新型HDAC抑制剂——苯达莫司汀化合物Nl-101的抗白血病作用及机制研究doc资料.docx

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中国医学科学院北京协和医学院(清华大学医学院)博士学位论文

中文摘要

研究目的：开发具有生物活性高、毒性低等特点的新药一直是肿瘤治疗研究领域的 热点，其中分子合成药物由于能够克服传统化疗药物的缺陷而备受关注。NL．101 是一种连接组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA以及烷化剂苯达莫司汀的活性基团而 合成的化合物。本文探讨这种化合物在体外和体内对于白血病细胞的杀伤作用以及 相关分子机制。

研究方祛：采用MTT法检测NL．101、SAHA和苯达莫司汀对多种白血病细胞系增 殖能力的影响，用SPSS软件计算半数抑制剂量(ICs0)，用CompuSyn软件计算 SAHA和苯达莫司汀的药物联合指数(CI)；用流式细胞术分析药物处理后细胞的 周期和凋亡变化；Western blot检测药物处理后组蛋白H3乙酰化水平，以及蛋白凋
亡和DNA损伤相关蛋白包括Y—H2AX、PARP、caspase．3、Bax、Bcl．2和Bcl．xL的 表达；Ficoll法分离病人原代细胞，瑞氏染色观察细胞经药物处理后的形态改变。 体内实验部分，通过逆转录病毒感染构建共表达AMLl．ETO和C．KIT突变的移植
白血病小鼠模型，给予NL．101、苯达莫司汀和SAHA注射治疗，动态监测小鼠体 重以及体内白血病细胞浸润情况，记录各组小鼠生存期。

研究结果：在体外实验中： (1)苯达莫司汀和SAHA在白血病细胞中具有协同作 用。 (2)NL．101对多种白血病细胞系的生长有明显的抑制作用，其中Kasumi．1 和NB4细胞的敏感性最为显著；NL一101对正常细胞系的作用较小，显示出对肿瘤 细胞作用的选择性；NL一101的抗增殖能力显著高于苯达莫司汀，与SAHA没有显 著差异。(3)NL．101导致白血病细胞周期阻滞于S期，以及显著的细胞凋亡。(4) NL．101的细胞毒性作用在分子水平上表现为激活依赖caspase．3的凋亡通路以及 Bcl．2家族促凋亡蛋白；NL．101能增加DNA损伤标志蛋白Y．H2AX和乙酰化组蛋白
H3的表达。(5)NL．101能诱导急性髓系白血病患者的原代细胞发生DNA损伤和 细胞凋亡。在体内实验中： (1)成功建立共表达AMLl．ETO和C．KIT突变的移植 白血病小鼠模型，造血器官中有大量原始细胞(c．硒t+、Grl一、CDllb-)浸润。(2)
NL．101能抑制t(8；21)白血病细胞的增殖和浸润，显著延长白血病小鼠的生存期，具
有比苯达莫司汀和SAHA更强的抗自血病活性。(3)NL．101对小鼠体重没有显著
影响，小鼠的耐受性良好。

研究结论：由SAHA和苯达莫司汀的活性基团合成的新型药物NL一101，在体内及

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体外实验中均具有抑制白血病细胞增殖以及诱导细胞凋亡的生物学效应。针对作用 机制的研究显示NL．101具有抑制组蛋白去乙酰化酶和破坏DNA结构的双重活性。

关键词：新型合成药物；组蛋白去乙酰化酶抑制剂，I苯达莫司汀；凋亡；急性髓系
白血病

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Abstract

A novel SAHA—bendamustine hybrid induces apoptosis of leukemia cells objective：Development of novel drugs with powerful biological activity and low
toxicity has been a hot area for the research of cancer therapy．Hybrid anticancer drugs are of great therapeutic interests as they Can potentially overcome the deficiencies of conventional chemotherapy drugs and improve the efficacy．We reported a novel hybrid NL一1 0 1 which comprises the chemoactive groups of histone deacetylase inhibitor SAHA and alkylating agent bendamustine．In this study，we tested the in vitro and in vivo anticancer effect of NL一1 0 1 on acute myeloid leukemia cells，and investigated its possible related mechanisms．

