三叶青黄酮对食管鳞状细胞癌细胞迁移、侵袭及自噬的影响_殷晓庆.pdf

福建中医药 2023 年 4 月 第 54 卷 第 4 期Fujian Journal of TCM April 2023，54（4）三叶青黄酮对食管鳞状细胞癌细胞迁移、侵袭及自噬的影响殷晓庆1，2，涂铭书2，庄婉珍2，夏雨1，2，张毅2，黄毅2*（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122；2.福建省立医院，福建 福州 350001）摘要：目的 探讨三叶青黄酮对食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞迁移、侵袭及自噬的影响。方法 取对数生长期的人ESCC细胞株KYSE150细胞（以下简称KYSE150细胞）分为0 g/mL组、25 g/mL组、50 g/mL组、75 g/mL组，采用CCK-8法检测三叶青黄酮溶液干预0、24、48 h后各组细胞活力并计算干预48 h的半抑制浓度（IC50），筛选出三叶青黄酮溶液最佳干预浓度为 50 g/mL。取对数生长期的 KYSE150 细胞分为 0 g/mL 组、50 g/mL组，采用Transwell小室法检测三叶青黄酮溶液干预48 h后2组细胞迁移、侵袭能力，Western blot检测上皮细胞-间充质转化（EMT）相关蛋白N-cadherin、Snail、Slug蛋白表达量。取对数生长期的KYSE150细胞分为空白组、氯喹组、三叶青黄酮组、三叶青黄酮氯喹组，空白组不使用药物干预，氯喹组加入10 mol/L氯喹，三叶青黄酮组加入 50 g/mL三叶青黄酮溶液，三叶青黄酮氯喹组加入 10 mol/L氯喹与 50 g/mL三叶青黄酮溶液干预，均干预48 h后采用Western blot检测自噬相关蛋白LC3-/LC3-、p62蛋白表达量。结果 与0 g/mL组比较，各药物组随着三叶青黄酮溶液浓度的增加，KYSE150细胞活力均逐渐下降（P均0.05）；与 0 g/mL组比较，50 g/mL组KYSE150细胞迁移和侵袭数量，N-cadherin、Snail、Slug蛋白表达量均降低（P均0.05）；与空白组比较，氯喹组、三叶青黄酮组及三叶青黄酮氯喹组KYSE150细胞LC3-/LC3-、p62蛋白表达量均显著增高（P均0.05）；与氯喹组比较，三叶青黄酮氯喹组 KYSE150细胞 LC3-/LC3-、p62蛋白表达量增高更显著（P0.05）。结论 三叶青黄酮可下调N-cadherin、Snail、Slug蛋白表达量以抑制ESCC细胞的迁移和侵袭能力，上调LC3-/LC3-与p62的表达诱导自噬体的产生，从而抑制细胞自噬流，发挥对ESCC细胞活力的抑制作用。关键词：三叶青黄酮；自噬；细胞迁移侵袭；LC3-/LC3-；p62食管癌是世界上最为常见的恶性肿瘤之一，可分为食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）和食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carci-noma，ESCC），近些年来全球 90%以上的国家ESCC发病率明显超过EAC1。目前手术是ESCC的主要治疗手段，但由于ESCC发病较为隐匿，大部分就诊者已是中晚期。虽然放、化疗可提高疗效，但单药化疗的有效率低，仅 10%20%，联合药物化疗有效率也仅达 45%，且毒副作用大，因此，寻找治疗ESCC 的新方法或新靶点已成为亟待解决的问题。三叶青含有黄酮类、多糖类、酚类、有机酸类等多种药效成分，具有清热解毒、消炎镇痛、活血化痰、祛风的功效。细胞自噬是细胞将自身代谢废物“变废为宝”的一种进化行为，该行为将细胞中“废弃”蛋白或细胞器包裹形成一种双层膜结构的自噬小泡，继而与溶酶体发生融合并降解，达到循环利用的目的2。三叶青黄酮是三叶青主要的有效成分，近年来的研究表明三叶青黄酮可通过诱导细胞凋亡发挥抗多种消化系统肿瘤的作用3-5。但是否通过调控细胞自噬发挥抗 ESCC 作用，目前国内外尚未见相关的文献报道。本研究拟通过观察在三叶青黄酮作用下ESCC细胞活力、迁移和侵袭能力，上皮细胞-间充质转化（EMT）相关蛋白 N-cadherin、Snail、Slug 表达水平和自噬相关蛋白 LC3-/LC3-、p62 表达水平的变化，探讨三叶青黄酮对 ESCC 细胞迁移侵袭及自噬的影响，进一步明确三叶青黄酮抗ESCC的作用机制，从而为三叶青黄酮治疗ESCC提供新的理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1实验细胞人 ESCC 细胞株 KYSE150 细胞（以下简称 KYSE150细胞）购自中国科学院上海细胞所。