过大，否则会导致滤膜破裂.过滤消毒法的缺点是操作比较烦琐,只适合少量培养基的灭菌，而且不能灭菌固体培养基.十二、外植体的表面消毒1、污染是植物组织培养的大敌！污染来源:1)植物材料自身污染；2）操作污染;3)培养基消毒不彻底;4）培养室不洁净而污染;2、外植体表面消毒的必要性外植体（Explant)：用于建立无菌培养的起始植物材料。表面消毒(Surface Sterilization)：（用消毒剂）杀死外植体表面其它生物（主要是细菌和真菌）的过程.必要性：植物材料表面都带有细菌和真菌，如消毒不彻底，细菌和真菌会在培养基中迅速生长，占据空间、消耗营养、分泌毒素，使植物材料死亡。因此,接种前对外植体进行有效的表面消毒是建立无菌培养的关键.表面消毒的要求：（1）最大限度地杀死细菌和真菌；（2）对外植体的毒害要尽可能的小。常用消毒剂：用于植物材料表面消毒的消毒剂有乙醇、氯化汞、次氯酸钠、双氧水等。3、消毒步骤：1)用自来水将材料冲洗干净。2)将材料上的水擦干，并剪成适当大小（长短）的小块（段）。3）在70%75的乙醇中10-60 S，然后迅速转入到其它消毒剂（氯化汞、次氯酸钠）中，消毒剂中可加入少量表面活性剂(Tween 20或80、家用洗涤剂等）,以增加消毒效果。4）消毒时间结束后，将材料转入无菌水中漂洗28次； 5）将材料的伤口部分切去后，再将其切成适当大小，及时接入到培养基中.注意:表面消毒是复杂而又灵活的过程。一次效果不好，可以进行两次、三次，还可以进行分步消毒。4、材料内部污染的控制无性繁殖的植物往往内部带菌（多为细菌），有些材料在培养较长时间后(几个月、甚至1年），特别是衰老、生长不旺后，容易出现污染。表面消毒不能杀死内部的细菌，可尝试下列方法：1)用分生组织作为外植体。因为分生组织内无维管组织，所以不带菌.2）在培养基中加抗菌素（青霉素、卡那霉素、四环素等），但高浓度的抗生素往往对植物材料生长发育也有抑制作用,而且抗菌效果有时不一定理想。 3）是尽量将材料切小些,并且每接一个外植体就将接种工具消毒一次,避免交叉感染。材料越小，污染的机会也就越小,但成活率越低. 十三、高等植物离体再生和无性繁殖1、高等植物的繁殖途径：根据植株形成的途径，植物的繁殖方法有性繁殖和无性繁殖两种：1）有性繁殖(Sexual propagation):通过两性细胞结合形成的种子进行繁衍后代的方法叫有性繁殖。因为繁殖体是种子，所以又称种子繁殖。补充:种子发芽的条件:充足的水分；适宜的温度；合适的光照。种子繁殖的优缺点：优点：有性繁殖具有种苗生产操作比较简单、种苗根系完整、生长健壮等优点。缺点：有些植物是不能或不宜用种子繁殖的，如无种子或种子无活力的植物、杂种植物；虽然有些植物可以用种子繁殖,但生育期长、或者繁殖系数低。对于这些植物，可以用无性方法进行繁殖。2)无性繁殖（Asexual propagation)：无性繁殖是通过植物体一部分（常常是营养器官，如芽、根、茎、叶等）繁殖自身的方法，所以又称营养繁殖（vegetative propagation)。一株植物通过无性繁殖所形成的后代称为一个无性系（clone，克隆），所以无性繁殖植物就是克隆植物，无性繁殖又称为clonal propagation。植物的无性繁殖有分株、扦插、压条和嫁接4种方法.分株繁殖：通过植物本身的组织或器官生长出来的器官或植株进行繁殖.（优点：成活率高）扦插繁殖:扦插也称插条,是一种培育植物的常用繁殖方法。剪取某些植物的茎、叶、根、芽等（在园艺上称插穗），或插入土中、沙中,或浸泡在水中,等到生根后就可栽种，使之成为独立的新植株。（生根是关键！优点：繁殖材料比较多：茎段,甚至叶片）压条繁殖嫁接繁殖无性繁殖的特点:优点:无性繁殖所形成的后代在性状上与母株是一致的;缺点：繁殖速度有限；容易传播病害。