基因工程技术-笔记整理.doc

基因工程技术：按照人们的愿望，进行严密的设计,通过体外DNA重组和转移等技术,有目的地改造生物种性,使现有物种在较短的时间内趋于完善,创造出新的生物类型.质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1200kb不等，为双链、共价闭合环状DNA分子cccDNA，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中,它具有自主的复制和转录系统。质粒在细胞内的复制一般有二种：紧密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxedcontrol）.前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子；后者在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝。质粒的不相容性：利用共同复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共存.从细胞中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。溶菌酶:破坏菌体细胞壁；SDS和TritonX-100：使细胞膜裂解。染色体DNA通常用于构建基因组文库和Southern杂交等。基因组DNA的提取植物基因组DNA提取：提取缓冲液（Tris.Cl保持pH，EDTA，NaCl，SDS)，氯仿/戊醇/乙醇溶液沉淀和抽提DNA，异丙醇沉淀DNA（提染色体）,TE（Tris。Cl,EDTA）-溶解DNA，RNase保存液，降解RNA，NaAC-加盐，70乙醇漂洗.细菌基因组DNA提取：SDS，蛋白酶K，氯仿：异戊醇（24：1） 沉淀DNA，苯酚:氯仿：异戊醇（25:24：1）- 抽提,70%乙醇漂洗，TE,NaCl调节离子强度，RNase A，CTAB/NaCl 溶液CTAB一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，异丙醇/无水乙醇-沉淀上清液.总RNA制备mRNA的分子结构容易受到RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定而且广泛存在，因此，在提取过程中应严格防止RNA酶的污染并设法抑制其活性,这是实验成败的关键。仪器玻璃器皿：200烘2h，塑料器皿:DEPC水液处理所有器皿最后硅烷化处理。RNA酶抑制剂：DEPC强烈但不彻底，与氨水溶液混合会产生致癌物；异硫氰酸胍-最有效，使RNA酶失活；其他-RNA酶蛋白抑制剂(RNasin)SDS, 尿素等。细胞内总RNA制备方法：异硫氰酸胍热苯酚法、酚/SDS法、Trizol法.（均先将组织在液氮中研磨成粉末）异硫氰酸胍热苯酚法:异硫氰酸胍（GIT)与巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性，GIT与十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl）作用使蛋白质变性。酚/SDS法:用酚和SDS破碎细胞和去除蛋白质,用LiCl选择沉淀RNA以去除DNA和其它不纯物。Trizol法：Trizol试剂（含酚、异硫氰酸胍和溶解剂等）.mRNA提取制备mRNA原理：分离的总RNA可利用mRNA3端含有poly（A）的特点,用oligo(dT）纤维素柱分离，当RNA流经oligo（dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT）纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。然后经过两次oligo(dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA.纯化的mRNA在70%乙醇中-70可保存一年以上。(上样buffer和洗脱buffer）。溶液中无盐时要沉淀RNA，必须加盐NaAC。琼脂糖凝胶电泳DNA凝胶电泳：琼脂糖- 分离DNA片段大小范围广;聚丙烯酰胺 小片段,分辨力高。琼脂糖凝胶电泳特性:1.DNA分子大小:DNA分子在一定琼脂糖浓度下的迁移率；2。琼脂糖浓度：1.01。2%；3.DNA分子构象：超螺旋DNA最快，线状双链最慢；4。电源电压：不大于5V/cm，负正；5。染料：溴化乙锭(EB)强诱变剂；6。离子强度：0.5TBE(不能过高，避免buffer发烫）.RNA凝胶电泳：RNA分子有很多二级结构，需经变性剂处理，可以破坏RNA中的二级结构。然后，用琼脂糖凝胶电泳可分级分离不同大小的mRNA分子。RNA琼脂糖凝胶电泳方法有三种：乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞（剧毒）琼脂变性电泳。