DB37_T 4639.1—2023猪疫病诊断技术 第1部分：圆环病毒.pdf

ICS 65.020.30 CCS B 41 37 山东省地方标准 DB37/T 4639.12023 猪疫病诊断技术 第 1 部分：圆环病毒 Diagnosis technology of swine epidemic diseasePart 1:Circovirus 2023-08-03 发布 2023-09-03 实施 山东省市场监督管理局 发 布 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件是DB37/T 4639猪疫病诊断技术的第1部分。DB37/T 4639已经发布了以下部分：第 1 部分：圆环病毒。本文件代替DB37/T 18272011猪圆环病毒2型荧光PCR检测技术，与DB37/T 18272011相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：a)增加了“引言”（见引言）；b)更改了提出与组织实施单位（见前言，2011年版的前言）；c)删除了主要起草人和起草单位（见2011年版的前言）；d)更改了“范围”（见第1章，2011年版的第1章）e)增加了“规范性引用文件”和“术语和定义”（见第2章和第3章）；f)更改了“试剂或材料”和“仪器设备”相关内容（见第4章和第5章，2011年版的第2章）；g)增加了“临床诊断”和“病理诊断”（见6.1、6.2）；h)更改了“实验室诊断”（见6.3，2011年版的第3章）；i)增加了“参考文献”（见参考文献）。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本文件的历次版本发布情况为：2011 年首次发布为 DB37/T 18272011；本次为第一次修订。引言 疫病是威胁养猪业健康发展的主要原因，疫病的精准诊断是综合防控的前提。猪圆环病毒病（PCVD）是由猪圆环病毒（PCV）引起的一种多系统性疾病，包括断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎和肾病综合征（PDNS）、增生性坏死性肺炎（PNP）和繁殖障碍性疾病等，主要表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，同时可以导致免疫抑制，进而导致继发或混合感染是国际公认的严重危害养猪业发展的疾病之一，对生猪生产造成巨大的经济损失。为规范我省猪圆环病毒诊断工作，以进一步提高猪疫病综合防控工作能力，保护养殖业公共卫生安全，最大限度减少猪圆环病毒病造成的经济损失，本文件结合先进经验和行业的实际，严格按照 GB/T 1.1标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写的要求编写，以“科学性、先进性、系统性、适用性”为原则，聚焦猪圆环病毒病诊断的关键参数，制定猪疫病诊断技术 第1部分：圆环病毒。猪疫病诊断技术 第 1 部分：圆环病毒 1 范围 本文件描述了猪圆环病毒1型（Porcine Circovirus Type 1，PCV1）、2型（Porcine Circovirus Type 1，PCV2）和3型（Porcine Circovirus Type 3，PCV3；）的荧光PCR检测及鉴别检测技术。本文件适用于猪圆环病毒1型、2型和3型的快速分子诊断。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 试剂或材料 水：符合 GB/T 6682 中规定的一级水。4.1 磷酸盐缓冲溶液（PBS）：取磷酸二氢钾（KH2PO4）0.27 g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.42 g、氯化4.2 钠（NaCl）8 g、氯化钾（KCl）0.2 g，加灭菌水约 800 mL 充分搅拌溶解，加入浓盐酸调 pH 至 7.4，定容至 1 000 mL。