1.1.2试剂三叶青黄酮（武汉天植生物有限公司）；胎牛血清、胰蛋白酶均购自美国 Gibco 公司；RPMI-1640培养基、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、二甲基亚砜（DMSO）、氯喹均购自美国 Sigma 公司；CCK-8试剂盒（美国 APExBIO 公司）；Transwell 小室、基质胶均购自美国Corning公司；BCA蛋白定量试剂盒、Western blot试剂盒均购自上海雅酶生物医药科技有限公司；RT-qPCR试剂盒（美国PROMEGA公司）。1.1.3仪器超净工作台（利康生物医疗科技控股有限公司）；CO2培养箱、热循环仪均购自美国Ther-mo公司；多功能酶标仪（上海美谷分子仪器有限公司）；倒置显微镜（德国 Leica 公司）；实时荧光 PCR扩增仪（美国 Applied Biosystems 公司）；电泳仪、化收稿日期：2022-11-20基金项目：福建省医学创新课题基金项目（2020CXB001）；福建省立医院 2020年“创双高”火石基金项目（2020HSJJ06）通信作者：黄毅，E-mail：DOI：10.13260/ki.jfjtcm.2023.0400617福建中医药第 54 卷学发光成像系统 ChemiDocXRS+均购自美国 Bio-Rad公司。1.2方法1.2.1细胞培养KYSE150 细胞贴壁培养于含10%胎牛血清的 RPMI-1640 完全培养基中，置于37、5%CO2恒温培养箱中进行培养，待细胞处于对数生长期时用于实验。1.2.2CCK-8 法检测细胞活力并筛选最佳干预浓度取对数生长期KYSE150细胞，消化并调整细胞密度为5103个/孔，每孔100 L接种于96孔板中，设置5个平行对照孔。待细胞贴壁后，将细胞分为0 g/mL 组、25 g/mL 组、50 g/mL 组、75 g/mL组。0 g/mL 组不使用药物干预，25 g/mL 组、50 g/mL组、75 g/mL组分别加入25、50、75 g/mL三叶青黄酮溶液，于培养箱中分别培养0、24、48 h，培养结束后向每孔加入10 L CCK-8溶液，将培养板置于培养箱内孵育 2 h，用酶标仪测定在 450 nm处的吸光度（OD）值。绘制细胞增殖曲线图，计算细胞存活率及干预48 h时的半抑制浓度（IC50）。细胞存活率（实验组 OD 值空白组 OD 值）/（对照组OD值空白组OD值）100%注：对照组含有细胞、培养基和CCK-8溶液；实验组含有细胞、培养基、CCK-8溶液和三叶青黄酮溶液；空白组含有培养基和CCK-8溶液1.2.3Transwell小室法检测细胞迁移、侵袭能力取对数生长期的KYSE150细胞，按5104个/mL细胞密度接种于24孔板中，每孔500 L，细胞贴壁后，将细胞分为0 g/mL组、50 g/mL组。0 g/mL组不使用药物干预，50 g/mL 组加入 50 g/mL 三叶青黄酮溶液，均干预 48 h后吸弃各孔溶液，分别进行消化。空白培养基重悬调整消化后的细胞密度为5104个/mL，将 200 L细胞悬液滴加于不含基质胶上室（迁移实验）和含基质胶上室（侵袭实验），下室加入 700 L完全培养基，放入恒温箱培育 48 h。48 h后上室固定于 4%多聚甲醛 20 min，0.1%结晶紫染色 15 min，超纯水漂洗 3 次，棉签擦拭多余液体后，倒置显微镜下观察被结晶紫染色的迁移细胞数和侵袭细胞数，并在200倍视野下拍照。1.2.4Western blot检测EMT相关蛋白N-cadherin、Snail、Slug蛋白表达量取对数生长期的KYSE150细胞，按2.5105个/mL细胞密度接种于6孔板中，每孔 2 mL，细胞贴壁后将细胞分为 0 g/mL 组、50 g/mL组。0 g/mL组不使用药物干预，50 g/mL组加入 50 g/mL 三叶青黄酮溶液，均干预 48 h后弃上清，用 PBS 清洗，收集细胞后加入蛋白裂解液，用 BCA 法进行蛋白定量。在提取的蛋白样品中分别加入 5SDS-PAGE Loading Buffer 至其终浓度为 1，置于金属水浴锅 98 10 min，使蛋白变性后，吸取蛋白加入加样孔中，以初始电压80 V进行恒压电泳，当蛋白跑至浓缩胶与分离胶交界处改用 120 V 电泳。电泳结束后，通过电转移至 PVDF膜上，转膜完毕后立即将PVDF膜置于摇床上并于含有 5%BSA 封闭液中封闭 1 h。封闭结束后，用1TBST漂洗膜3次，每次10 min。用一抗稀释液将抗体按说明书要求比例稀释，分别将剪好的 PVDF膜置于对应的抗体中孵化，置于4 冰箱过夜。