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亚抑菌浓度抗生素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响说课材料.doc

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此文档收集于网络,如有侵权请联系网站删除 青岛大学 硕士学位论文 亚抑菌浓度抗生素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响 姓名:李俊娟 申请学位级别:硕士 专业:内科学(呼吸病学) 指导教师:蒋捍东 20110526 此文档仅供学习和交流 亚抑菌浓度抗生素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响 目的:研究四种抗生素在不同亚抑菌浓度下对铜绿假单胞菌生物膜形成的影 环丙沙星和阿米卡星的��诹街峙嘌��芯���/��.����和��痩。 ②静态造膜结果:在��校�⑵婷顾嘏ǘ������时能抑制生物膜的形成, 而在浓度≤���时促进生物膜的形成;在�培养基中,阿奇霉素浓度为 �����时均促进铜绿假单胞茵生物膜形成。亚抑菌浓度的头孢他啶和环丙沙 星在��蚅�嘌��芯�种粕�锬ば纬桑话⒚卓ㄐ窃贛�培养基中浓度为 关键词:铜绿假单胞菌,生物膜,阿奇霉素,亚抑菌浓度 ������� � � ������� � ����� � ������,����. � � ������� ������� ��������.� �� � ����� � � �������.�琫 �� �� �� ��� � ��� ������� �������� ���.②� � ����������� �� ����������� �� ��� ����� ������� � ��/����疘. � ��� �������� ��� � � �╓� � �������琧����� � �� � ����簆����� �����,����,������,������� ������� 引言 引言 在人类感染疾病中有�%的非社区获得性感染与生物膜相关�】。很多细菌如铜 材料和方法 第一章论文 ��菌株来源 �头孢他啶:葛兰素史克产品 ����戊二醛�虾H�┥���� �硫代硫酸钠无水物�本┭翘��嘶�び邢薰�� �无水氯化钙�奇杞ɑ;�び邢薰�� �硝酸银�嘌粢�嘶�ぴ�嫌邢拊鹑喂�� �对苯二酚�毡救�� �呋喃酮������� ��℃细菌培养箱�毡� �恒温摇床��妫��� �医用硅胶片�钲谑辛V谖耙迪鹚芸萍加邢薰�� 青岛大学硕士学位论文 �先将菌种取出于固体�培养平板划线,置于��温箱内过夜培养,后挑取单菌落 �取菌液用酶标仪测�值,稀释菌液至��.� 在孔内混匀后取出���尤氲���煸群笤偃���转至第�校�来渭又恋趖�。 �先将菌种取出于固体�培养平板上划线,置于�℃温箱内过夜培养,后挑取单菌 �用灭菌水新配置四种抗生素,并加入到上述四个试管中,使得阿奇霉素、头孢他 啶、环丙沙星及阿米卡星的终浓度均为����。做好标记 �挑取单菌落接种子四个试管中,于�℃恒温摇床���中培养 �分别于�,�,�,�,�,����,�����菌液测定�值 �描绘细菌生长曲线 ��微管静置造膜,绘制生物膜生长时间曲线 �离心管����阄乱〈补����培养 �用�对菌液进行适当稀释; 材料和方法 ���孔板静置造膜,绘制生物膜生长时间曲线 �将�孔板倒扣于吸水纸上,将水分吸干; �新配置四种抗生素,并于�管中倍比稀释至一系列的亚抑菌浓度 �在�孔板中第�����入已倍比稀释的抗生素����ň�好靠准尤���。 每列为一个亚抑菌浓度,每个浓度有�鲋馗础T贚�蚆�培养基中分别造膜。其 中在加入阿奇霉素的铜绿假单胞菌造膜中,另外测定阿奇霉素浓度为���和��� ��试管内静态造膜 青岛大学硕士学位论文 �用灭菌水新配制阿奇霉素,在��� 用双蒸水多次充分漂洗,去掉浮游菌。 蒸馏水清洗�� 蒸馏水清洗�� �ハ跛嵋�芤悍从� �� 蒸馏水漂洗�� 蒸馏水漂洗�� 结果 第二节结果 环丙沙星及阿米卡星在两种培养基中一致,分别为��/��.���痩及���。