常用DNA酶的总结.doc

1。 T4DNA连接酶：
本酶催化相邻DNA链的5’-P末端和3’-OH末端以磷酸二酯键结合的反应，(将已有的两个DNA片段连接成为一条DNA链的酶，常用于基因工程，将目的基因连在质粒载体上，作用于两脱氧核糖核苷酸间的磷酸二脂键),需ATP作辅酶.本酶不仅可以催化粘性末端之间或平滑末端之间的DNA的连接，也可以催化DNA与RNA之间以及少数RNA之间的连接.
T4DNA连接酶可连接DNA—DNA，DNA-RNA，RNA—RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。T4 DNA连接酶常用于催化双链DNA平末端或互补粘性末端之间的连接反应，也能催化双链RNA 5'-磷酸末端和3’-羟基末端间的连接.还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链中的单链切口。以上反应均需消耗ATP。
粘末端的连接反应: 插入片段和载体的摩尔浓度比特别重要,此比例在2—6之间最好，低于2:1就会导致较低的连接效率，高于6:1则会导致多个插入.摩尔比请按载体与插入片段 DNA浓度及分子大小来计算.
平滑末端的连接反应:平滑末端的连接反应与突出末端相比反应较慢（其Km值约为突出末端的100倍）。进行平滑末端的连接反应时,可提高DNA浓度，将使用酶量增加到突出末端量的2～5倍左右。
与粘粒或噬菌体进行连接反应:可使载体和插入DNA的摩尔比调整为1：1,同时增大DNA浓度以便取得良好效果。 （0.05—0。1 μg／ul以上).
反应温度：该酶的最适温度为37℃,由于热稳定性较差，因此长时间反应时通常需在16℃下进行.若反应1—2小时左右的话也可在室温下进行反应。
抑制剂:T4 DNA连接酶要求Mg 2+，因此螯合Mg 2+的EDTA 的存在会阻碍反应。将溶解于含有高浓度EDTA缓冲液中的 DNA准备作为样品使用时，最好先用灭菌蒸馏水或TE缓冲液进行置换.
2. T4 DNA聚合酶：
T4DNAPolymerase,即T4DNA聚合酶,是一种模板依赖的DNA聚合酶,可以依赖于DNA模板对5’端突出末端进行补平；同时可对3'端突出末端进行削平.也可以在结合有引物的单链DNA模板上，从5'→3’方向催化DNA合成反应。特点:T4DNAPolymerase由于同时具有5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’DNA外切酶活性(但不具有5’→3’外切酶活性），可以用于将5'端突出末端补平、3’端突出末端削平。T4DNAPolymerase的3'→5’外切酶活性比Klenow Fragment要高约200倍。
用途：T4DNAPolymerase可用于催化以下反应：DNA5'或3’突出末端的平滑化；通过置换反应进行标记DNA探针合成;定点突变过程中第二链的合成；不依赖于连接反应的PCR产物克隆。　　活性定义：37℃30分钟时间内，催化10nmol脱氧核糖核苷酸（dNTPs)掺入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。
反应方法：例如，酶切完成后，没有进行任何处理，直接加入一点T4 DNA聚合酶、dNTP和BSA，37°C 10min。　　失活或抑制：70℃加热10分钟可使T4DNAPolymerase失活.金属离子螯合剂可以抑制T4DNAPolymerase的活性。
一般的Klenow Fragment和T4 DNA Polymerase都有5"—3”聚合酶活性和3”—5”外切酶活性,因此都可以用于补平和削平.所不同的是，T4 DNA Polymerase的活性更强。
3. Klenow Fragment：
