DB51_T 3006-2023水稻对南方水稻黑条矮缩病抗性鉴定技术规程.pdf

ICS 65.020.01 CCS B 16 DB 51 四川省地方标准 DB51/T 30062023 水稻对南方水稻黑条矮缩病抗性鉴定技术规程 2023-02-07 发布 2023-04-08 实施 四川省市场监督管理局 发 布 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 试剂与设备.1 5 田间病圃鉴定.2 6 人工接种鉴定.4 7 抗性评价.6 附录 A（规范性）南方水稻黑条矮缩病毒检测技术-RT-PCR 法.7 附录 B（规范性）南方水稻黑条矮缩病品种抗性评价分级标准.10 附录 C（资料性）南方水稻黑条矮缩病品种抗性调查记载表.11 附录 D（资料性）南方水稻黑条矮缩病品种抗性田间鉴定示意图.13 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。本文件起草单位：四川省农业科学院植物保护研究所、浙江大学、全国农业技术推广服务中心、中国农业科学院植物保护研究所、广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所。本文件主要起草人：于文娟、吴建祥、郭荣、秦碧霞、姬红丽、彭云良、周雪平。本次为首次发布。水稻对南方水稻黑条矮缩病抗性鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了水稻品种（资源）抗南方水稻黑条矮缩病田间病圃鉴定和人工接种鉴定的技术方法。本文件适用于水稻品种（资源）对南方水稻黑条矮缩病的抗性鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 15794 稻飞虱测报调查规范 NY/T 2631 南方水稻黑条矮缩病测报技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 感病对照品种 TN1 susceptible control variety TN1 高感南方水稻黑条矮缩病的籼型常规水稻品种台中本地1号。3.2 感病株 susceptible strain 表现南方水稻黑条矮缩病症状的水稻植株。3.3 感病株率 susceptible plant rate 病株占调查水稻植株总数的百分率。3.4 无毒白背飞虱 non-toxic white-backed planthopper 经检测不携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱。3.5 有效鉴定株数 number of effective identification plants 分蘖盛期或拔节初期存活的参鉴水稻株数。4 试剂与设备 可调控温光的养虫室，温度保持于26 1范围内，相对湿度80%90%，光照每天12h；1000mL玻璃或透明塑料杯、网眼规格1mm的尼龙纱布、养虫架、适宜白背飞虱繁殖的水稻种子TN1等；转移白背飞虱用黑布、试管、吸虫管等。5 田间病圃鉴定 田间自然诱发鉴定 5.1 5.1.1 鉴定病圃的选择与设置 在螟虫发生较轻且白背飞虱常稳定发生地区，选择四周种植白背飞虱适生寄主且近年重发南方水稻黑条矮缩病田块，上年度水稻感病对照品种TN1在不防治条件下分蘖期病株率大于30%，抽穗黄熟期达到50%以上的田块作为田间鉴定病圃。5.1.2 鉴定病圃 5.1.2.1 分行初步筛选 将不同播期TN1秧苗充分混合移栽做保护行和诱发行，每行TN1单本移栽6株，保护行或诱发行之间预留10株参试品种空间。水稻参试品种按同样规格单本移栽于TN1保护行或诱发行之间，各品种移栽3行，每行10株，试验在秧苗和大田期均呈随机区组排列，重复3次。5.1.2.2 小区重复鉴定 各参试品种及对照均单本移栽于诱发行与保护行之间，各小区移栽12行，每行10株，试验设计同分行初步筛选。5.1.3 播种与移栽 在常年第一代白背飞虱迁入或发生高峰前7d10d播种感病对照品种TN1，每隔10d再播种一次，共播种3次4次，直至第一代白背飞虱迁入或田间白背飞虱已形成一定的种群数量。参试品种播种一次，播种时期较当地生产常规播种期晚5d10d。种子经浸泡、催芽、育苗移栽方式种植。育秧方式为湿润育秧，苗床上感病对照品种TN1撒播，参试品种分行条播，苗床首尾及每10行参试品种间隔播种一行感病对照品种TN1，播种密度为30kg40kg/667m2。播种后30d35d移栽，每品种单本移栽，株行距为15cm 18cm。5.1.4 水肥管理及病虫草防治 灌溉水与常规管理一致。秧田期较常规管理增施尿素5kg/667m2。