�� ���生长曲线测定 ��在�培养基培养时,四种抗生素阿奇霉素、头孢他啶、环丙沙星和阿米 乏至三兰麓麓 ��微管生物膜生长曲线测定 �� 青岛大学硕士学位论文 微 图��疚狿����装迳�锬ど�さ氖奔淝�摺K�门嘌��狹髓培养基。纵 �� ����时,阿奇霉素浓度为���时的硅胶片生物膜形成最多,空白组居中, � ��不同浓度的阿奇霉素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响: ��在��嘌��校�⑵婷顾嘏ǘ任����、��/�����、����及 ����时生物膜形成量少于空白对照组,与空白对照组比较差别有统计学意义 � � � 注:·表示与空白对照组比较, 青岛大学硕士学位论文 物膜形成量多于空白对照组,差别有统计学意义,����Eǘ任�/��, �����.� ��鏼跏对 ��亚抑菌浓度的环丙沙星星对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响: ����、����、����、/���时��生物膜形成量均少于空白对照组, 统计学意义,尺���K���迪昙�� 虹∥∥�巍蜼 ��亚抑菌浓度的阿米卡星对��生物膜形成的影响: ����时��所形成的生物膜量明显少于空白对照组,与空白对照组比较差别有 生物膜形成量明显多于空白对照组,差别有统计学意义����K�釵�迪昙�� 青岛大学硕士学位论文 讨论 第三节讨论 并且极易形成生物膜。在呼吸科,肺部结构病变的患者往往会伴有�的感染,如肺 ��������,��、支气管扩张及慢性阻塞性肺部疾病���等患者往往存 在铜绿假单胞菌的持续的慢性感染,常常可形成铜绿假单胞菌生物膜。细菌生物膜 是指在多聚糖、蛋白质和核酸等组成的基质内相互粘连粘附于物体表面的细菌群体 �。细菌生物膜一旦形成,固着态的�耐药性将在原来浮游态的基础上增加数倍至 数千倍,常规药敏试验敏感的药物可能已经耐药,导致感染难以清除。�极易形成 生物膜,这也是导致临床上抗茵治疗失败的重要原因之一。 �是近年来感染领域研究的热点,主要集中于其耐药机制的研究:如可产生抗 生素灭活酶或抗生素修饰酶,如�一内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶等;改变抗菌药物作 ��/�琇�嘌��信嘌�钡腗�值为���痩。可见不同培养条件下�浮游菌对 青岛大学硕士学位论文 的形成,对于其机制尚不明确。 膜结果亦提示亚抑菌浓度的阿奇霉素能促进��生物膜的形成。 亚抑菌浓度抗生素对细菌生物膜形成的调控随抗生素种类、浓度、作用时间和菌种 讨论 依据本实验条件,亚抑菌浓度的阿奇霉素能抑制��浮游菌的生长,但是却促 株生物膜的形成过程如下:发现��菌株在�左右即开始在玻片表面黏附聚集,在 培养�熳笥沂保�皇浅醪叫纬缮�锬ぃ�天时基本具备生物膜三维结构,此后生物 膜逐渐达到平衡状态。但在本实验��在�孔板、玻璃试管内及硅胶片静置造膜时, 的阿奇霉素与空白对照组比较抑制了�%的胞外多糖的产生。故推断在本实验中培 青岛大学硕士学文论文 对��生物膜的促进作用,并非通过激活�发挥主要作用的,这也是与众多研究 在��嘌��信嘌�保�繁�承桥ǘ任狹��/���时均可以抑制��生物膜 大,故本实验选用了倍比稀释的方法,这样就不可避免导致两个浓度间距太大。但 是目前关于亚抑菌浓度头孢他啶和环丙沙星对铜绿假单胞菌生物膜的影响研究并不 且根据实验结果得出:亚抑菌浓度阿奇霉素促进��生物膜的形成;而亚抑菌浓度 的头孢他啶、环丙沙星及阿米卡星对��生物膜的影响与浓度和培养基有密切的关 系。对于亚抑菌浓度抗生素对铜绿假单胞菌生物膜的影响的机制尚不清楚,尤其是 大环内酯类阿奇霉素所表现的促进��生物膜形成的作用,本实验可以除��系统 引起的作用,对于其具体机制需要进一步探讨。 � 霉素的敏感性亦不同。 件密切相关 附图 空白 ��� / 图�⑵婷顾嘏ǘ任��/�杞浩�炷そ峁�放大倍数��� 醅 二 � ≥· ·’ . 二 .、 : � ‘ 了一..。 ≯懈 .。● 青岛大学硕士学位论文 . 、 ⋯ : 冀 。 �骸� 鬻蘩鎏 ‘ ’ 、 , “ : 鬻遂 摹攀�.。『.:建 �摹�琷茹���裫� 鬻笺一 口��� ��痩�� ��痩�� ����:����� �� �甈���琈.��琣��甂.