一抗孵育结束后，用1TBST再漂洗膜3次，每次10 min；分别加入相对应的用二抗稀释液 1 5 000稀释的二抗，置摇床上室温孵育 1 h。孵育结束后，用 1TBST 再浸洗 3 次，每次 10 min；而后使用显影液试剂将蛋白条带放置到荧光化学发光成像仪内成像拍照。用 Image Lab 软件成像并分析，结果分别以N-cadherin/-actin、Snail/-actin、Slug/-actin 灰度比值进行相对定量分析。1.2.5Western blot检测自噬相关蛋白LC3-/LC3-、p62蛋白表达量取对数生长期的 KYSE150细胞，按2.5105个/mL细胞密度接种于6孔板中，每孔2 mL，细胞贴壁后，将细胞分为空白组、氯喹组、三叶青黄酮组、三叶青黄酮氯喹组。空白组不使用药物干预，氯喹组加入 10 mol/L 氯喹，三叶青黄酮组加入 50 g/mL 三叶青黄酮溶液，三叶青黄酮氯喹组加入 10 mol/L 氯喹与 50 g/mL 三叶青黄酮溶液干预，均干预48 h后按照“1.2.4”项下方法提取各组细胞蛋白。用Image Lab软件成像并分析，结果分别以 LC3-/LC3-、p62/-actin 灰度比值进行相对定量分析。1.2.6统计学方法采用 SPSS 23.0统计软件进行数据处理。计量资料属正态分布的以（x s）表示，2 组间比较采用两独立样本 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐，组间两两比较采用LSD-t检验；非正态分布的采用秩和检验；计数资料采用2检验。P0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.14组细胞活力比较及最佳干预浓度的筛选见图1、图2。图1结果显示：与 0 g/mL 组比较，其余各组随着三叶青黄酮溶液浓度的增加，KYSE150细胞活力均逐渐下降（P 均0.05）；图 2 结果显示：54.57 g/mL三叶青黄酮溶液干预48 h对细胞的抑制效果达半数抑制，即三叶青黄酮溶液干预KYSE150细胞48 h时的IC50为54.57 g/mL，因此选取50 g/mL作为三叶青黄酮溶液的最佳干预浓度。18殷晓庆 等：三叶青黄酮对食管鳞状细胞癌细胞迁移、侵袭及自噬的影响第 4 期2.2三叶青黄酮对 KYSE150 细胞迁移、侵袭能力的影响2.2.12 组细胞迁移数量比较见图 3。结果显示：与 0 g/mL组比较，50 g/mL组 KYSE150细胞迁移数量明显降低（P0.05）。2.2.22 组细胞侵袭数量比较见图 4。结果显示：与 0 g/mL组比较，50 g/mL组 KYSE150细胞侵袭数量明显降低（P0.05）。2.2.32 组细胞 EMT 相关蛋白 N-cadherin、Snail 和Slug蛋白表达量比较见图 5、表 1。结果显示：与0 g/mL 组比较，50 g/mL 组 N-cadherin、Snail 和Slug蛋白表达量均明显降低（P均0.05）。注：与 0 g/mL组比较，1）P0.05。图 1 不同浓度三叶青黄酮溶液对 KYSE150 细胞活力的影响图2不同浓度三叶青黄酮溶液对KYSE150细胞IC50比较注：A为0 g/mL组细胞迁移情况（200）；B为50 g/mL组细胞迁移情况（200）。与0 g/mL组比较，1）P0.05。图 3 2组细胞迁移数量比较注：A为0 g/mL组细胞侵袭情况（200）；B为50 g/mL组细胞侵袭情况（200）。与0 g/mL组比较，1）P0.05。图 4 2组细胞侵袭数量比较19福建中医药第 54 卷2.34 组细胞自噬相关蛋白 LC3-/LC3-、p62蛋白表达量比较见图6、表2。结果显示：与空白组比较，氯喹组、三叶青黄酮组及三叶青黄酮氯喹组细胞 LC3-/LC3-、p62 蛋白表达量均显著增高（P均0.05）；与氯喹组比较，三叶青黄酮氯喹组细胞 LC3-/LC3-、p62 蛋白表达量增高更显著（P均0.05）。3讨论在治疗 ESCC方面，中医药展现出越来越显著的优势，尤其与手术、放化疗等手段配合后更具有良好的增效增敏效果，例如临床上常使用的黄芪6、藤梨根7、香加皮三萜类提取物8等。三叶青是目前抗肿瘤常用的中草药之一，黄酮类成分是其主要的药理成分，近年来研究发现三叶青黄酮对诸多癌症表现出显著的抗癌活性。吴琦9体外实验研究发现：三叶青黄酮可通过调节PI3K/Akt-eNOS信号通路抑制膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。本研究结果表明：三叶青黄酮溶液可显著降低 KYSE150细胞活力，且呈现时间与剂量依赖性；并可降低 KYSE150 细胞的迁移和侵袭能力，抑制细 胞 EMT 相 关 蛋 白 N-cadherin、Snail、Slug 的 高表达。