本田管理较常规肥水管理增施尿素10kg/667m2。鉴定圃全生育期不使用抗病毒剂，二代若虫发生期之前不使用杀虫剂，在秧田和拔节初期按照常规管理方法进行病虫草害防治。5.1.5 白背飞虱虫量及带毒率调查 5.1.5.1 虫量调查 白背飞虱一代成虫发生峰期调查秧田，五点取样，分蘖盛期在本田平行跳跃取样，每块田取样3丛，按照GB/T 15794，用瓷盘拍虫法统计虫量。5.1.5.2 带毒率调查 于田间一代白背飞虱成虫发生高峰期，在每个鉴定圃，单位面积为667m2内捕捉高龄若虫或成虫500头以上，从中随机选取100头，用RT-PCR检测（参照本附录A）小批量白背飞虱或Dot-ELISA（参照NY/T 2631 附录C）检测大批量白背飞虱种群带毒率。5.1.5.3 有效传毒虫量计算 田间鉴定的有效传毒虫量用FVS表示，按式（1）计算。FVS=N PVS（1）式中：FVS 田间鉴定的有效传毒虫量，单位为头每公顷（头/hm2）；N 白背飞虱虫量，单位为头每公顷（头/hm2）；PVS 白背飞虱带毒率，单位为百分率（%）。计算结果精确到小数点后两位。当FVS值处于1.51066.0106头/hm2 范围内，方可进行下一步的病情调查。病情调查 5.2 5.2.1 调查时间和内容 5.2.1.1 拔节期调查 参试水稻品种一旦进入拔节期，逐日调查，直至所有品种进入拔节期。调查有效鉴定株数和明显矮缩不能拔节株数，参照附录C的表C.1。5.2.1.2 抽穗黄熟期调查 参试水稻品种抽穗黄熟后，逐日调查，直至所有品种均进入全穗黄熟期，调查参试水稻的存活株数和存活、死亡的病株数，参照附录C的表C.2。5.2.2 病株标准 5.2.2.1 分蘖、拔节期症状 病株分蘖增多丛生，上部数片叶的叶枕重叠，心叶破下叶叶鞘而出或从下叶枕口呈螺旋状伸出，叶片短而僵直，叶尖略有扭曲畸形。严重发病植株矮小，不能拔节；多数单株能够拔节，矮化症状明显或不明显。5.2.2.2 抽穗黄熟期症状 重病单株已矮化、死亡。轻病株全株或一个以上分蘖明显矮化常伴有高位分蘖，不能抽穗，或相对抽穗迟而小、实粒少、粒重轻，半包在叶鞘里，颖壳全部或部分变褐色，剑叶短小僵直；在中上部叶片基部可见纵向皱褶；在茎秆下部节间和节上可见蜡白色或黑褐色瘤状突起。以黄熟期初期植株有1个以上不孕、不实（结实粒少于全穗1/3）分蘖症状为感病单株判定标准。5.2.2.3 南方水稻黑条矮缩病病情级别及症状见附录 B 的表 B.2。5.2.3 相对发病率计算 抽穗黄熟期调查、计算感病对照的感病株率，若出现感病对照品种TN1的感病株率未达80%，则认定本鉴定结果不可用。抽穗黄熟期感病株率用Rif表示，数值以%计，按式（2）计算：Rif=(nif+nd)/(ntf+nd)100%（2）式中:Rif抽穗黄熟期感病株率，单位为百分率（%）；nif抽穗黄熟期感病株数，单位为株；nd分蘖期感病株且在抽穗黄熟期死亡株数，单位为株；ntf抽穗黄熟期存活总株数，单位为株。计算结果精确到小数点后两位。相对发病率Rr表示，数值以%计，按式（3）计算：Rr=Rif/Rsf 100%（3）式中:Rr抽穗黄熟期相对发病率，单位为百分率（%）；Rif抽穗黄熟期感病株率，单位为百分率（%）；Rsf抽穗黄熟期感病对照的感病株率，单位为百分率（%）；计算结果精确到小数点后两位。6 人工接种鉴定 接种用白背飞虱的准备 6.1 6.1.1 白背飞虱的采集 白背飞虱若虫或成虫自田间采集。6.1.2 无毒白背飞虱种群的获得 选取饲喂白背飞虱的水稻种子用水浸种24h后，纱布覆盖，恒温箱32 2催芽24h48 h，选取发芽良好的种子25粒30粒均匀播于盛有自然肥力土壤的内径80mm110mm塑料杯中；大约6d7d后，待苗长至1.5叶期时，将待产的单头白背飞虱移入杯中产卵，约3d后将成虫移出，单独保存，7d10d后孵化出若虫。按NY/T 2631附录C的规定对产卵的白背飞虱进行检测，筛选其中无毒白背飞虱的后代进行繁殖，每批随机取出30头50头白背飞虱进行带毒率检测，带毒率始终为0%，则该批白背飞虱为无毒白背飞虱种群。病株准备 6.2 6.2.1 病株的采集 在重病区采集表现南方水稻黑条矮缩病疑似症状的水稻植株种植在防虫网笼中的塑料桶中。6.2.2 病株检测确定 采病株叶片按照NY/T 2631附录C的规定或参考附录A进行检测，确认感染南方水稻黑条矮缩病毒则作为毒源保存，并经白背飞虱接种扩繁病株。饲毒方法 6.3 将7.2的病株种于内径100mm200mm大烧杯中,土面覆盖滤纸,将适量1龄2龄无毒白背飞虱移入其中,并用60目防虫网封口。饲毒2d后将虫移入内径80mm110mm，预先育有白背飞虱喜食品种如TN1的秧苗塑料杯中饲养，11d后，每批随机取出30头白背飞虱高龄若虫或成虫，按照NY/T 2631 附录C的规定检测白背飞虱种群带毒情况，计算白背飞虱种群的带毒率。