大鼠取材方案.doc

实验大鼠取材方案取材内容 1. 取大鼠静脉血分离血浆、血清-80保存。 2。 取大鼠门静脉血分离血清80保存. 3. 取大鼠甲状腺组织制备甲状腺电镜观察标本其余组织液氮冰冻保存备用. 4。 取大鼠胸腺组织制备胸腺组织电镜观察标本、免疫组化观察标本其余组织液氮冰冻保存备用。 5。 取大鼠肺组织制备肺组织电镜观察标本、免疫组化观察标本其余组织分装液氮冰冻保存备用. 6。 取大鼠肝脏组织制备肝脏组织电镜观察标本、免疫组化观察标本其余组织分装液氮冰冻保存备用。 7. 取大鼠胰腺组织制备胰腺组织电镜观察标本、免疫组化观察标本其余组织分装液氮冰冻保存备用。 8. 取大鼠肠系膜淋巴结组织制备肠系膜淋巴结免疫组化观察标本其余组织液氮冰冻保存。 9. 取大鼠胃部组织制备胃粘膜组织电镜观察标本、免疫组化观察标本其余组织分装液氮冰冻保存备用. 10。 取大鼠空肠组织制备肠道粘膜组织电镜观察标本、免疫组化观察标本其余组织分装液氮冰冻保存备用。 11。 取大鼠回肠组织制备肠道粘膜组织电镜观察标本、免疫组化观察标本其余组织分装液氮冰冻保存备用。 12. 取大鼠肾组织制备左肾组织电镜观察标本、免疫组化观察标本右肾组织液氮冰冻保存备用。 13。 取大鼠肾上腺组织左侧制备肾上腺组织免疫组化观察标本右侧肾上腺液氮冰冻保存备用。 14. 取大鼠睾丸组织左侧制备电镜观察标本、免疫组化观察标本右侧睾丸液氮冰冻保存备有。 试剂及药品 戊巴比妥钠或10%水合氯醛、75酒精、生理盐水、多聚甲醛或福尔马林液、3戊二醛磷酸盐缓冲液（PBS0。01mol/LP pH7。4）或4戊二醛、肝素钠、器械液器械清洗消毒液 器材 备皮刀、解剖台、弯盘、组织剪、眼科剪、手术刀柄、刀片、小号弯式血管钳、蚊式血管钳、眼科镊、无损伤血管夹、聚乙烯管、三通管、丝线、培养皿、天平、一次性离2ml、1。5ml、冻存管、肝素锂真空采血管、微量移液器、高速离心机、注射器10ml、5ml、2ml、无菌手套、冰箱、冰盒、液氮罐 取材动物 Wistar大鼠 取材步骤 1。 取材大鼠前夜禁食自由饮水. 2。 腹腔注射戊巴比妥钠（45mg/kg） 或10水合氯醛（300mg/kg）将动物麻醉。用5ml的注射器配合5.57号针头。腹腔注射时右手持注射器左手的小指和无名指抓住大鼠的尾巴另外三个手指抓住大鼠的颈部使大鼠的头部向下。这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官.进针的动作轻柔防止刺伤腹部器官. 尤其是对于体重较小的大鼠腹腔注射时针头可以在腹部皮下穿行一小段距离最好是从腹部一侧进针穿过腹中线后在腹部的另一侧进入腹腔注射完药物后缓缓拔出针头并轻微旋转针头防止漏液。待动物麻醉成功后仰卧位固定于解剖台. 3. 修剪去颈部及腹部毛发75酒精消毒. 4. 沿腹侧正中线自阴茎上缘由下而上剪开腹部皮肤直至剑突向两侧钝性剥开皮肤与皮下组织暴露腹壁浅肌层。沿白线钝性分离腹壁肌肉剪开腹膜暴露腹腔将肝脏向上翻起显露门并游离静脉将剪成斜口的聚乙烯管尖端背向肝门方向插入门静脉抽取门静脉血2ml无创血管夹夹闭门静脉止血。将抽取门静脉血加入一次性离心管低温静置过夜4离心3000-3500/min10分钟吸出上清液分装-80摄氏度保存备用。 5. 把胃与脾之间的薄膜除去可见到在其下方有如树枝状的肉色组织分为左、右两叶钝锐结合整体取下胰腺组织及脾脏组织结扎止血。胰腺放置于盛有无菌生理盐水的培养皿中涮洗去血迹。切取胰腺体部约1mm1mm1mm组织3块3戊二醛磷酸盐缓冲液（PBS0。01mol/LP pH7.4）或4戊二醛固定胰腺体部相邻部位组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定其余组织全部液氮冰冻保存备用。生理盐水冲洗操作器械。 6。 剔除脾周组织放置脾脏于盛有无菌生理盐水的培养皿中涮洗去血迹.从脾脏一端切取55mm脾组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定继续切取脾约1mm1mm1mm组织3块3戊二醛磷酸盐缓冲液（PBS0.01mol/LP pH7。4）或4戊二醛固定其余组织液氮冰冻保存备用. 7。 从剑突继续向上剪开皮肤自颌下向两侧钝性剥开皮肤与皮下组织暴露胸廓及颈浅肌层。沿正中剪开胸廓、胸膜避免损伤胸腺的胸腔脏器.暴露心脏找到上下腔静脉后确认右心房5ml注射器直接穿刺右心房最大量抽取外周回心静脉血.加4ml静脉血入肝素锂真空采血管摇匀室温静置10分钟4离心3000-3500/min5分钟吸出上清液分装80摄氏度保存备用。2ml加入普通真空采血管低温静置过夜4离心30003500/min5分钟吸出上清液分装80摄氏度保存备用。 8。 展开肠系膜于肠系膜根部寻找淡蓝色结节样淋巴结组织剔取肠系膜淋巴结数枚放置于盛有无菌生理盐水的培养皿中涮洗去血迹.取部分淋巴结组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定其余组织放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。 心管5ml、9。 上端于贲门上端结扎食管下端于直肠远端结扎直肠末端钝锐结合完整取下胃肠道。 10。 离断胃放置于无菌培养皿残端结扎.沿胃大弯剖开生理盐水洗涤切取约1mm1mm1mm胃窦和胃体黏膜组织各3块3戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0。01mol/LP pH7。