Methods：Cell lnhibition rate of leukemia cells treated with NL-1 0 1．SAHA and bendamustine was determined by MTT assay．The inhibitory concentration of the drug uesd to cause 50％inhibition of cell growth(IC50)was calculated by SPSS statistical software．The combination index(CI)of SAHA and bendamustine was calculated by CompuSyn software．The cell cycle distribution and apoptosis rate were detected by flow cytometry．Westem blot analysis was used to analyze the level of acety7lated H3 as well as cell signaling proteins related apoptosis and DNA damage，including Y-H2AX，PARP,
caspase-3，Bax，Bcl一2 and Bcl-xL．Bone marrow samples of AML patients and healthy donors were isolated by Ficoll gradient solution and the morphology was observed witll
Wright staining．For in vivo experiment，transplantable mice leukemia model CO—expressing AMLl一ETO and HyC-K【TD816V were generated by retroviral infection． Leukemia mice received NL-1 0 1，bendamustine and SAHA treatment．The body weight and the infiltration of GFP+cells were monitored，and the survival time of each mouse
Was recorded．

Results：In vitro study：(1)The synergistical effect of SAHA and bendamustine Was proved in leukemia cells．(2)NL一1 0 1 exhibited efficient anti—proliferative activity on myeloid leukemia cells especially Kasumi-1 and NB4 cells with resistance on

non-malignant cells．The potency of NL一1 0 1 showed far superior to that of bendamustine， while similar with SAHA．(3)NL-1 0 1 caused S phase arrest and significant apoptosis of 4

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Kasumi-1 and NB4 cells．(4)The activation of caspase-3 dependent apoptosis pathway and members of Bcl一2 family proteins contributed to its cytotoxic effect．In addition， NL-1 0 1 presented both the properties of HDAC inhibition and DNA damage，as assessed
by the acet)rlation of histone H3 and DNA double-strand breaks marker 7-H2AX．(5)
NL-1 0 1 induced apoptosis and DNA damage in primary cells from acute myeloid
leukemia(AML)patients．
In vivo study：(1)Recipient mice CO—expressing AMLl-ETO and HyC-KITD816V developed aggressive acute leukemia with extensive infiltration of immature blast cells
(c-Kit+，Grl一，CDl lb-)in hematopoietic organs．(2)NL一101 treatment could reduce the infiltration of leukemia cells and significantly prolong the survival time of leukemia mice，
showing the enhanced efficacy than bendamustine and SAHA．(3)Recipient mice could
tolerate the NL．1 0 1 treatment without significant weight lOSS．

Conclusions：The novel SAHA··bendamustine compound NL--1 0 1 exhibited potent anti-proliferative and pro-apoptotic activities towards AML cells both in vitro and／n vivo． It possessed the dual mechanisms of HDAC inhibition and DNA damage．

Keywords：novel hybrid；HDAC inhibitor；bendamustine；apoptosis；acute myeloid
leukemia

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本论文研究新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂．苯达莫司汀合成化合物NL．101在体 内及体外的抗白血病活性，并初步探讨其作用机制。主要分为两部分：第一部分， 体外NL．101抗白血病作用的评价及其分子机制的研究；第二部分，建立t(8；21)白 血病小鼠模型并在体内评价NL．101功能。