DNA限制性内切酶限制性内切酶：限制性内切酶是指能特异性结合于一段被称为限制性识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。I类酶：结合于识别位点并随机切割识别位点不远处的DNA；II类酶：由二种酶分子组成的二元系统（核酸酶切割、甲基化酶修饰），其识别位点和切割位点是同一位置；III类酶:在识别位点之外切割DNA 分子,然后从底物上解离。甲基化:保护DNA分子，越活跃的地方,甲基化程度越低。切割性能：回文对称特异核苷酸序列、平末端DNA片段、粘性末端。酶单位：在合适缓冲液和反应温度下，在20ul反应体积中一小时内完全降解1mgDNA所需要的量.载体：把一个有用的目的 DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具.常见载体：质粒、噬菌体、粘粒、BAC、YAC等.质粒载体的特性:分子量小、多拷贝、松弛控制型;具有多种常用的限制性内切酶的单切点；能插入较大的外源DNA片段;具有容易操作的检测表型.pBR322、pUC18/19（分子量更小、互补原理蓝白筛选、多克隆位点区MCS）、pBluescript SK（+/)(MCS）。乳糖操纵子：互补原理：lacZ（半乳糖苷酶基因）基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性突变体之间可以实现互补的现象。蓝白斑筛选:Xgal-IPTG（乳糖类似物-诱导剂)-蓝色吲哚产物（当外源片段插入后，失去互补能力,因而不产生-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖,菌落呈白色）.噬菌体：侵染细菌的病毒(裂解性侵染、溶源性侵染）。【碱性磷酸酶活性好，但较抗热和去污剂，在去磷酸化反应后很难去除】细胞转化（transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段（E.coli）。【如需将质粒载体转移进受体细胞,需诱导受体细胞产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA.】感受态细胞：受体细胞经一些特殊方法（如CaCl2、RbCl（KCl）等化学试剂)处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞状态。【LB培养基不含Amp，设2个对照(防污染）】提高转化效率的因素：细胞生长状态和密度（刚进入对数生长期）、质粒的质量和浓度（DNA溶液体积不超过感受态细胞体积的5%）、试剂质量（最高纯度）、防止杂菌和杂DNA污染（无菌器皿）。PCR技术的3个步骤：变性:目的双链DNA在94下解链；退火:两种寡核苷酸引物在适当温度（50左右)下雨模板上的目的序列通过氢键配对;延伸:TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成.PCR反应5要素：引物、模板、酶、dNTPs和Mg2+引物设计原则:1。引物长度:（20bp）;2。引物扩增跨度：2kb左右最有效;3。引物碱基：G+C含量4060%为宜，ATGC分布均匀，不要集中；4、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补;5.引物3端的碱基:严格要求配对；6.引物中有或能加上合适的酶切位点；7.引物的特异性：与其他序列无明显同源性;8。扩增产物本身无稳定二级结构（以免产生非特异性）;9。引物量：浓度要控制.模板：可以是DNA或RNA，可以是线状或环状。TaqDNA聚合酶:活性半衰期为92。5（最后加入）。dNTPs：质量、浓度与PCR扩增效率有关,应保存得当，不好冻融,最好分装。Mg2+：对PCR扩增的特异性和产量有显著影响，浓度过高，特异性降低,出现非特异性;过低，降低TaqDNA聚合酶活性，使反应产物减少。反应缓冲液：Tris.Cl,KCl，和适当浓度的Mg2+。（BSA、DDT）PCR反应条件:温度、时间和循环次数.温度：变性:94，退火：Tm=4(G+C）2（A+T），值约低5,延伸：72。循环次数：2530循环。【PCR常见问题：无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性】实时荧光定量PCR技术：技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。检测模式有：Tagman 探针和SYBR Green I检测模式。SYBR Green I 染料方法:是一种结合于小沟中的双链 DNA结合染料，与双链 DNA 结合后，其荧光大大增强。荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值。