育苗方法 6.4 参试品种，含感病对照经5.1.3方法浸种、催芽；选取30粒左右发芽良好的种子均匀播于盛有自然肥力土壤的内径80mm110mm塑料杯中。每参试品种重复3次。接种时期 6.5 水稻幼苗生长至1.5叶2叶龄期。接种方法 6.6 选取6.3已饲毒且度过循回期的白背飞虱成虫接种种群，并计算有效接种虫量，人工接种鉴定的有效接种虫量用IVS表示，数值以头/株计，按式（4）计算：IVS=NPVS（4）式中:IVS人工接种鉴定的有效接种虫量，单位为头/株；N 接种白背飞虱数量，单位为头。当IVS值处于1 2头/株范围内，方可认为试验有效。从接种种群中随机抽取50头以上虫，测定带毒率，计算接虫数量后接入已育有参试品种内径80mm110mm的塑料杯中，接种时间为2d，接种温度261，且每天上午和下午各赶虫一次，使白背飞虱分布均匀，2d后用杀虫剂将接种用白背飞虱全部扑杀，将秧苗移出塑料杯，至1530条件下培育，常规管理，定期观察植株发病情况。调查时间 6.7 接种20d后进行调查，共调查3次，每次调查间隔期不少于7d，第一次调查时同时确定有效鉴定株数。病株标准 6.8 出现秧苗叶色浓绿，叶片短小僵直，心叶扭曲或植株矮化不明显，茎秆或叶背有纵向不规则蜡白色瘤状突起，后变黑褐色症状的植物直接记为病株；出现植株矮小，叶色稍浓绿症状的植株，用Dot-ELISA（按照NY/T 2631附录C的规定）或RT-PCR检测确认（参考附录A）。相对发病率计算 6.9 若出现感病对照的平均感病株率小于30，则重复进行试验。按式（3）方法计算相对发病率。苗期感病株率用Rit表示，数值以%计，按式（5）计算：Rit=nit/ntt 100%（5）式中:Rit苗期感病株率，单位为百分率（%）；nit苗期感病株数，单位为株；ntt接种病毒的总株数，单位为株。计算结果精确到小数点后两位。7 抗性评价 抗性分级标准 7.1 田间鉴定和人工接种鉴定均根据相对发病率进行抗性评价，抗性分级标准见附录B.1。抗性评定 7.2 当品种抗性在不同地区间、不同年度间或批次间鉴定结果表现不一致时，以最差的抗性表现为准。A A 附录A （规范性）南方水稻黑条矮缩病毒检测技术-RT-PCR 法 A.1 试剂 除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器，可用1 DEPC（焦碳酸乙二酯）水处理后高压灭菌并分装。A.1.1 液氮：可保存于液氮罐或保温桶中。A.1.2 TRIzol Reagents（购于Invitrogen公司）。A.1.3 氯仿。A.1.4 异丙醇：-20预冷。A.1.5 75%酒精（DEPC水配制）。A.1.6 DEPC水：用1 DEPC处理后的去离子水，用于溶解RNA。A.1.7 琼脂糖。A.1.8 Tris 碱。A.1.9 冰乙酸。A.1.10 EDTA（0.5mol/L）。A.1.11 50 TAE配方:Tris碱242g；冰乙酸57.1ml；EDTA（0.5mol/L）100ml，定容至1000ml。A.1.12 PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit一步反转录试剂盒（购自宝生物工程（大连）有限公司）。A.1.13 DNA Marker（国产）。A.1.14 Gelred 核酸染色工作液（国产，购于上海李记生物科技有限公司）参照使用说明进行。A.2 仪器设备 A.2.1 称量天平：精度等级为0.01g。A.2.2 高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）。A.2.3 冰箱（28和-20两种）。A.2.4 微量可调移液器（2L、10L、100L、1000L）及配套带滤芯吸头。A.2.5 Eppendorf 管（0.2mL、1.5mL、2.0mL）。A.2.6 研砵。A.3 检测引物 正向引物 SRB-S10-F 5-CCACATCGCGTCATCTCAAACTAC-3 反向引物 SRB-S10-R 5-CGGTCTTACGCAACGATGAACC-3 A.4 试验操作 A.4.1 采样工具 下列采样工具必须经（121 2），15min高压灭菌并烘干：剪刀，镊子，研钵，Eppendorf管（0.2mL、1.5mL、2.0mL），吸头。A.4.2 样品采集 用剪刀剪取新鲜水稻叶片或茎秆组织，放入密闭的自封袋内（一个采样点的样品，放一个塑料袋），置于装有液氮的保温桶内，尽快运回实验室4条件下保存待检，存放不能超过7d。A.4.3 样品保存 新鲜样品若需长期保存应置于-70以下，避免反复冻融（冻融不超过3次）。