第一部分体外NL-101抗白血病作用的评价及其分子

机制的研究

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前言

迄今为止，化疗仍然是临床治疗实体肿瘤和恶性血液疾病最有效的方法。然而， 靶向性差以及严重的毒副作用制约了传统的化疗药物的发展，高效低毒的新型抗肿 瘤药物的研发一直是肿瘤领域的研究热点。
组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylases inhibitor，HDACi)是近年来日 益受到关注的一类新型抗肿瘤药物，其靶向性强、毒性较低，较传统细胞毒药物具 有明显优势。组蛋白去乙酰化酶(HDACs)通过调节组蛋白的乙酰化水平，以及一 系列非组蛋白成分，包括基因转录因子和参与调节细胞增殖、迁移和死亡的蛋白表 达，参与基因的转录调控【1．31。在白血病和淋巴瘤中，HDACs过度表达并被转录因 子异常募集，导致靶基因的转录受到抑$1J[4，5】。因此，HDACi通过抑制HDACs的活 性，上调组蛋白的乙酰化水平，重新激活抑癌基因的转录和表达，能够发挥抗白血 病细胞的生物学效应【6】；并且针对于正常细胞和肿瘤细胞之间的差异，HDACi达到 了高选择性、低毒性的治疗效果。目前HDACs成为抗肿瘤药物最具潜力的靶点之 一，可以从多个方面发挥抗白血病作用，包括抑制肿瘤细胞生长，阻滞细胞周期， 诱导细胞分化和凋亡【7-9】。异羟肟酸类化合物是目前研究最为广泛的一类组蛋白去乙 酰化酶抑制剂，其中vorinostat(SAHA)作为首个获得美国FDA批准的组蛋白去 乙酰化酶抑制剂，用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤(Cutaneous T-cell lymphoma，CTCL)， 显示出较好的临床疗效以及患者耐受性【lo，11】。
众多研究显示，组蛋白去乙酰化酶抑制剂与传统的化疗药物联用，能够增加细 胞对药物的敏感性【l2‘15】。比如entinostat(MS。275)和苯达莫司汀(bendamustine)能 协同抑制多发性骨髓瘤(mutiple myeloma，MM)细胞的增殖，并克服对传统化疗 药物的耐药[16】。苯达莫司汀是一种具有氮芥基团和苯并咪唑的双功能氮芥衍生物，
能直接破坏DNA结构，诱导细胞凋亡，并且与其他细胞毒药物无交叉耐药[17-19]。 苯达莫司汀自上市以来被广泛用于血液系统肿瘤以及乳腺癌等实体肿瘤的治疗。临 床试验中与其他一线治疗药物联用，在治疗非霍奇金淋巴瘤(non．Hodgkin
lymphoma，NHL)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphoid leukemia，CLL)和多
发性骨髓瘤等淋巴系统肿瘤中得到了良好的效果[20-24]。 理论上，HDACi通过开放染色质的构象，能够增加DNA损伤药物与癌细胞
DNA的接触【25‘5 26]。此外，HDACi能够上调DNA修复蛋白的乙酰化水平，从而抑 制修复通路的激活[27，28】。因此联合HDACi和靶向DNA损伤的化疗药物可以作为一 种癌症治疗的策略[29】。
基于以上研究证据，杭州民生药物研究所设计并合成了一系列基于HDACi和 传统烷化剂结合的化合物。体外筛选过程中发现代号为NL．101的化合物具有显著 的抗增殖能力，前期的系列研究表明其具有令人意外的抗恶性肿瘤作用。用NCI．60

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细胞系对NL．101进行测试发现，NL一101体外抑制肿瘤的活性平均是苯达莫司汀的 35倍，与SAHA相当(NSC．751447)。COMPARE分析表明，NL．101不同于苯达 莫司汀和SAHA，具有新的作用机制，可能与传统药物无交叉耐药【30，3l】。本实验室 与杭州民生药物研究所合作，首先利用MTT、流式细胞术、Western blot等实验方 法在体外条件下评价NL．101对白血病细胞的作用及机制。

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材料与方法

实验材料

一、实验细胞 1．细胞系：
Kasumi．1 人急性髓系白血病M2细胞系
NB4 人急性髓系白血病M3细胞系
HL 60 人急性髓系白血病M3细胞系
KGl．a 人急性髓系白血病细胞系
U937 人急性单核细胞白血病细胞系
K562 人慢性髓系白血病急变细胞系
Raji 人Burkitt’S淋巴瘤细胞系
Nalm6 人B系急性淋巴细胞白血病细胞系
Jurkat 人T系急性淋巴细胞白血病细胞系