2、植物离体无性繁殖简介是利用植物组织培养技术对植物进行无性繁殖的方法.由于小体积容器内进行的，而且植株微小，所以又称为植物的微繁（micropropagation).又由于这种植物繁殖方法速度快,所以又称为植物的快速无性繁殖，简称快繁（rapid clonal propagation）。3、植物的离体再生诱导外植体（根、茎、叶、花等）形成植株的过程，称为植株再生（plantlet regeneration）。4、植物的离体再生途径：顶芽与侧芽再生途径；不定芽再生途径；胚状体再生途径;拟原球茎再生途径.5、植物的离体无性繁殖分为4个过程：1）芽的诱导（bud induction）；2）芽的增殖（bud multiplication）；3）芽的生根(rooting of buds）: 诱导芽生根，形成完整的植株（plantlet，注意同seedling的区别）；4）小苗移栽（transplanting of plantlets）：将再生的植株由实验室移栽到户外。6、顶芽与侧芽再生途径步骤：1)选择适当的材料，并消毒；2）茎段培养(nodal culture)或茎尖培养（shoot tip culture);12节/段；3）促进顶芽和侧芽生长，形成幼茎（shoot）;4）幼茎生根、形成完整植株。7、顶芽和侧芽再生途径的特点：优点：顶芽和侧芽是植物生长发育过程中自然形成的,发生变异的比率很低。利用顶芽和侧芽途径繁殖植物时变异率最小，所繁殖出来的群体在性状上能最大限度地与母株保持一致。缺点:速度可能比较低，不能满足要求.8、顶芽和侧芽再生途径可能存在的问题：1）不是所有的植物都可以进行茎段培养。只有茎能伸长的植物(菊花、马铃薯、葡萄、木本植物等）才可用法，节间短或莲座状的植物(如凤梨、非洲菊、白菜等）则不能用。2）繁殖速率比较低。繁殖速率：幼茎形成率、生长速度和长度（节数);如果形成率低、生长比较慢；使用细胞分裂素促进侧芽或顶芽的萌动和生长。要注意浓度。3）侧芽萌动，但伸长不好,影响增殖效率和生根。可能的解决方法:（1)尽量利用春、夏季材料，不用秋季、初冬的材料;（2）在低温下（0-5度)下培养2个月左右；（3)在长日照条件（16h/d)和弱光下培养；（4）培养基中填加GA,或降低细胞分裂素的浓度。9、不定芽再生途径不定芽(adventitious bud)： 从外植体不固定的位置形成的芽.10、不定芽再生途径过程:1）外植体的选择与消毒；2)不定芽的诱导（外植体既可以直接形成不定芽，也可以先形成愈伤组织，再由愈伤组织形成形成不定芽）；3）芽的增殖(茎段培养或不定芽)；4）不定芽的生根。11、影响不定芽形成的因素：1)植物种类和品种（基因）差异:植物外植体形成不定芽的能力:草本植物大于木本植物；双子叶植物大于单子叶植物。即使同一种植物，品种之间往往也有很大的差异。 红花早菊品种比黄花早菊的容易。2)外植体的类型同一株植物以不同的器官（根、茎、叶、花、果实、胚）作为外植体，其形成不定芽的能力往往会有差异。茎、叶是最常用的外植体，但对于非洲菊来说，其花托是最佳的外植体。3）外植体的生理状态植物的生长发育可以分为营养生长期和生殖生长期.前者为幼年期，后者为成熟期。幼年期的外植体形成不定芽的能力大于成熟期的外植体，特别是木本植物。一株植物不同部位的成熟度与其到根部的距离呈正相关.幼嫩的外植体比成熟的外植体容易形成不定芽。4）培养基 基本培养基： MS培养基是一种最通用的培养基,适用于大多数植物的组织培养。但不同基本培养基的无机盐浓度差异较大，对不定芽的诱导会有很大的影响.因此，不同的植物往往会有不同的适宜培养基。