���瓸���� � � � � � � �, ����. ��,�����瓵����������甆���������������. ������� �珺��� ���������:������· � �:��� � �珿��� ���—����. � ����甒��������; � ����� � �鳎瓸����簃���� �� ��;��:����. ����.��������� ��铑龋��炊�嘌��圆煌��竿�碳俚グ��锬ぞ�舾行缘挠跋靃�山东医药��,� �甴��海�痺�.��.��產�産�痯���.���� �.������狟���琓����� �����:�� � ��� ��·’�’。�� ��� ����� � ����������,���� � ������� � �����������: � � ��.��� ����. � 青岛大学硕士学位论文 志��,������� ������ � ����������,��,���:��~�� 成的动态观察��谌��酱笱аП������:���� � �,���,���� ����������:��. �,����,��� ���� ����� ������� � � ����甁��������������. �琍���觯琍��� �,� � ���—�� � � � � ����������】.�� ����� � � �� � ���,��,��:�; � � �.��� � � � � ����� � ��� �.����珻���琍����,����琘�����琕���� ���� ��� � �����.����� ��� �珺��� ������� ��� ��� ������.���� �� ���������: �瓾����珼�����.������� ��� ��������� 铜绿假单胞菌生物膜的治疗进展 铜绿假单胞菌������ 为一种机会性致病菌,它是院内感染四大条件致病菌之一,可引起呼吸道感染、败 血症、骨髓炎、心内膜炎、牙髓炎及尿路感染等各种疾病。该菌耐药性较强,耐药 机制复杂,并且极易形成生物膜。随着各种侵入性检查、体内人工留置物的广泛使 用,如气管插管、中心静脉置管、导尿管、心内起搏器及人工关节等,铜绿假单胞 菌的感染日趋增多,常常会引起生物膜相关感染。 所谓生物膜是指附着在有生命或无生命的物体表面的由细菌自身产生的多聚基 少,可能已处于解聚阶段。 阶段,发现有如下变异:一种为鞭毛和其他移形性变异,导致细菌不能很好的粘附 于异物表面;另一种为突变体无法生成发样附属物一Ⅳ菌毛,使细菌只能在物质表面 形成单层细菌而不能形成微生物菌落。这些都可能影响生物被膜形成的最初粘附阶 段。细菌粘附到异物表面后同时会吸引周围同种细菌并增殖为有组织的小菌落。小 菌落间相互传递化学信号分子嘲,即基因表达蛋白质等物质生成,在生长繁殖的同 时分泌大量的胞外基质粘附单个细胞而形成微生物菌落,基质随着生物被膜的成熟 而增加,主要成分包括胞外多糖、蛋白质、����、死细胞、磷脂等,其中以胞 合成的基因在生物被膜形成的过程中上调,在生物膜菌和浮游菌中有多达�种不同 青岛大学硕士学位论文 �����和表面扩散���������,具 体调控机制目前尚不清楚。细菌一旦形成生物膜会造成耐药性显著增加,抗生素不 易渗透,细菌表面抗原位点被覆盖等后果,继而表现为耐药和抗吞噬等特点。 生物膜与浮游菌之间的区主要别在于:在生物膜内细菌密度高于浮游状态,导致 生物膜内营养物质和氧气缺乏,同时代谢产物、废物和细菌分泌的一些因子的水平 抗生素为阿奇霉素、红霉素、罗红霉素及克拉霉素等。理论上大环内酯类抗生素不 一、体外实验中亚抑菌浓度大环内酯类药物对�生物膜的影响 的形成,其机制如下: 是通过抑制胞外的多糖来抑制生物膜的形成。粘液菌株胞外多糖是藻酸盐,而非粘液 多糖较对照组减少了�%。�����萵蝴研究了从�患者痰中分离的�株�株粘液 其粘附的抑制作用没有完全的相关性。因为阿奇霉素对非粘液菌株��为���/� ��种迫禾甯杏��������琎�系统,减少信号分子的产生。 青岛大学硕士学位论文 ��基因组成,��编码�猘�卜����� 加到一定的浓度,分别与��和��蛋白特异性结合并激活转录,从而调节一系列 ��然�虻谋泶锒�偈沟�缘鞍酌浮⒓钚缘鞍酌浮⑼舛舅谹等生成; 察生物膜的形成。�旌笠吧�蚉��可形成成较厚、有孔状通道的成熟生物膜结构, ��、��� ����基因缺陷型黏附、聚集形成明显稀薄的 早期生物膜结构。