CT值:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Tagman 探针：是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关.RAPD（随机扩增的多态性DNA)：运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。原理:利用一系列（通常数百个）不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物，对所研究基因组DNA进行PCR扩增，聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离，经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性.【DNA提取+选择随机引物PCR反应凝胶电泳-图谱分析】.缺点：图谱中某些弱带重复性较差，信息量小，有假阳性结果等等.差别表达基因分析技术:1。mRNA 差异显示技术（DD) 2。代表性差示分析技术（RDA)3.抑制性差减杂交技术（SSH）- 提取目标样和参照样;将目标样与残照样杂交得到产物；合并杂交产物；特异性片段扩增- 该方法能使假阳性率降低到64。交互差减RNA差别显示技术（RSDD）。分子杂交相关技术：互补的核苷酸序列通过Watson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链DNA分子的过程称为杂交。杂交的双方是所使用的探针和要检测的核酸。根据核酸的性质：DNA和RNA探针；根据是否使用放射性标记物:放射性和非放射性标记探针;根据是否存在互补链:单链和双链；根据放射性标记物掺入情况：均匀标记和末端标记。1)双链DNA探针:其合成方法有- 切口平移法和随机引物合成法.切口平移法：当双链DNA分子的一条链上产生切口时，E.coliDNA聚合酶I就可将核苷酸连接到切口的3羟基末端。通常使用-32PdNTP。随机引物合成法：利用E.coliDNA聚合酶I的Klenow片段，合成含有标记核苷酸的DNA链.具有聚合活性，没有5至3外切酶活性，称为Klenow片段。2)末端标记DNA探针：3末端标记（利用Klenow片段及T4DNA聚合酶） 和DNA 5末端标记(利用T4多核苷酸激酶PNK）。AKP碱性磷酸酶去磷酸化3）单链DNA探针：以M13载体衍生序列为模板，用Klenow片段合成；以RNA为模板,用反转录酶合成。4）Dig标记的核苷酸分子杂交：分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上,然后用标记的探针和被固定的分子杂交,经显影后显示出目的DNA或 RNA分子所处的位置.Southern杂交和Northern杂交。Southern杂交：DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。步骤：酶切、DNA片段转移、预杂交、杂交、显色反应.硝酸纤维素滤膜所得的结果背景较低,但易破裂；尼龙膜较耐用,但所得的结果背景较高.硝酸纤维素膜结合DNA依赖高盐溶液。DNA转移方法：毛细管转移、真空转移、电泳转移.Northern杂交：RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后用探针杂交，被检对象为RNA，探针为DNA或RNA。影响杂交的因素：核酸分子的浓度和长度、温度、封闭试剂、离子强度。变性,酸处理的目的?基因的原核表达：原核表达系统由原核表达寄主菌及原核表达质粒组成，优点:操作简单、方便、快速、成本低、产量高、纯化容易；缺点：产物多以包涵体形式存在；不含内含子,没有转录及翻译后加工过程，表达产物不能正常修饰；有些表达的蛋白没有活性。基因表达方式：组成型表达（不停的表达目的蛋白）、诱导表达（只有在诱导剂作用下才表达)、融合表达(融合表达标签）、分泌表达(信号肽）、可溶性表达（E。coli）。启动子：RNA聚合酶以很高的亲和性结合在基因调控区域的特定位子,起始RNA合成的序列。(10区和35区).细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子,因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。原核表达系统中常见启动子及其特点:Lac(乳糖启动子)来自E.coli，一段有方向的核苷酸序列，阻止RNA聚合酶的结合而抑制转录；Trp(色氨酸启动子）-阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性，阻止转录;Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子）-由Lac和Trp人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节；PL （噬菌体的左向启动子）左向转录启动子,受温度诱导（45）、T7噬菌体启动子-来自T7噬菌体，具有高度特异性，只有T7RNA聚合酶才能使其启动转录，从而得到表达。