B5培养基适合于十字花科植物;N6培养基适合于禾本科植物；WPM 适合于木本植物。植物生长物质：培养基中植物生长物质(激素或生长调节剂）的浓度和种类对绝大多数植物的不定芽诱导有决定性的影响。CTK/Auxin比值高，有利于不定芽的形成。12、不定芽的增殖：不定芽形成以后，如果茎能伸长（如地黄、杨树等）,则可以通过茎段培养增殖;也可以继续通过不定芽增殖。一般可以在最佳的诱导培养基上进行增殖，但有时激素浓度要适当调整。如不定芽过多，但不伸长，则要降低CTK的浓度；如不定芽的形态正常，茎也能伸长,但增殖的数量较少,则可以提高CTK的浓度.13、不定芽途径的优点和缺点：优点：（1）取材料方便，可以不毁坏母株；（2）芽的增殖速度快，繁殖效率高。（3）是培育转基因植物的重要途径.缺点:植株变异的几率较大。如香蕉不定芽增殖超6代后,不定芽的变异比率就大大增加。一些花卉的花叶,通过不定芽途径形成的植株可能会失去花叶的性状。14、幼茎生根：当顶芽、侧芽或不定芽增殖形成的幼茎（shoot）达到足够数量后,必须将其转到生根培养基上进行生根，形成完整的幼苗（plantlet）。无根苗生根有2种类型:皮部生根型和愈伤组织生根型。皮部生根型：根直接从幼茎基部茎的皮层处长出.愈伤组织生根型:幼茎基部先形成愈伤组织，再在愈伤组织上形成根。影响生根的主要因素：1）植物的类型和品种：草本比木本易；幼年期外植体形成的无根苗比成年期形成的无根苗容易。2)基本培养基成分：不同培养基的无机盐浓度差异较大，对生根的影响也比较大。一般较低的无机盐有利于生根，故生根培养基常常将大量元素减半，特别是MS培养基.3）生长素：有些植物可以在无激素的培养基上生根,但大部分则要求使用一定浓度的生长素。在诱导生根方面，IBANAAIAA.2，4-D一般不单独用于诱导生根。有时生根时要将2种生长素混用才能取得较好的生根效果。十四、拟原球茎的途径和特点:原球茎可以自己增殖，但速度比较慢；如果切成薄片，则每片可以形成数个新的原球茎,繁殖速率大大提高;原球茎如果不再切割,则象种子萌发形成原球茎一样，发育成苗。原球茎（根状茎）途径是兰花快速繁殖的最快途径，其中原球茎（根状茎）诱导的是兰花快速繁殖的关键。原球茎（根状茎）的诱导难易因兰花的种类和外植体类型而异。以顶芽和侧芽为外植体容易成功，以叶片、根则较难.十五、组培苗的移栽组培苗移栽是植物快速繁殖过程中的最后一个步骤.组培苗移栽成活率的高低同样决定了快速繁殖的效率。组培苗移栽分为炼苗、洗苗和移栽3个步骤。1、 炼苗:由于组培苗在培养过程中所处的环境温和(温度平稳，湿度大、光照较弱），组培苗叶片和茎段上的角质层和蜡质层较薄,抗蒸腾失水的能力很差.如果直接移栽到室外，则不能适应室外环境，极易死亡.因此移栽前组培苗必须炼苗。在室内将瓶塞(盖)打开（一半或完全)23天,让组培苗逐渐适应培养容器外面的环境，增加角质层和蜡质层厚度，增强抵抗室外环境（特别是湿度）变化的能力。2、 洗苗：炼苗结束后,将组培苗从培养容器中取出,在清水中将附着在根上的琼脂洗净,否则移栽后根系容易生霉,造成烂根、死苗。3、 移栽：组培苗要移栽入温室或温棚中。基质要求疏松、透水、透气性能好(如蛭石、珍珠岩、泥炭土等配成的基质），最好要消毒（少量可以高温灭菌,大量就用杀菌药剂）;保持较高的湿度；遮荫、降低光照;保持温度相对平稳.十六、无病毒植株的生产Production of virus-free plants植物组织培养技术为挽救感染病毒病的植株品种提供了一个行之有效的手段.无毒苗生产的机理：在植物体内，病毒是通过维管组织传导的，茎尖的分生组织(meristem ）无维管组织，所以没有病毒；将分生组织切离、进行无菌培养，通过调节激素，则分生组织可以再生出无病毒植株;通过快速繁殖技术就可以生产出大量无毒苗。