叶绿体DNA的提取-微藻讲课讲稿.doc

叶绿体DNA的提取-微藻

精品文档
叶绿体DNA的提取（参考杜氏盐藻）
1、材料：扁藻
2、培养基配方：
3、仪器：超速离心机 细胞破碎仪
4、用于细胞破碎和叶绿体分离的缓冲液：
溶液1：0.33 mol/L山梨糖醇Sorbitol，50m mol/L Hepes, 2m mol/LEDTA, 1m mol/L MnCl2, 2m mol/L DTT,体积分数0.5%BSA，Leupeptin 1mg/L
溶液2（45%蔗糖加离心缓冲液）：45g/L蔗糖，0.33mol/L Sorbitol，50m mol/L Hepes
溶液3（60%蔗糖加离心缓冲液）：60g/L蔗糖，0.33mol/L Sorbitol，50m mol/L Hepes
溶液4（叶绿体洗涤缓冲液）：0.33mol/L Sorbitol，25m mol/L Hepes
以上缓冲液均用KOH调pH至7.5
溶液5： 50m mol/L Tris-HCl，100 m mol/L EDTA，pH8.0

5、完整叶绿体的分离（所有操作均在4℃进行）
1）将培养10d左右达对数生长后期的250ml藻液，离心收集藻体，液氮充分研磨后，将上述藻体细胞用20ml冰预冷的溶液1充分缓慢的悬浮于50ml离心管，制成（粗体液）。
3）将粗体液于1000g离心30s，弃上清。
4） 再次用10ml冰预冷的溶液1充分缓慢悬浮，悬浮液平均铺满于6个10 mL HITACHI CPIO0专用离心管上层，每个离心管最下层铺有冰预冷的3 mL溶液3，其上铺有冰预冷的3 mL溶液2形成梯度。
5）4℃,40 000 g离心3h，完整的叶绿体集中在梯度之间，将此层小心吸至10 mL离心管(约2 mL)
6）加入4倍体积的冰预冷的溶液4，3 000 g离心5min以除去多余的蔗糖，重复此步骤1次。
7）将沉淀悬浮于3 mL溶液4作为完整叶绿体制品，置于4 ℃备用。
6、cpDNA的提取及鉴定
l）在得到的新鲜完整叶绿体制品中，加入终浓度分别为150μg/l和13mmol/l的DNase I和MgCl2，并于冰上静置2h以去除来自核DNA的潜在污染
2）4℃,1 000 g离心1 min，收集叶绿体沉淀
3）将叶绿体沉淀悬浮于500μl 溶液5，加入终浓度为2%的SDS (初始浓度为20%的SDS加55μl) 和终浓度为100μg/ml的蛋白酶K（初始浓度为20mg/ml，加2.7μl），55℃水浴3h；
4）、加入等体积的饱和酚(pH8.0)，轻轻混合均匀，于4℃，12000rpm离心10-15min
5）小心移取上清于新的灭菌EP管，后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀，于4℃，12000rpm离心10-15min；
6） 小心移取上清于另一离心管，加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），上下颠倒混合均匀，于4℃，12000rpm离心10-15min；
7） 移取上清，加1/10体积的3M NaAC和二倍体积预冷的无水乙醇（-20℃），于-20℃冰箱中沉淀过夜或-80℃沉淀1h；
8） 4℃，10000rpm离心15min，弃上清；
9） 加入70%酒精，10000rpm离心10分钟，洗涤沉淀两次；
10） 将沉淀于室温放置，直至无酒精气味，加30-50μlTE缓冲液或RNase-free水溶解沉淀
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