’
HEK293 人胚’肾细胞系
HS一5 人骨髓基质细胞
以上细胞系均为本实验室培养、传代。 2．原代细胞：
原代骨髓单个核细胞来自10例白血病患者及3名正常供者，其中男性6例，女 性4例。所有病例均来自2013年11月～2014年5月期间我院住院收治患者，中位 年龄是35．5岁(21．58岁)。诊断符合2008 WHO血液肿瘤分型。所有患者均签署 知情同意书。
二、实猁
1．药品：均由杭州民生药物研究所提供。
(1)NL．101原料(批号20120911)：白色粉末，分子量为415．29／mol，HPLC鉴 定纯度大于98．5％。以DMSO溶解配制成50mM的储存液，．80。C储存。使用 时用不含血清的RPMI 1640培养液稀释成不同浓度的工作液。分子结构如下
图：

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O

(2)SAHA(vorinostat)：分子量264．329／mol，体外实验以DMSO配制成20mM
储存液，分子结构如下图：

O
H
N ．．，OH
N
H
O

(3)苯达莫司汀(bendamustine)：分子量394．729／mol，以DMSO配制成150mM 储存液，分子结构如下图：

2．常用细胞培养试剂：
(1)Dulbecco’S Modified Eagle Medium(DMEM)培养基：DMEM粉剂(购自美国 Gibco公司)，39 NaHC03，29 HEPES，去离子水定容至1L，直径0．229m微 孔滤膜过滤除菌，4"C储存。
(2)Iscove’S Modified Dulbecco’S Medium(IMDM)培养基：IMDM粉剂(购自Gibco
公司)，3．0249 NaI-IC03，去离子水定容至1L，直径0．22}tm微孔滤膜过滤除
菌。
(3)RPMI 1640培养基：RPMI 1640粉剂(购自Gibco公司)，1．59 NaHC03，39
HEPES，去离子水定容至1L，直径O．229m微孔滤膜过滤除菌。
(4)胎牛血清(FBS)：购白天津TBD瀚洋生物制品公司血清的用于培养NB4等 白血病细胞系；购自Hyclone公司的血清用于培养贴壁细胞HEK293和HS一5；
购自Gibco公司的血清用于培养Kasumi．1细胞。

(5)磷酸盐缓冲液(PBS)：89 NaCl，O．29 KCl，1．449 Na2HP04·12H20，0．249 KH2P04，
去离子水定容至1L，高温高压灭菌保存。

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(6)D—Hanks缓冲液：0．359 NaHC03，89 NaCI，0．1349 Na2HP04·12H20，0．49 KCl， 0．069 KH2P04，溶于900ml去离子水中，调整pH至7．2．7．4，定容到1L。
(7)胰酶：购自Sigma-Aldrich或Gibco公司。
(8)青链霉素双抗：购自Gibco公司，10000U青霉素+10000pg链霉素／ml，按l：
100稀释使用。
(9)DMSO：购自Sigma-Aldrich公司，室温保存。 (10)人外周血淋巴细胞分离液(Ficoll)：购白天津TBD瀚洋生物制品公司。 3．细胞功能实验相关试剂：
(1)MTT溶液(5mg／m1)：购自Sigma公司，取500mg MTT粉末溶于100ml PBS(pH
值7．4)，以0．22I．tm微孔滤膜过滤除菌，．20℃储存。
(2)10％SDS·HCI：109 SDS粉末溶于9009l去离子水中，加入100pl盐酸。 (3)碘化丙啶(PI)：购自Sigma公司，用无菌水溶解至1 mg／ml，-4℃保存，用
于检测细胞周期。
(4)Alexa Fluor 647一Annexin V抗体：购自BioLegend公司。
(5)Annexin V binding buffer(10x)：购自美国BD Pharmingen公司，用去离子水 稀释10倍使用，4℃储存。
4：蛋白质检测相关试剂：
(1)4x蛋白上样缓冲液：2ml 2-Me(p．巯基乙醇)，4ml丙三醇(甘油)，2．5ml Tris—HCl
(PH6．8)，0．89 SDS，0．049溴酚蓝，蒸馏水补足lOml。
(2)1．5M Tris．HCl：181．79啊s溶于900ml蒸馏水，HCl调pH值至8．8，补足至

