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CCK8的原理、优势及步骤

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· 检测原理： 
◆ Cell Counting Kit简称CCK试剂盒，是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。
◆ WST-8属于MTT的升级产品，工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。
◆ CCK法应用非常广泛，如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。
CCK方法的优势： 
◆ 表1 CCK法与其他细胞增殖/毒性检测方法的优势比较
检测方法
MTT法
XTT法
WST-1法
CCK法
甲臜产物的水溶性
差（需加有机溶剂溶解再检测）
好
好
好
产品性状
粉末
2瓶溶液
溶液
1瓶溶液
使用方法
配成溶液后使用
现配现用
即开即用
即开即用
检测灵敏度
高
很高
很高
高
检测时间
较长
较短
较短
最短
检测波长
560-600nm
420-480nm
420-480nm
430-490nm
细胞毒性
高，细胞形态完全消失
很低，细胞形态不变
很低，细胞形态不变
很低，细胞形态不变
试剂稳定性
一般
较差
一般
很好
批量样品检测
可以
非常适合
非常适合
非常适合
便捷程度
一般
便捷
便捷
非常便捷
◆ 酚红和血清对CCK法的检测不会造成干扰；
◆ 细胞毒性非常低，因此加入WST-8显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读数从而找到最佳测定时间。
CCK法的操作步骤（更多内容请见说明书）：
实验一：细胞活性检测
1、在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（37℃,5% CO2）。
2、向每孔加入10 μL CCK溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。
3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
5、若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
实验二：细胞增殖-毒性检测
1、在96孔板中配置100μL的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时（37℃，5% CO2）。
2、向培养板加入10μL不同浓度的待测物质。
3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。
4、向每孔加入10μL CCK溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。
5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
7、若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
活力计算：
细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100
A（加药）：具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度
A（0加药）：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力
保存条件：
4℃避光保存一年有效，-20℃避光保存两年有效。

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