脱落酸(ABA)对气孔运动的影响实验教学提纲.docx

脱落酸(ABA)对气孔运动的影响实验

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ABA对拟南芥气孔运动的影响
左
【实验目的】
1. 了解气孔开闭对植物的意义。
2. 了解气孔开闭的调控机制。
3. 验证脱落酸(abscisic acid，ABA)促进气孔关闭，抑制气孔开放。
【实验原理】
气孔（stomata），叶、茎及其他植物器官上皮上许多小的开孔之一，高等陆地植物表皮所特有的结构。气孔通常多存在于植物体的地上部分，尤其是在叶表皮上，在幼茎、花瓣上也可见到，但多数沉水植物则没有。
狭义上常把保卫细胞之间形成的凸透镜状的小孔称为气孔。保卫细胞区别于表皮细胞是结构中含有叶绿体，只是体积较小，数目也较少，片层结构发育不良，但能进行光合作用合成糖类物质。有时也伴有与保卫细胞相邻的2—4个副卫细胞。把这些细胞包括在内是广义的气孔（或气孔器）。紧接气孔下面有宽的细胞间隙（气室）。气孔在碳同化、呼吸、蒸腾作用等气体代谢中，成为空气和水蒸汽的通路，其通过量是由保卫细胞的开闭作用来调节，在生理上具有重要的意义。
脱落酸（abscisic acid, ABA）是由P.F.Wareing和F.T.Addicott于1967年命名的。ABA是异戊二烯为基本单位的倍半萜羧酸，也是一种重要的植物激素,受到生物胁迫和非生物胁迫的调控,在植物对胁迫耐受性和抗性中发挥着重要作用。在胁迫条件下,ABA调控了气孔关闭和基因表达。在拟南芥、豌豆等植物的保卫细胞中ABA能够诱导H2O2和NO的产生,在胁迫条件下,二者作为信号分子调控了促进气孔的关闭的生理过程。在干旱条件下,植物体内的ABA含量增高,ABA促进了开放的气孔关闭和抑制了关闭的气孔开放,最终结果是关闭气孔,从而降低了植物水分的蒸发。

Figure 1气孔开闭的调控（S. Pandey, et al. 20007）
ABA调控气孔开度的模式为:①ABA与其保卫细胞上受体相结合;②ABA调控了保卫细胞细胞质中Ca2+浓度的增加;③胞质中Ca2+浓度的增加抑制了质膜上的H+泵;抑制了控制K+内流的通道;激活了控制Cl－外流的通道,最终导致质膜的去极性化;④质膜的去极性化激活了控制外流的通道,进一步抑制了控制K+内流的通道;⑤ABA引起了胞质中pH的升高;⑥胞质中pH的升高激活了控制K+外流的通道,抑制了质膜上的H+泵;⑦K+和Cl－由液泡进入胞质中。以上步骤的结果即是保卫细胞中K+和Cl－流出胞外,保卫细胞的膨胀程度降低,气孔关闭。
【实验材料、试剂】
拟南芥（46天）完全展开的年轻叶片、
开放缓冲液opening solution (10 mM KCl, 7.5 mM iminodiacetic acid, 10 mM Mes-KOH, pH 6.15)
闭合缓冲液closure solution (20 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM Mes-KOH, pH 6.15)
ABA酒精溶液
【操作步骤】
1、 ABA促进拟南芥气孔关闭
①在培养板上取2个孔，加入关闭缓冲液。
②拟南芥叶片下表面浸于开放缓冲液中， 置于强光下1小时，使气孔开放。
③其中一个孔加入50 mM ABA，即Close_ABA，另一个做参照，即Close_ethanol。
④置于黑暗中1小时，观察拍摄气孔，统计孔径。
2、 ABA抑制拟南芥气孔开放
①在培养板上取2个孔，加入开放缓冲液。
②拟南芥叶片下表面浸于开放缓冲液中， 置于黑暗中1小时，使气孔关闭。
③其中一个孔加入50 mM ABA，即Open_ABA，另一个做参照，即Open_ethanol。
④置于强光下1小时，观察拍摄气孔，统计孔径。
【实验结果】
ABA调控拟南芥气孔的运动，使气孔关闭，见Figure 2。

Figure 2 ABA促进拟南芥气孔关闭&ABA抑制拟南芥气孔开放
Close_ethanol, ABA促进拟南芥气孔关闭的对照组，孔径6.10μm，标准差1.47μm,
Close_ABA，实验组,孔径2.73μm,标准差1.10μm,与对照组有极显著差异，p值为1.65174E-43；
Open_ethanol, ABA抑制拟南芥气孔开放的对照组，孔径5.29μm,标准差1.31μm,
Open_ABA，实验组，孔径2.77μm,标准差0.95μm,与对照组有极显著差异，p值为2.49421E-35。
每个平均数都是102个气孔孔径的均值。
【讨论】
1、 本实验，我一共测了408个气孔的孔径。为什么是408？因为累了，不想测更多。我觉得每个处理随机选取不同视野共测定30个孔径就行，实验应平行3次。
2、 实验中气孔闭合得不完全，可能与缩短处理时间有关。

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