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可溶性蛋白质含量测定

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考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量

一、原理
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm在一定蛋白质浓度范围内（1-1000µg），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
考马斯亮蓝G-250于蛋白质结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡。其结合物在室温下1h内保持稳定。此法灵敏度高，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。
二、材料、仪器设备及试剂
1、材料：小麦叶片、马铃薯块茎、或其他植物材料
2、仪器设备：分光光度计、研钵、烧杯、移液管
3、试剂
（1）标准蛋白质溶液：100µg·ml-1牛血清白蛋白：称取牛血清白蛋白25mg，加水溶解并定容至100ml,吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml即可。
（2）考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml90%乙醇中，加入100ml 85%（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。
三、实验方法及步骤
1、标准曲线的绘制
取6支具塞试管，按表加入试剂。混合均匀后，向各管中加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min左右，在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
管号
1
2
3
4
5
6
标准蛋白质（ml）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水量（ml）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
蛋白质含量（µg）
0
20
40
60
80
100

图1 蛋白质质量数与吸光度值线性关系图（雷恩，2016）
2、样品测定
（1）样品提取：氨基酸含量测试结束后，剩余的样品提取液可以作为该实验的样品提取液，如果没有上述提取液，则按照下面的方法进行提取。
取鲜样0.5g，加入2ml蒸馏水研磨，磨成匀浆后用6ml蒸馏水冲洗研钵，洗涤液收集在同一离心管中，在4000r/min下离心10min，弃去沉淀，上清液转入容量瓶，以蒸馏水定容至10ml，摇匀后待测。
（2）吸取样品提取液0.1ml，放入具塞试管中（每个样品重复2次），加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。
（3）结果计算（单位mg/g）样品中蛋白质含量=（C·VT）/（1000·VS·WF）
式中：C—查的标准曲线值（µg）
VT—提取液总体积（ml）
WF—样品鲜重（g）
VS—测定时加样量（ml）

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