T7启动子完全专一受控于T7RNA聚合酶。特点:启动子的作用要强；需表现低水平的基础表达活性；具有简便和廉价的可诱导性.终止子:真核基因或操纵子的3端往往有特定的具有终止转录功能的核苷酸序列。诱导剂：当有诱导物存在时,诱导物与阻遏蛋白结合，使其构象发生变化,从而阻遏蛋白从DNA分子上脱落下来，RNA聚合酶进入启动子区,可诱导基因的转录。T7表达系统质粒：pET352、HisTag（6 x His Tag）， pET41、42、49还含有GSTTag， kam+ or Amp+ 抗性、HisTag(6 x His Tag）.pET质粒:不移码，不改变基因的阅读框架。多克隆位点BamHI。pGEX系：GST（谷胱甘肽S转移酶）基因融合表达质粒。Amp+,N端GST ，Thrombin（凝血酶) or Factor Xa蛋白酶切位点.GST融合表达蛋白的纯化原理：选择能识别并特异性结合GST的特定配体，其中GST的底物谷胱甘肽是较佳的候选对象，两者结合后用还原型谷光苷肽的洗脱缓冲液竞争洗脱表达蛋白。pBAD系列:His-Tag（6 xHis）， Amp+。pDH2:6His tag，Amp+,ColE1复制起点,IPTG诱导表达。稀有密码子：有些在真核细胞中常使用的而在原核细胞中很少使用的密码子。原核表达中可能遇到的问题及影响因素：基因特性。基因含稀有密码子（无蛋白表达）、基因GC含量(超过70%会降低蛋白表达水平)、基因或蛋白大小（介于5KD和100KD之间）、蛋白亲疏水性（亲表达量高,疏难表达）、基因二级结构（抑制翻译的起始）、信号肽（疏水性或毒性，应清除）、表达蛋白比预计的小或用其他小的条带（提前终止，可低温诱导、基因改造）、基因毒性(细胞生长困难，应低温低浓度诱导)、质粒不稳定性（用低温高浓度抗生素）、目的mRNA和蛋白不稳定而表达量低（低温长时表达)、包涵体(为变性的表达蛋白）、培养基pH。表达不出来时首先想到换菌株。构建原核表达系统，考虑3大因素：表达载体、宿主菌株、表达诱导条件。His tag融合蛋白纯化的原理:利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子Ni2+ ，Zn2+,Cu2+ ，Co2+,Fe3+发生特殊的相互作用，从而把富含这类氨基酸的蛋白质吸附,达到分离的目的.洗脱目的蛋白有几种方式：咪唑（条件最温和）、pH 以及EDTA.TCA(三氯乙酸）除去盐酸胍:沉淀盐酸胍、离心、乙醇溶解、离心，得到沉淀为洗脱蛋白，用尿素溶解、透析后保存。基因的真核表达系统：穿梭载体：既能在原核细胞中复制,也能在真核细胞中复制的载体。Western blot(免疫印迹）：将蛋白质凝胶电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质检测技术。原理：蛋白质混合样品经SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE)电泳使蛋白质按分子大小分离，将分离的各蛋白质条带原位转移到固相载体膜（NC、PVDF膜）上用无关蛋白质封闭液封闭膜的非特异性位点，加入特异性抗体后膜上的目的蛋白与一抗发生特异性的免疫结合反应，洗涤后再加入能与一抗发生免疫结合反应的酶标二抗，最后通过二抗上标记酶的性质进行检测，即根据底物显色的颜色及深浅来探测膜上印迹蛋白抗原的存在与否及含量多少。辣根过氧化合酶(HRP）：来源于植物,用于动物性样品的检测(目的是消除样品中内源性酶的干扰，降低背景）。碱性磷酸酶（AP）：来源于动物牛小肠，用于植物性样品的检测，（目的是消除样品中内源性酶的干扰,降低背景）.硝酸纤维素（NC)膜:其结合能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，很脆、易破,但是结合蛋白效率比PDVF高。聚偏二氟乙烯（PVDF）膜：疏水性,不易破，结合蛋白较牢固，可结合小片段蛋白。SDS-PAGE中SDS的作用：强阴离子去污剂使蛋白质变性、亚基解离，破坏蛋白质的四级结构。【蛋白质在电泳分离时，其迁移率主要取决于蛋白质本身所带的电荷多少、分子量大小和形态】。酶标二抗：根据使用的第一抗体选择，如第一抗体为兔抗体，则可使用羊抗兔IgG抗体,若为鼠源抗体，则可使用羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体。Western blot实验步骤:1.SDSPAGE电泳2。电转移-湿转法：将膜、胶、滤纸整个组合完全浸入有铂丝电极的转移缓冲液中的蛋白原位电转移体系。胶正膜负，(）- (+）。Southern blot 地高辛法转膜UV交联（紫外交联原理）:紫外照射使DNA和RNA的一小部分胸腺嘧啶（T）残基与膜表面带正电荷的氨基基团之间形成共价交联。免疫球蛋白（Ig）：是指存在于人和动物血液（血清）、组织液及其它外分泌液中的一类具有相似结构的球蛋白.