通过对细胞自噬的调节亦是药物抗肿瘤的一种重要途径。作为一种细胞内进化保守的胞质分解的降解过程，自噬是真核生物中普遍存在的一种生物现象。目前，自噬在癌症进展和抑制中的双重作用仍存在争议。研究表明肿瘤发展至晚期，因受到环境胁迫，自噬作为一种动态的降解和循环系统会促进已形成的肿瘤生长，并增强促进肿瘤的侵袭性，因此，抑制自噬可作为一种有效的癌症治疗干预策略10。LC3、p62 是参与自噬过程的重要标志性分子，其中 LC3是自噬启动的关键调控分子，当自噬形成时，胞浆型 LC3（即 LC3-）会酶解掉一小段多肽，转变为膜型LC3（即LC3-），因此，LC3-的数量会随着自噬体形成的增加而增加11-12。自噬活性的评估不仅依赖于自噬起始的测量，还依赖于自噬底物的降解；p62作为一种作用于选择性自噬的多功能蛋白，具有与LC3相关的相互作用区，在完整的自噬过程中，LC3通过与 p62的直接相互作用可导致p62的特异性降解，而肿瘤细胞由于常见自噬的缺陷，p62表达会呈现明显上调11，因此，p62 被视为自噬抑制或自噬降解缺陷的标志。研究表明自噬抑制剂氯喹可通过抑制溶酶体酸化进而抑制自噬底物降解的方式，发挥对细胞自噬流的抑制作用。本研究结果显示氯喹和三叶青黄酮溶液单独干预 KYSE150细胞均可显著提高自噬相关蛋白 LC3-/LC3-和 p62的表达量，提示三叶青黄酮可诱导 ESCC 细胞自噬体的生成，并抑制其自噬流。此外，三叶青黄酮溶液与氯喹联用组 LC3-/LC3-、p62蛋白的表达量高于这2种药物的单独使用组，表明三叶青黄酮可进一步提高氯喹对ESCC 细胞自噬流的抑制作用。综上所述，我们认为三叶青黄酮极有可能是一种有效的自噬抑制剂，通过上调 LC3-/LC3-与 p62 表达诱导细胞自噬体的生成，并通过抑制细胞自噬流的途径，发挥对 ESCC 细胞活力、迁移和侵袭能力的抑制作用。至于三叶青黄酮是通过何种信号通路抑制ESCC细胞自噬流，有待于后续进一步的深入研究。图 5 2组细胞 N-cadherin、Snail和 Slug 蛋白条带图表12组细胞N-cadherin、Snail和Slug蛋白表达量比较（x s）组别0 g/mL组50 g/mL组N-cadherin0.860.080.470.041）Snail0.740.120.350.051）Slug2.440.310.890.101）注：与0 g/mL组比较，1）P0.05。图 6 4组细胞 LC3-/LC3-、p62蛋白条带图表24组细胞 LC3-/LC3-、p62蛋白表达量比较（x s）组别空白组氯喹组三叶青黄酮组三叶青黄酮氯喹组LC3-/LC3-1.120.141.350.071）1.830.061）2.570.211）2）p627.620.428.830.161）11.231.071）12.190.621）2）注：与空白组比较，1）P0.05；与氯喹组比较，2）P0.05。（下转第32页）20福建中医药第 54 卷活血化瘀法应用的探讨 J.世界中医药，2008，1（3）：10-13.12 盛增秀.中医疫病治法的亮点及展望 J.中国中医药报，2007，10（26）：5.13 中华人民共和国国家卫生健康委员会.关于印发新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第四版）的通知EB/OL.（2020-01-27）2022-10-01.http：/ 中华人民共和国国家卫生健康委员会.关于印发新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第五版 修正版）的通知 EB/OL.（2020-02-08）2022-10-01.http：/ 中华人民共和国国家卫生健康委员会.关于印发新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）的通知 EB/OL.（2020-02-18）2022-10-01.http：/ 吕田.瘟疫条辨摘要 M.北京：中医中医药出版社，1986：56.17 朱增籍.疫证治例 M.北京：中医古籍出版社，1986：23.18 陈晓勤，秦兵.通腑泻下法对危重患者胃肠功能障碍的治疗效果评价 J.时珍国医国药，2014，25（5）：1165.19 王孟英.温热经纬 M.北京：人民卫生出版社，2005：134.20 方仁渊.倚云轩医案医话医论 M.北京：中医古籍出版社，2009：87.21 张志斌.蒋示吉 伤寒翼 温病理论研究 J.中医文献杂志，2008，26（6）：6-8.22 林佩琴.类证治裁 M.北京：中国医药科技出版社，2011：58.23 戴天章.