可见����基因缺陷可影响铜绿假单胞菌体外形成生物膜的能 呈薄膜状,均显著吧薄于野生型菌株。这两个实验证明了群体感应系统在生物膜形 厚于突变菌株,突变菌株生物膜厚度仅为野生型生物膜的�%,也证明了群体感应系 统����基因缺陷明显影响�生物膜的分化成熟过程。并且�盯突变株形成的 ����突变菌株在生物膜形成和对抗生素的敏感性方面与野生株存在明显差异。 ����扰�研究表明大环内酯类抗生素能抑制�的�系统,抑制信号感应分 发挥了�%的作用。 患者中分离的�在体外可以表达上述两种��嘲,从�患者痰中也可检测得到口副, 对于���的研究经历了一个不断认识的过程。一开始,����,�萂叫研究了 例�,并且��信号分子系统在�患者铜绿的感染疾病中,对�在生物膜内缺氧的 环境中生存发挥了重要的作用���⑶矣蒀�籋�控制表达的鼠李糖脂在维持生物膜 结构方面是必需的“射。以上这些发现都提示了���在生物膜形成中的作用比之前 想象的重要的多,主要是之前的研究所用的菌株为���其生成���的能力得到 破坏,故而得出上述结论。��� 游��铣擅傅谋泶铮��羌偕杩赡苁钦庑┟干倭康南碌骷纯梢缘贾虏�鶤�大幅度 青岛大学硕士学位论文 的两者生物膜形成无差别,故而得出��/�的阿奇霉素没有杀灭成熟铜绿假单胞 总之,无论是体外还是体内试验,大环内酯类抗生素对抗铜绿假单胞菌有比较 乐观的研究,但是众多试验也证明亚抑菌浓度大环内酯类药物�⑵婷顾�对�生 物膜的影响,随着实验条件和所研究的菌株的不同而不同,随着亚抑菌浓度和作用 时间的不同出现相反的结果。在这一领域很多方面都没达成共识,尤其是对于�系 统中各个因子之间的相互联系和作用需要进一步的探讨。需要研究的空间还很大: 而且体外的环境与体内环境相差太大,需要进一步探索实验条件,为更好的研究� 在体内的治病机制提供条件。 三、药物的联合应用治疗�感染 关于联合抗�生物膜的研究中,不同药物联合对�生物膜的作用亦不同。其中 过体外试验发现,罗红霉素可以抑铝��多糖蛋白复合物合成,从而增强氟罗沙星渗 透过细菌生物膜能力,对氟罗沙星杀灭细菌生物膜中的�有增效作用。聂大平等删 可减少细菌的粘附和被膜存活菌数:与环丙沙星,头孢他啶联合用药能增强其杀菌作 的头孢他啶作用����锊牧媳砻嫒杂邢妇�婊睿������陌⒚卓ㄐ亲饔�� �����等 青岛大学硕士学位论文 对于联合治疗�生物膜感染效果好于单药治疗, ��� 筛选系统,利用这种筛选系统他们发现了两种具有群体感应显著抑制作用的药物: 参考文献 ��’�����瓵����� ��琀�� ��甁����������:�� ��瓸���� � � ����� �� �,����瓸��� �������.�� ������������� � �����������:��—��. �� � ���������� ���� �����甗�����������:��—�� ����� ����� ���� �瓺���牛珻���� � ���������.��� �.��� �琕� �����������:�. �琓����,����,��.���� ����� ��� �甂��.�� �� ����� ��� � � ���� �� ������ ��,�:��—��. ������ ����.��� ��,���� ���������� ������ ���,� � � � � � 青岛大学硕士学位论文 �甌� � �����.������ � � ��—‘�。’�� ��� ������ � ����������,���� �.�����珿.,�瓽����珼.���琣���.���.��.��� � � ����� � �������������.�瓵�����瓹����.��, �:����. �.��� � ��—�� �� � �����.�瓸����, � ��, �,� � � � �.������������:����. � �,�� �,���� ����� �,����,��� � � ������� ���� � ������ �琂��,� �.����� ������� � � ��/�� ����� � � � � ��� ������.��� � � � ����� � ��� �����������:����. � 参考文献 �,����,��� �,� � � � � ����� ����� ����� �����������: �.