1L。

(3)1．0M Tris．HCl：121．169 Tris溶于900ml蒸馏水，HCl调pH值至6．8，补足至
1L(pH 6．8)。
(4)电极缓冲液(pH 8．3)：69嘣s，28．89甘氨酸，lg SDS，蒸馏水定容至1L。
(5)转移缓冲液(半干转)：28．89甘氨酸，69嘣s，0．379 SDS，200ml甲醇，蒸 馏水定容至1L。
(6)PBS．T：1 xPBS加0．1％Tween．20。 (7)封闭液：5％PBT脱脂奶，脱脂奶粉29溶于40ml PBS-T，混匀。 (8)RIPA裂解液(强)：0．87669 NaCl，lg脱氧胆酸钠，0．19 SDS，50mM riffs
(pH 7．4)，lml Triton X一100，去离子水定容至100ml，4V保存，使用前加
入蛋白酶抑制剂PMSF(10pglml)。 (9)硝酸纤维素膜：购自PALL公司。 (10)Westem blot一抗：

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(11)Western blot二抗：辣根酶标记山羊抗兔IgG，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG，
购自北京中杉金桥生物有限公司。 (12)ECL化学发光剂：购自德国Millipore公司。
(13)蛋白Marker：购自德国Thermo公司。

四、实验仪器

仪器名称 生产厂家
流式细胞仪 LSRII／AiraIII，BD，美国
C02细胞培养箱 Thermo，德国
荧光倒置显微镜 Nikon，日本
普通倒置显微镜 Nikon，日本
常温台式离心机 Thermo，德国
丙烯酰胺凝胶电泳及转膜装置 Bio—rad，美国
化学发光成像分析仪 GE Healthcare，美国
高速离心机 Beckman，德国
恒温水浴锅 Crystal，美国
金属浴 Thermo，德国
恒温振荡器 苏州市培英实验设备有限公司
精密天平 Shimadzu，日本
超纯水系统 Millipore，德国
普通PCR仪 ABI，美国
超净台 北京东联哈尔仪器制造有限公司

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．80℃超低温冰箱 青岛海尔股份有限公司
细胞涂片离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司
移液器 Eppendorf／Thermo，德国
漩涡振荡器 Scientific Industries，美国

实验方法

一、药物对细胞功能的影响 1．细胞培养
细胞在含37℃、5％C02的培养箱中传代培养。Kasumi．1细胞用RPMI 1640培 养液加20％胎牛血清(Gibco)培养，其余白血病细胞系用含10％血清的RPMI 1640 培养液培养。HEK293和HS．5细胞用含10％胎牛血清(Hyclone)的DMEM培养 液培养，用0．25％胰酶．EDTA消化传代，每两天传代一次。 2．MTT法检测NL．101对细胞增殖的影响
原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝
紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细 胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定 细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。 (1)细胞处理：对于悬浮细胞，取处于对数生长期的细胞，800rpm离心5分钟；
在显微镜下计数后，调整密度为(1．2)x105／ml的单细胞悬液；用无血清培养
基将药物储存液稀释到不同浓度，与细胞充分混匀后，接种于96孔板中，每 孔1001．tl，每个浓度设4个复孔；同时设置细胞悬液加DMSO的对照组(DMSO 终浓度与最高药物浓度组中DMSO的浓度相同)，以及只含培养液的空白对 照；对于贴壁细胞，胰酶消化后，接种于96孔板中，每孔3×103细胞，24小 时后吸去孔内培养液，再加入含不同浓度药物的DMEM培养液。
(2)MTT法测定增殖：将细胞置于C02孵箱中培养24、48、72小时后，每孔加 入MTT 109l(MTT的保存和使用需要避光)，继续培养4小时后加入1009l IO％SDS，孵育12．16小时，观察各孔颜色变化，震荡混匀后用酶标仪读取 546nm波长处的吸光度值(OD)。
(3)结果分析：以没有细胞仅加培养液为空白对照组，以细胞加DMSO处理为阴 性对照组，细胞存活率％=(给药组OD平均值．空白对照组OD平均值)／(阴 性对照组OD平均值．空白对照组OD平均值)x100％，用SPSS软件计算半数 抑制浓度(ICso)，Graphpad软件分析数据并作图。