广瘟疫论 M.北京：人民卫生出版社，1992：15.24 雷丰.时病论 M.北京：人民卫生出版社，2012：156.参考文献1ARNOLD M，SOERJOMATARAM I，FERLAY J，et al.Global in-cidence of oesophageal cancer by histological subtype in 2012 J.Gut，2015，64（3）：381-387.2GALLUZZI L，GREEN D R.Autophagy-independent functions of the autophagy machinery J.Cell，2019，177（7）：1682-1699.3WU X W，YU N，ZHANG Y P，et al.Radix Tetrastigma hemsleyani flavone exhibits antitumor activity in colorectal cancer via Wnt/-catenin signaling pathway J.Onco Targets Ther，2018，11：6437-6446.4ZHONG L R，ZHENG J X，SUN Q Q，et al.Radix Tetrastigma hemsleyani flavone inhibits proliferation，migration，and invasion of human lung carcinoma A549 cells J.Onco Targets Ther，2016，9：635-641.5ZHONG L R，YANG X H，ZHU Y P，et al.Radix Tetrastigma hemsleyani flavone suppresses cutaneous squamous cell carcinoma A431 cells via proteasome inhibition J.Med Sci Monit，2019，25：436-442.6师金凤，李海龙，王红蕾，等.黄芪及其有效成分防治消化道肿瘤的文献评价 J.西部中医药，2014，27（8）：44-46.7王涛，关徐涛，王冰，等.藤梨根提取物通过调控miR-451干预人食管鳞癌EC9706细胞的增殖 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350001,ChinaABSTRACTObjective:To explore the effects of Radix Tetrastigma hemsleyani flavone on migration,invasion and autophagy of esophageal squamous cell carcinoma(ESCC).Methods:The human ESCC cell line KYSE150 cells(hereinafter referred to as KYSE150 cells)in logarithmic growth phase were divided into 0 g/mL,25 g/mL,50 g/mL and 75 g/mL groups.The CCK-8 method was used to detect the cell viability of each group after intervention with Radix Tetrastigma hemsleyani flavone solution for 0,24,and 48 hours,and the half inhibitory concentration(IC50)of the intervention for 48 hours was calculated.The optimal intervention concentration of Radix Tetrastigma hemsleyani flavone solution was selected as 50 g/mL.The KYSE150 cells in logarithmic growth phase were divide into 0 g/mL group and 50 g/mL group.The Transwell chamber method was used to detect the cell migration and invasion ability of the two groups after 48 hours of intervention with Radix Tetrastigma