核酸提取试剂：市售病毒 DNA/RNA 提取试剂盒或磁珠法提取试剂盒。4.3 荧光 PCR 试剂盒。4.4 5 仪器设备 荧光定量 PCR 仪。5.1 震荡研磨仪。5.2 高速冷冻离心机：离心力8 000 g。5.3 电子天平：精度 0.000 1 g。5.4 生物安全柜。5.5 冰箱：2 8，-20 以下和-70 以下。5.6 涡旋振荡器。5.7 6 诊断方法 临床诊断 6.1 6.1.1 流行特点 猪是PCV的天然宿主，各种年龄、不同性别的猪都可以感染，但以哺乳期和育成期的猪最易感。病猪和带毒猪是主要的传染源，可经口腔、呼吸道、精液感染不同日龄的猪，少数孕猪还可经胎盘垂直传播。6.1.2 临床症状 6.1.2.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)引起断奶期进行性消瘦、皮肤苍白、呼吸困难、厌食、精神沉郁、被毛粗乱、出现以咳嗽、喷嚏、呼吸加快及呼吸困难为特征的呼吸障碍，10%20%猪的皮肤和可视粘膜可见黄疸，猪群的死亡率增加，体表淋巴结，特别是腹股沟浅淋巴结肿大，有的还表现腹泻和中枢神经症状。其它临床症状，包括咳嗽、发热、胃炎、脑膜炎及突然死亡。6.1.2.2 猪肾病与皮炎综合征(PDNS)断奶仔猪和育肥猪食欲减退，有时体温上升，皮下水肿，皮肤表面出现圆形或不规则形隆起，红色或紫色、中央发黑的斑块。破损皮肤常融合成大的块。通常病变在后肢、腹部首先发现，然后慢慢向胸、耳等部位扩展。剖检，在大部分死亡猪中，可见双肾肿大、苍白、皮质有出血小点。6.1.2.3 仔猪的先天性震颤(CT)出生后3周龄仔猪，因痉挛而出现步态异常姿势，从双耳，被毛和尾巴等发抖，发展到全身肌肉有节奏性扭摆，后肢严重痉挛，呈跳跃运动等。欲称“仔猪跳跳病”或“仔猪抖抖病”，是仔猪刚出生不久，出现全身或局部肌肉阵发性挛缩的一种疾病。另一种表现是后肢肌肉呈强直性痉挛，后肢分开，似犬坐姿势，尾部轻微震颤，病猪可在3周内康复。6.1.2.4 猪增生性和坏死性肺炎(PNP)与保育猪和育肥猪发生的呼吸道病有关。PNP的确诊主要依据组织病理学变化，表现为增生性和坏死性肺炎，病猪主要表现呼吸困难，肺脏见点状出血。病理诊断 6.2 剖检病变为猪只消瘦，贫血，皮肤苍白，黄疸，最显著的剖检变化是全身淋巴结肿大，特别是腹股沟浅淋巴结、肠系膜淋巴结、气管支气管淋巴结及下颌淋巴结肿大25倍，有时可达10倍。切面硬度增大，可见均匀的白色，所有病例几乎都能看到肺萎缩不全，重量和硬度增加，部分病例尖叶有固质化、致密的病灶，肺有轻度的多灶性或高度的弥漫性间质肺炎。肺脏肿胀，坚硬似橡皮样；肝脏发暗，肝小叶间结缔组织增生。肝脏最常见到门脉周围淋巴细胞、组织细胞浸润，具有窦状隙内单核炎性细胞集聚和肝细胞的单细胞坏死为特征的肝炎。慢性死亡病例，由于黄疸而使肝小叶周围纤维化，肝细胞坏死、消失及单核细胞弥漫性浸润。肾脏水肿、苍白，被膜下有坏死灶。显微镜观察，淋巴结的皮质区及副皮质区显著扩张，有单核和巨噬细胞浸润，有时散布有大量的多核巨细胞，有些淋巴细胞萎缩，少数情况还有坏死。肝脏表现不同程度的炎症，有淋巴细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞浸润；肾脏的皮质和髓质也有炎症存在。实验室诊断 6.3 6.3.1 样品采集 6.3.1.1 细胞培养样品 按照GB 19489规定，取细胞培养样品。6.3.1.2 剖检样品 按照NY/T 541规定采集病死猪的淋巴结、脾脏、肾脏和肺脏等组织样品。6.3.2 样品的保存及运输 样品2 8 贮藏。样品保存在2 8 条件下不超过24 h，-20 以不超过3个月，-70 以下不超过5年。必须低温保存运输样品，且在规定温度下的保存期内送达和检测。6.3.3 样品处理 6.3.3.1 淋巴结、脾脏、肾脏和肺脏等组织样品 取适量大小的组织块放入盛有500 L PBS（4.2）的研磨管中，6 000 r/min震荡研磨45 s，制成约10%的组织匀浆液，5 000 r/min离心5 min，上清液备用。