A.4.4 样品处理 A.4.4.1 取水稻组织 0.1 或单头白背飞虱，放入研钵中，倒入适量液氮，以研磨棒将样本磨碎至粉末状，转移至 Eppendorf 管中。A.4.4.2 按照 0.1g 样品/1mL TRIzol reagent,加入适量 TRIzol reagent，充分混匀。A.4.4.3 每 1mL TRIzol reagent 加入 0.2mL 氯仿，盖好管盖，充分震荡 15s，室温静置 5min；12000r/min，4离心 15min。A.4.4.4 吸取A4.4.3各管中的上清液转移至新的Eppendorf 管中，切勿吸到中间层，向 Eppendorf 管中加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置 10min。A.4.4.5 12000r/min，4离心 10min，弃上清，加入 600L75乙醇，上下颠倒洗涤。A.4.4.6 12000r/min，4离心 5min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），弃上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）。A.4.4.7 4000r/min 离心 10s（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到沉淀，室温干燥 3min5min；不能过于干燥，以免 RNA 不溶。A.4.4.8 加入 10L15L DEPC 水，轻轻混匀，冰上保存备用。提取的 RNA 须在 2h 内进行 RT-PCR 扩增；若需长期保存须放置-70 冰箱。A.4.5 检测 A.4.5.1 扩增试剂准备 从试剂盒中取出相应的RT-PCR反应液，设所需RT-PCR检测总数为n，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，每个样品测试反应体系配制见表A.1。表A.1 每个样品测试反应体系 试剂 使用量 终浓度 PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 L 2 1 Step Buffer（Dye Plus）10 L 正向引物SRB-S10-F 1 L 0.4 M 反向引物SRB-S10-R 1 L 0.4 M Template RNA 1 L3 L RNase Free dH2O 补充反应体积至20 L A.4.5.2 循环条件设置 将A4.5.1中离心后的PCR管放入PCR仪内，记录样本摆放顺序。循环条件设置：第一阶段，反转录50/30min；第二阶段，预变性94/2min；第三阶段，94/30s，58/30s，72/1min，2530个循环；第四阶段：72延伸5min。A.4.5.3 电泳检测 取PCR反应液（约5L）于1%琼脂糖凝胶中电泳(120V，0.5 TAE缓冲液体系),电泳（20min30min）后，Gelred染色，在凝胶成像系统中拍照观察。A.5 结果判定 A.5.1 结果分析条件设定 根据成像结果，凝胶中根据DNA Marker标识在920bp的水平位置，如果阳性对照和检测样品均具有扩增条带，而阴性对照、空白对照均不出现该条带，则判断该样品感染南方水稻黑条矮缩病毒；如果阳性对照出现目的条带，而阴性对照、空白对照及检测样品均不出现该条带，该样品判断为未感染南方水稻黑条矮缩病毒。B B 附录B （规范性）南方水稻黑条矮缩病品种抗性评价分级标准 南方水稻黑条矮缩病品种抗性评价分级标准见表B.1。表B.1 南方水稻黑条矮缩病抗性评价分级标准 抗性级别 相对发病率%抗性水平 0级 0 免疫 1级 0.15 高抗 3级 5.115 中抗 5级 15.130 中感 7级 30.160 感病 9级 60.1 高感 南方水稻黑条矮缩病病情级别及症状见表B.2。表B.2 南方水稻黑条矮缩病病情级别及症状 病情级别 病株症状 0级 全株所有分蘖均能正常抽穗、结实，无明显矮化分蘖，感病单株数为0。1级 全株1-2个分蘖明显矮化，但全部能结实，颖壳不变色。3级 全株1-2个分蘖明显矮化，但顶部超过1/3小穗能结实。5级 全株1-2个分蘖明显矮化，顶部有小穗结实，但结实率低于1/3 7级 全株1个以上明显矮化、完全不结实分蘖或出现2个以上结实受影响、颖壳褐变分蘖。9级 全株一半以上分蘖明显矮化或全株矮化。C C 附录C （资料性）南方水稻黑条矮缩病品种抗性调查记载表 南方水稻黑条矮缩病品种抗性调查记载表分蘖拔节期见表C.1。