用植物组织培养技术生产无毒苗的步骤、过程与快速繁殖技术基本相同，但要注意以下几个问题: 1、感病植株的病毒鉴定；2、感病植株的热处理：37-39的温度处理感病植株2060天可以使病毒失活，增加获得无病毒植株的机会;3、分生组织的分离：分生组织是茎尖生长点0.1 mm0.1 mm0。1mm大小的一块组织，无维管组织，故无病菌和病毒.通常切直径0.20.5 mm；4、再生芽或植株的病毒检测：血清免疫、电镜观察、接种鉴定等;5、移栽后的隔离，保证原种无病毒。十七、植物离体繁殖技术的应用1. 快速繁殖优良品种；2. 无病毒优良种苗生产；3.挽救和繁殖濒危植物；4.离体保存植物资源(离体种质库）；5。 培育转基因植物.十八、胚状体途径胚是具有胚芽、胚根、胚轴和子叶的幼小植物体.在自然条件下，胚是通过两性细胞受精形成的合子发育而成的，存在于种子中，故又称为“合子胚、“ 种子胚”. 胚的发育经历了球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶胚等几个阶段。在植物组织培养过程中，有些植物的外植体所形成的愈伤组织细胞也可以按照合子胚发育的途径形成“胚”。由于愈伤组织中的细胞都是体细胞，所以形成的胚就叫“体细胞胚（somatic embryo)、胚状体(embryoid）.体细胞直接形成体细胞胚的过程就称为“体细胞胚胎发生或“体胚发生”(somatic embryogenesis).1、胚状体途径植株再生过程1）诱导胚性愈伤组织(能够产生胚状体的愈伤组织)；2）胚状体的发育（胚性细胞、球型胚、心型胚、鱼雷型胚、子叶胚、成熟胚）;3)胚状体的萌发成苗。补充：胚性愈伤组织(embryonic callus,EC):质地较坚实，乳白色或黄色，表面具球形颗粒，生长比较缓慢;细胞较小、等直径,原生质浓厚，无液泡，常富含淀粉粒，核大，分裂活性强。2、影响胚状体形成的因素并不是每个愈伤组织细胞都可以形成胚状体。只有胚性细胞（emgryogenic cell）才有此能力。胚性细胞在形态上具有细胞体积小、细胞质浓、核大、核仁明显、液泡小和淀粉粒多等特点。生长素和细胞分裂素对于胚性愈伤组织的诱导和胚状体形成往往是必不可少的，但组合与浓度因植物种类而异；(2，4D：常用于诱导难发生胚性愈伤组织的植物形成胚状体.但在胚性愈伤组织形成后,2，4-D的存在会抑制体细胞胚的进一步发育。因此，一般先用2，4-D诱导胚性愈伤组织，而后降低其浓度或去除2，4-D。）;（ABA： 植物组织培养中几乎不用ABA，但在有些植物的胚状体再生途径中，ABA有促进胚状体的正常发育与成熟的作用。）;较高的NH4+、Ca2+浓度，添加氨基酸（特别是脯氨酸）、CH等物质有利于胚状体的诱导；麦芽糖有利于胚的成熟.3、胚状体的应用-人工种子（artificial seeds=synthetic seeds）胚状体为人工种子的研制创造了条件。人工种子制作是将胚状体包裹一层“胚乳和“种皮”类的物质。一般将胚状体混和在含有营养物质和激素的%海藻酸钠中，通过漏斗滴入的CaCl2溶液中,则就形成颗粒状。补充：人工种子的好处：容易储藏 ； 方便运输； 容易使用(播种）胚状体再生途径也是培育转基因植物的重要技术之一！十九、植物细胞培养（Plant Cell Culture）：在培养基中培养彼此分离的细胞.1、类型：固体培养（solid culture）:在固体培养基中培养细胞。也称静止培养。固体培养的特点：1)可以跟踪单细胞生长与分裂的过程；2）所得到的各个细胞团均为单细胞形成,遗传成分和生理特性具有一致性；3）细胞生长速度较慢；4)不能长期、连续、大规模培养细胞.