4）或4戊二醛固定剪取宽约0.51.0cm包含胃窦、胃体组织1条浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定其余胃组织放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。 11。 距treitz韧带10cm处切取空肠10cm距回盲部10cm处切取回肠10cm生理盐水洗涤切取约1mm1mm1mm空肠和回肠黏膜组织各3块3戊二醛磷酸盐缓冲液（PBS0。01mol/LP pH7。4）或4戊二醛固定剪取宽约0.51。0cm包含全层的空肠和回肠组织各1条做标记浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定其余空肠和回肠组织全部放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。 12. 结扎剪断肝门管道系统钝锐结合完整取出大鼠肝脏放置于无菌培养皿生理盐水冲洗称重并记录。切取肝左叶约1mm1mm1mm组织3块3戊二醛磷酸盐缓冲液（PBS0。01mol/LP pH7.4）或4戊二醛固定左叶肝组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定右叶肝组织称重记录分装后全部放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。 13。 于腹膜外腰部脊柱两侧寻找到肾脏表面光滑、背腹略扁呈蚕豆形。在肾脏的前方内侧和腰下肌的腹面相接处寻找到肾上腺。右侧肾上腺呈豆状长轴指向后内侧左侧呈卵圆形长轴指向腹外侧.钝锐结合摘取两侧肾上腺.左侧肾上腺浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定右叶肾上腺放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。 14。 剪开后腹膜结扎剪断双侧肾门钝锐结合取下双侧肾脏剔除肾周筋膜组织放置于盛有无菌生理盐水的培养皿中涮洗去血迹。于中间肾门部横行切开左侧肾脏切取上端肾脏1mm1mm1mm组织3块3戊二醛磷酸盐缓冲液（PBS0.01mol/LP pH7。4）或4戊二醛固定下端脾脏浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定右侧肾脏放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。 15。 大鼠的阴囊是由肛门腹侧会阴部皮肤下垂所形成的囊袋.性成熟的大鼠睾丸和附睾下降入阴囊使表面凸出并突向后方。小心剪开双侧阴囊可见椭圆形睾丸钝锐结合摘取双侧睾丸、附睾放置于盛有无菌生理盐水的培养皿中涮洗去血迹。 16. 颈白线钝锐结合分离颈前肌群直至气管向上显露甲状腺.仔细操作切取包括甲状软骨在内的甲状腺.切取约1mm1mm1mm组织各3块3戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH7。4）或4戊二醛固定其余组织全部浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定.切取左侧睾丸下端1mm1mm1mm组织3块3戊二醛磷酸盐缓冲液（PBS0.01mol/LP pH7.4）或4戊二醛固定余左侧睾丸组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定右侧睾丸组织放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用. 17。 大鼠胸腺由两叶组成似等边三角形。大部分位于胸腔前纵膈顶端近喉部基底部附着于心包腹面的前上方。钝锐结合完整取下胸腺放置于盛有无菌生理盐水的培养皿中涮洗去血迹。切取胸腺1mm1mm1mm组织3块3戊二醛磷酸盐缓冲液（PBS0.01mol/LP pH7.4）或4戊二醛固定切取胸腺5mm5mm5mm组织1块浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定其余组织置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。 18。 整体取下大鼠心肺组织剪开分离双侧肺脏置于盛有无菌生理盐水的培养皿中涮洗去血迹。切取左肺1mm1mm1mm组织3块3戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0。01mol/LP pH7。4）或4戊二醛固定余左肺浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定冻存管液氮冰冻保存备用。 19。 各取样标本细致编号登记。 20. 大鼠废弃尸体处理。 注意事项 1。 戊巴比妥钠配成1%生理盐水溶液 平均每只大鼠用量12。6mg1.2ml左右。 2。 大鼠腹腔注射可以大鼠腹腔注射的给药容积一般为510ml/kg。 3。 完整取下胃肠道后已将肠系膜撕碎不易寻找肠系膜淋巴结所以先取淋巴结。取下胃肠道由专人操作取胃肠道及胃肠道取下后取材的操作器械单用一套。 4. 取材时三人同时操作取一只大鼠结合取材方案多脏器并行取材缩短取材时间。右肺组织置于无菌1、解剖后应迅速将脏器称重,以免水分蒸发造成差异，特别是肾上腺等小器官的称重.2、脏器称重前应尽量将周围脂肪组织和结缔组织剔除，并用滤纸吸去脏器表面血液及体液，特别是肾上腺、甲状腺、前列腺等较小的器官,更要新鲜称重，防止 器官干燥失水而重量减轻。3、空腔器官称重前，应清除其腔内液体，如心脏应除去血块。