����珻���琍����,����琘�����琕���� ������� �����.����� ��� � �.���琍.���臠.����,�甊.���,��.����,�甁.���琣� ������������� �瓽����.��.������� � �. ���.����� � � �� �� �.���.��� ����.��� � �������� � � ��—�. �.���.���� �.����,�甁.,���,�甋.,���,�甁.� ������� ��� � ������ �,��—�. �.���.��� � ��� �������.�������� ��. � � �甀.�����甌� ����� ������� ��� 青岛大学硕士学位论文 �甈���瓺��� ����� �.����珽.,�甁.��琑.���琣� ������ ����� �.����.��.�:��—�� �.� ���,�甊.,���,��琈��琒.� � � ��簍���� ����.�� ����� �.��,�瓹.&���珻.�����瓻��� � ����� �.���.��� �.������琒.,���琂.��琑���琂.� ����� ��—�—�� �� ��� �������,��� �.��,�甋.,����,�瓼.,����,�甅.� �����簉������ � � ��� ����. ����� � �������������. ����� ������ � � ������ � � ���������:��� ����� � � � ����� � �:����. �.���,��琘.���琘.����,�甅����,�甇��琣� ������� � ����� ���� ���� � � � � 青岛大学硕士学位论文 �瓽.��������甌���� � ������� � � � �甂��.��.���� ��� ����� � ������ �:��—�� � �� � �������������.��� �琈�� �琌� �� � ��������.� �琄�� �珹� �甀����� �� � � �. � ����� � � �������� ����������� � ��,�,���� ��,����珼� � ������� ������,��� �.����珹���虬������� ���� �������������������� �� �����:��—�. � � � � � ����� � ��,�:����. � � ��� � ������ � �����: �� � ��� � ����� � ����� ����� �����:��� �.陈迁,王睿,方向群,等.罗红霉素与氟罗沙星联合应用对铜绿假单胞菌生物被膜的影响 �.聂大平��跤衩�,王卫东等大环内酯类药物与环丙沙星,头孢他啶联合用药对铜绿假单 � � � ����� ������� ���.����� ��������������� ����� � � � � � �������� � �� �.���� �� �������� ������,��,�����—�� � � � � ����� � ���������� � ��—���� ������,��, �.����� � �� ���������甁 � � ��� ����� � ����� ��� � ����� � � � 攻读学位期间的研究成果 第三章攻读学位期间的研究成果 致谢 第四章致谢 样,导师的言传身教将使我受益终生。 感谢三年来诸位同窗好友给予我的支持和帮助。 � 学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明 本人如违反上述声明,愿意承担由此引发的一切责任和后果。 论文作者签名: 日期矽�阹 日 学位论文知识产权权属声明 学校有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权力。本人离校后 年解密后适用于本声明。 不保密凹 ��朐谝陨戏娇蚰诖颉� 论文作者签名懈 月和日 阳� 导师 大学所有,未经许可,任何
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