液体培养(liquid culture）:在运动的液体培养基中培养细胞.又称悬浮培养（ suspension cell culture）。有2种形式：成批培养(batch culture)：一个容器的细胞培养结束后,细胞被分散到新的容器中继续培养.连续培养(continuous culture)：在一个容器（或者系统）中连续不断的培养植物细胞。2、悬浮培养的特点：1）不能跟踪单细胞的分裂和生长过程;2）细胞生长速度较快；3）可以长期、连续、大规模培养细胞。3、细胞培养的应用1）进行细胞生物学研究;2）筛选变异体;3）生产有用化合物；4、细胞培养的建立、维持和生长特点：1）细胞培养的建立和维持：细胞培养通常是将植物材料接种在液体培养基中,经过摇荡建立起来的。建立起来的悬浮细胞必须适时继代培养（subculture将芽、愈伤组织、细胞等分成若干份，接种到新鲜的培养基中以扩大群体的过程).通过继代，细胞就可以长期保持、繁殖,并且扩大细胞的群体.愈伤组织(callus):是一群无明显组织分化、分裂能力强的细胞。它是植物受到创伤后或在植物激素的诱导下形成的。分化(differentiation）：形态、结构和功能相同的细胞变成形态、结构和功能互不同的细胞的过程,如分生组织细胞转变成薄壁组织、维管组织、厚壁组织等。脱分化（dedifferentiation）：已分化、成熟的细胞（一般不再分裂）重新恢复分裂能力的过程。外植体形成愈伤组织的过程就是脱分化的过程。再分化 （redifferentiation）：愈伤组织形成其它组织或器官的过程。2）悬浮细胞的生长过程 悬浮细胞生长的特点 ：在一个细胞培养周期中，细胞的生长情况经历了慢快-慢的过程.细胞培养周期：两次继代培养所间隔的时间。延滞期：细胞继代培养开始后的一段增长缓慢的时间.快速生长期：细胞数量、重量或体积直线上升的时期.渐降期：细胞生长速度逐渐减慢的时期。静止期：新生的细胞数量与死亡的细胞数量达到动态平衡的时期。下降期：活细胞数量不可逆下降的时期。与固体培养不同,细胞悬浮培养时，要求达到一定的接种细胞密度 (cells/ml)， 一般为0.52.5105个 细胞/ml。密度高，细胞生长、分裂快,延滞期短;密度低则相反，如果密度太低，则细胞不生长、不分裂,最后全部死亡。因此，悬浮培养时有一个最低起始细胞密度（minimum initial cell density)。最低起始细胞密度： 细胞能够生长、分裂的最低接种密度。 影响最低起始细胞密度的因素（1）植物种类：生长快、容易培养的植物（如大多数草本植物)，其最低起始细胞密度比较低；相反，则高。（2)细胞的生理状况：用快速生长期的细胞接种，则起始细胞密度可以比较低。(3）培养基成分:用营养成分丰富的培养基或条件化培养基（conditioned medium)培养细胞，起始细胞密度低（条件化培养基是培养过几天高密度细胞后的无细胞培养基）。（4) 培养方式：采用看护培养（nurse culture）是降低最低起始细胞密度的有效方法之一。看护培养（nurse culture）：将亲本愈伤组织或高密度的悬浮细胞同低密度细胞一起培养,以促进低密度细胞生长、分裂的培养方法。5、单细胞培养技术：单细胞培养是培养彼此分离的单个细胞，且细胞密度比较低，它是研究和观察细胞生长与分裂过程的有效方法。单细胞的培养难度较大，常用的有微室培养和平板培养。微室培养(Culture in microchamber)：在悬滴培养的基础上发展而来的.1955年DeRopp把含有细胞的液体培养基滴在玻璃板上以观测单细胞的生长.但他没有发现单细胞分裂,发生分裂的是含有几个细胞的小细胞团。平板培养（Plate culture）：1）细胞悬浮液的制备；