6.3.3.2 细胞培养样品 将细胞培养样品反复冻融3次，3 000 r/min离心5 min，弃去细胞碎片，上清备用。6.3.4 试验步骤 6.3.4.1 核酸提取 采用DNA提取试剂盒提取各类样本中的病毒核酸。如在2 h内检测可将提取的核酸置于冰上保存，否则应置于-20 冰箱保存，具体操作步骤如下：a)取上清液（6.3.3）200 L 置于 1.5 mL 离心管中，加入 500 L 裂解液，在涡旋振荡器上振荡 30 s 混匀，室温静置 2 min；b)裂解后的液体移入吸附管柱，6 000 r/min，离心 5 min；注：此时病毒DNA会吸附再管柱底部的膜上。c)加 500 L 洗液至管柱上，6 000 r/min，离心 5 min，弃去洗液；d)重复上一步骤 1 次；e)8 000 r/min 离心 10 min，去除残留在膜上的乙醇；f)将吸附柱转移至新的离心管中，开盖室温静置 2 min；加入 50 L 洗脱液，室温静置 1 min；g)将含有吸附柱的离心管，8 000 r/min 离心 1.5 min，得到 DNA。6.3.4.2 荧光 PCR 扩增 设25 L反应体系，荧光PCR扩增反应液体系见表1，荧光PCR扩增引物参见附录A。表1 荧光 PCR 扩增反应液体系 序号 组分 用量 1 2SYBR Green Pro Taq HS Premix*6 12.5 2 10 M PCV-F 1.0 3 10 M PCV1-R 1.0 4 10 M PCV2-R 1.0 表1 荧光PCR扩增反应液体系（续）序号 组分 用量 5 10 M PCV3-R 1.0 6 模板DNA 1.5 7 ddH2O 7 6.3.4.3 检测 设置阳性、阴性对照，荧光定量PCR扩增反应条件见表2。表2 荧光定量 PCR 扩增反应条件 序号 进程 反应条件 反应时间 1 预变性 95 30 s 2 变性 95 30 s 3 退火 62 30 s 4 延伸 72 10 s 5 循环数（24）40 6 信号采集 退火时采集 6.3.5 结果判定 6.3.5.1 结果分析条件设定 直接读取检测样品的熔解曲线峰值温度，温度误差0.1 范围内。6.3.5.2 质控标准 6.3.5.2.1 阳性对照参见附录 B。6.3.5.2.2 阴性对照熔解曲线无峰值。6.3.5.3 样品检测结果分析 在阳性和阴性成立前提下，样品检测结果判定如下：a)熔解曲线峰值温度为 84，则样品中含有 PCV1；b)熔解曲线峰值温度为 85，则样品中含有 PCV2；c)熔解曲线峰值温度为 82，则样品中含有 PCV3；d)熔解曲线峰值温度为 84 和 85，则样品中含有 PCV1 和 PCV2；e)熔解曲线峰值温度为 84 和 82，则样品中含有 PCV1 和 PCV3；f)熔解曲线峰值温度为 85 和 82，则样品中含有 PCV2 和 PCV3；g)熔解曲线峰值温度为 84、85、82，则样品中含有 PCV1、PCV2 和 PCV3。A A 附录A （规范性）荧光 PCR 扩增引物 荧光定量PCR扩增引物见表A.1。表A.1 荧光定量 PCR 扩增引物 引物名称 序列 PCV-F 5-TKGATGATYTTTTATGGSTGG-3 PCV1-R 5-GTCAGCAGTTGAGGACTACCATT-3 PCV2-R 5-AGTAATCCGCCGATAAAGAGC-3 PCV3-R 5-CTCCTAAACAAGGCCTCCAACT-3 注：简并碱基 K：G/T；Y：C/T；S：G/C B B 附录B （资料性）阳性对照 阳性对照样品PCV1、PCV2、PCV3的熔解曲线峰值温度分别约为84、85、82，阴性对照样品没有熔解曲线时试验成立（见图B.1）。标引序号说明：1PCV3（82）；2PCV1（84）；3PCV2（85）。图B.1 阳性对照 参考文献 1 中华人民共和国农业农村部病死及病害动物无害化处理技术规范