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3．流式细胞术分析NL．101对细胞凋亡的影响 原理：在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，
而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV是 一种磷脂结合蛋白，与PS有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与 凋亡早期细胞的胞膜结合，因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。 碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但 能透过凋亡中晚期的细胞和死细胞的细胞膜而染核。因此将AnnexinV与PI联合使 用，可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。 (1)细胞处理：将细胞以2x10s／ml密度接种于6孔板中，加入不同浓度药物处理
48小时后，收集细胞离心，用预冷的PBS洗涤1次，弃上清； (2)抗体标记：将细胞重悬于1 009l 1 xBinding Buffer中，加入2pl Annexin V-Alexa
Fluor 647以及39l PI，混匀后室温避光孵育15分钟；再加入100．150pl
1xBinding Buffer重悬；经尼龙网过滤，用流式细胞仪检测细胞凋亡比例。
(3)结果分析：Annexin V+／PI’为早期凋亡细胞，Annexin V+／PI+为晚期凋亡和死 亡细胞。
4．流式细胞术分析NL．101对细胞周期分布的影响
原理：碘化丙啶(PI)是一种双链DNA的荧光染料，与双链DNA结合后可以产 生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比；用流式细胞仪测定细胞DNA含 量，根据DNA含量的分布情况可以进行细胞周期分析。 (1)细胞处理及固定：细胞经不同浓度药物孵育12小时后，台式离心机3000rpm
离心3分钟，用PBS洗涤一次；1009l预冷PBS充分重悬细胞，逐滴加入lml 75％的预冷乙醇中，并震荡避免细胞聚集成团，置于40C冰箱固定至少24小 时后，离心并用PBS洗一遍(注意：固定时至少106细胞，并一定吹散成单细
胞悬液)；
(2)碘化丙啶染色：1001上1 PBS重悬细胞，加入109l RNase A(终浓度为1001上g／mL) 室温避光孵育20分钟后，再加入300}tl浓度为50}tg／ml的碘化丙啶，在流式 细胞仪上计数至少10s个细胞，用ModFit软件分析G0／G1、S和G2／M期细胞 的比例。

二、Western blot法分析NL．101对相关蛋白表达的影响 1．细胞收集及蛋白提取
(1)细胞经药物处理后收集，计数，取5x106细胞，预冷PBS洗涤2次，台式离 心机3000rpm离心3分钟，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液5009l，反复
吹打充分裂解细胞，冰上放置30分钟；

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(2)12000rpm，4。C离心15分钟，将上清转移至一新1．5ml EP管中，取少量蛋白
进行蛋白定量；
(3)其余蛋白加入1／3体积的4x上样缓冲液，混匀，沸水煮5分钟后，置于．80℃
保存备用。
2．BCA法进行蛋白定量

(1)向96孔板中分别加入259l、201al、151．tl、109l、51al、09l lmg／ml牛血清白蛋
白(BSA)标准品溶液，加冷PBS补足至251al； (2)吸取待测蛋白裂解液上清161．tl，加冷PBS补足至809l(稀释5倍)； (3)取已稀释的蛋白251al加入96孔板，每个样品设3个复孔；
(4)向以上各孔加入BCA混合溶液2009l(A液：B液=50：1)，混匀；
(5)置37℃恒温箱孵育30分钟后，用酶标仪在546nm处测得吸光度，根据标准 品吸光度和浓度做出标准曲线，得到直线回归方程，计算待测样品蛋白浓度； 按每孔上样量为30—50肛g总蛋白计算所需细胞裂解液体积，保证从各样本中取 出等量蛋白，用上样缓冲液调整使得上样体积一致，每孔上样量为401al。
3．蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、抗体标记及检测 (1)清洗并固定玻璃板，按待检测目标蛋白分子量大小配制聚丙烯酰胺分离胶，
配方如下：

10％ 12％

共7．5ml
(2)将分离胶加入垂直板中，加lml ddH20于胶顶部封闭，室温放置15分钟，待 胶凝固后，滤纸吸干水层。配制5％浓缩胶，配方如下：
ddH20 1．4ml

30％聚丙烯酰胺 3301．tl
1．0M Tris—HCl(PH6．8) 2509l
10％SDS 20“l