hemsleyani flavone solution,and Western blot was used to detect the protein expressions of N-cadherin,Snail and Slug.The KYSE150 cells in logarithmic growth phase were divided into blank group,chloroquine group,Radix Tetrastigma hemsleyani flavone group,and Radix Tetrastigma hemsleyani flavone+chloroquine group.The blank group did not use medication intervention;the chloroquine group was added with 10 mol/L chloroquine;the Radix Tetrastigma hemsleyani flavone group added with 50 g/mL Radix Tetrastigma hemsleyani flavone solution;the Radix Tetrastigma hemsleyani flavone+chloroquine group added with 10 mol/L chloroquine and 50 g/mL Radix Tetrastigma hemsleyani flavone solution.All groups were intervened for 48 hours.Western blot was used to detect the protein expressions of LC3-/LC3-and p62.Results:Compared with the 0 g/mL group,the activity in each drug group gradually decreased with the increase of the concentration of Radix Tetrastigma hemsleyani flavone solution(P0.05).Compared with the 0 g/mL group,the numbers of migration and invasion and the protein expressions of N-cadherin,Snail and Slug in the 50 g/mL group were all reduced(P0.05).Compared with the blank group,the protein expressions of LC3-/LC3-and p62 in the chloroquine,Radix Tetrastigma hemsleyani flavone,and Radix Tetrastigma hemsleyani flavone+chloroquine groups significantly increased(P0.05).Compared with the chloroquine group,the protein expressions of LC3-/LC3-and p62 in the Radix Tetrastigma hemsleyani flavone+chloroquine group significantly increased(P0.05).Conclusion:Radix Tetrastigma hemsleyani flavone can downregulate the expression levels of N-cadherin,Snail,and Slug proteins to inhibit the migration and invasion ability of ESCC cells,and may induce the production of autophagosomes by upregulating the expression of LC3-/LC3-and p62,thereby inhibiting cell autophagy flow and exerting an inhibitory effect on ESCC cell viability.KEY WORDSRadix Tetrastigma hemsleyani flavone;autophagy;LC3-/LC3-;p62（上接第20页）32