又称Klenow片段,是大肠杆菌聚合酶I（E。coli。DNA polymerase I)的大片断（Large Fragment)。Klenow Fragment保留了DNA聚合酶I的5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，但缺少完整的Klenow酶的5'→3’外切酶活性。特点：对5'突出或3’突出的粘末端都可以催化产生平末端，用于后续的平端连接。用途：双链DNA 5' 端突出(5’overhang）末端的补平（fill—in）；双链DNA 3’ 端突出(3’overhang）的削平；5'突出末端的标记;随机引物法进行DNA标记;Sanger双脱氧法进行DNA测序;cDNA第二链的合成或定点突变反应第二链的合成。 来源:由大肠杆菌表达，表达基因的来源为polA 基因片段。Fermentas公司的Klenow Fragment有2种。一种是DNA Polymerase I Large Fragment （Klenow Fragment),该酶用于补平的时候不会在补平后再多加碱基。另一种是DNA Polymerase I Large Fragment, Exonuclease Minus［Klenow Fragment exo—］，此酶没有3"—5”外切酶活性，因此不能用于削平；而且，此酶在补平的时候会在补平后再加一个或更多碱基,所以不太适合用于补平。
4. T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK）:
T4 Polynucleotide Kinase，T4 PNK，该酶能够催化磷酸在g-位和双链/单链DNA或RNA的5’-羟基末端以及3’—单磷酸核苷间进行转移和交换:5'-OH +NTP<=〉5'—P+NDP。该酶还具有3’磷酸酶活性，将3'—磷酸基团从寡核苷酸的3’磷酸末端、脱氧3'—单磷酸核苷和脱氧3’—二磷酸核苷上水解掉。
用途:引物或PCR产物的5'末端磷酸化以便进行连接反应.合成DNA接头（Linker） 的5’末端磷酸化以便进行连接反应。DNA及RNA 5’末端的标记,用作寡核苷酸探针。
5. DNA聚合酶1：1.能催化单个脱氧核糖核苷酸连接到DNA链的3’端。2。能沿5'端到3’端方向外切DNA（切除引物)3。能沿3’端到5’端方向外切DNA(纠错，或者说DNA损伤的恢复）6. DNA聚合酶2:1.发挥作用需要镁离子和铵根离子存在2。同样能参与DNA聚合酶1参与的反应，但聚合活性低3。能沿3’端到5’端方向外切DNA7. DNA聚合酶3：1。主要负责DNA链的延伸2。能沿3’端到5’端方向外切DNA在DNA的复制中，DNA聚合酶3负责合成冈崎片段，而DNA聚合酶1负责将RNA引物按逐个核糖核苷酸切除并替换成对应的脱氧核糖核苷酸,最后由DNA连接酶把各冈崎片段连接起来,复制完成。活性（37度时每个酶分子每分钟聚合的核苷酸数)：DNA聚合酶1为600，DNA聚合酶2为30，DNA聚合酶3为9000。
8。 DNA水解酶与DNA限制性内切酶的区别概述
DNA水解酶：催化DNA水解的一种酶，在DNA水解酶作用下，DNA被水解为一个一个的脱氧核苷酸.任何能水解DNA的酶的统称,见到二酯键就切。
限制性内切酶：能切割DNA分子内部的可识别序列的磷酸二酯键，见到识别序列的两侧的磷酸二酯键就切。
9。 DNA聚合酶和DNA连接酶的区别？
DNA连接酶：是一种将已有的两个DNA片段连接成为一条DNA链的酶。常用于基因工程，将目的基因连在载体(一般为质粒)上，作用于两脱氧核糖核苷酸间的磷酸二脂键.
DNA聚合酶：以已有的核酸序列作为模板，将4种脱氧核苷酸(A、T、G、C)按照模板的碱基排列顺序，以“碱基互补原则”依次连接,聚合成为一条新的DNA链。
相同点都是连接的磷酸二酯键。
10。 DNA水解酶在哪里有作用，作用是水解DNA双链吗？
DNA水解酶的作用位点在于磷酸二酯键;DNA在水解酶的作用下，可以得到四种不同的核苷酸，即腺嘌呤脱氧核苷酸【A】，鸟嘌呤脱氧核苷酸【G】,胞嘧啶脱氧核苷酸【C】，胸腺嘧啶脱氧核苷酸【T】.
DNA在水解酶破坏了氢键和磷酸二酯键，DNA初步水解可以得到脱氧核苷酸。
DNA分子彻底水解的产物是磷酸 脱氧核糖和A C G U 四种碱基，这就就需要另外一种酶了.