表C.1 南方水稻黑条矮缩病品种抗性调查记载表分蘖拔节期 播种日期 调查日期 调查人 记载人 品种编号 品种名称 有效株数 感病株数 感病株率 相对发病率 病级 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 感病对照 南方水稻黑条矮缩病品种抗性调查记载表分蘖拔节期见表C.1。表C.2 南方水稻黑条矮缩病品种抗性调查记载表抽穗黄熟期 播种日期 调查日期 调查人 记载人 品种编号 品种名称 总株数 存活株数 感病株数 感病株率 相对发病率 病级 A1 A2 A3 A4 A5 A6 表 C.2 南方水稻黑条矮缩病品种抗性调查记载表抽穗黄熟期（续）品种编号 品种名称 总株数 存活株数 感病株数 感病株率 相对发病率 病级 A7 A8 A9 感病对照 D F 附录D （资料性）南方水稻黑条矮缩病品种抗性田间鉴定示意图 南方水稻黑条矮缩病品种抗性田间鉴定示意图见图D.1。TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 A1 A1 A1 A1 A1 A1 A1 A1 A1 A1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 A3 A3 A3 A3 A3 A3 A3 A3 A3 A3 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 A4 A4 A4 A4 A4 A4 A4 A4 A4 A4 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 A5 A5 A5 A5 A5 A5 A5 A5 A5 A5 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 A6 A6 A6 A6 A6 A6 A6 A6 A6 A6 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 A7 A7 A7 A7 A7 A7 A7 A7 A7 A7 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 A8 A8 A8 A8 A8 A8 A8 A8 A8 A8 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 A9 A9 A9 A9 A9 A9 A9 A9 A9 A9 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 A10 A10 A10 A10 A10 A10 A10 A10 A10 A10 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 A1 A1 A1 A1 A1 A1 A1 A1 A1 A1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 A3 A3 A3 A3 A3 A3 A3 A3 A3 A3 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 A4 A4 A4 A4 A4 A4 A4 A4 A4 A4 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 A5 A5 A5 A5 A5 A5 A5 A5 A5 A5 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 A6 A6 A6 A6 A6 A6 A6 A6 A6 A6 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 A7 A7 A7 A7 A7 A7 A7 A7 A7 A7 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 A8 A8 A8 A8 A8 A8 A8 A8 A8 A8 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 A9 A9 A9 A9 A9 A9 A9 A9 A9 A9 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 A10 A10 A10 A10 A10 A10 A10 A10 A10 A10 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 TN1 图 D.1 南方水稻黑条矮缩病品种抗性田间鉴定示意图