抗体（Ab）:动物机体受到抗原物质的刺激后， 由B淋巴细胞转化成的浆细胞产生的， 能与相应抗原发生特异性免疫结合反应的免疫球蛋白。抗原（Ag）：能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞（免疫原性）并能与之发生特异性免疫反应（反应原性）的物质。抗原决定簇：存在于抗原分子表面的能够决定抗原特异性的特殊化学基团，是与抗体结合的位点。决定着抗原与抗体发生特异结合的能力。ELISA：把抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机地结合在一起一种免疫学技术.包被:抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。常用的标记基因和选择基因：生化标记基因、抗性标记基因、营养标记基因。生化标记基因：其表达产物可催化某些易检测的生化反应，导入植物24-48小时内就可以检测结果，迅速对转基因程序的有关因素进行评价和优化，获得基因表达水平、载体等信息。常用基因：半乳苷酶基因（lacZ）、葡萄糖苷酸酶基因（GUS）、氯霉素乙酰转移酶基因（CAT)、荧光素酶基因(Luc）、花青素基因(Ant)、绿色荧光蛋白基因（GFP）。氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因：抑制蛋白质生物合成.应用原理：真核生物没有Cat，Cat转化的植物细胞具有对氯霉素的抗性，通过Cat的活性检测分析外源基因的表达。活性检测：反应底物乙酰CoA。方法：硅胶G薄层层析法、DTNB分光光度法。葡萄糖苷酸酶基因(GUS）：染色原理Gus 可以水解葡糖苷酸,形成葡糖醛酸（兰色)。荧光素酶（Luc）基因：在ATP存在下催化D荧光素的氧化反应生成氧化荧光素和黄-绿色光。这是一种对植物组织没有伤害的检测方法.花青素（Ant）基因:转入这些基因后,可以在植物组织上生成红色的花青素斑点。此基因不需任何底物就可以检测，但使用局限性大.绿色荧光蛋白（GFP）基因：是海洋生物水母体内的一种发光蛋白，经过改造后用于做植物的标记基因，基因产物在兰色光或紫色光下可见绿色荧光.抗性标记基因:抗生素抗性基因、重金属抗性基因、代谢抗性基因.抗生素抗性基因：氨苄青霉素抗性基因（Apr)、四环素抗性基因(Tet r)、氯霉素抗性基因(Cm r)、卡那霉素抗性基因（Kanr）、G418抗性基因（G418r）、潮霉素抗性基因（Hygr）、新霉素抗性基因(Neor）.筛选基因：选择的基本原理：使未转化的组织或细胞,在含有选择剂的培养基上新陈代谢受阻而停止生长，最后死亡。重金属抗性基因:铜、锌、镉抗性基因.代谢抗性基因：抗除草剂基因。农杆菌介导转化法:普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。原理：根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将TDNA插入到植物基因组中。【人们将目的基因插入到经过改造的TDNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术,再生出转基因植株】。Ti质粒：根癌农杆菌细胞核外存在的一种环状双链DNA分子。温度低于30？Ti质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应基因，然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达，它们只有进入植物细胞后才能表达，Ti质粒上的冠瘿碱分解基因产物却能分解冠瘿碱,为宿主细胞提供能源、氮源和碳源. 6大功能区：致癌区、冠瘿碱合成区、冠瘿碱分解区、Ti质粒接合转移区、毒性区、DNA复制区.TDNA:在致癌区和冠瘿碱合成区的两侧存在着一个24 bp直接重复序列，由这三部分所构成的DNA区域叫做TDNA。TDNA 区域中的这些基因只有在TDNA插入到植物基因组后才能激活表达.Vir区:毒性区,控制根癌农杆菌附着于植物细胞和Ti质粒进入细胞有关部位。VirE,VirD，VirC,VirG，VirB,VirA(最先激活)。根癌农杆菌对高浓度的创伤诱导分子,即一些酚类化合物具有趋化性，在植物细胞表面附着后,受这些创伤诱导分子的刺激,Ti质粒vir区毒性基因被激活和表达。右边界的缺失，使得DNA合成不能起始,因而TDNA不能释放，所以TDNA不能转移到植物细胞。而左边界的缺失，仅会影响DNA合成过程的终止.基因枪介导法转化:将核酸直接发送至细胞内的物理学方法。原理：利用火药爆炸或高压气体加速，将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。材料:目的基因、受体组织（愈伤组织）、基因枪轰击金粉包埋试剂盒。高压气体可裂膜-子弹载膜子弹-挡网（阻挡可裂膜及载膜的碎片)培养皿受体组织