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ICS 65.020 B 01 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 38942020 大白菜芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒检测技术规程 Detection and identification of turnip mosaic virus and cucumber mosaic virus in Chinese cabbage 2020-03-31 发布 2020-05-01 实施 山东省市场监督管理局 发 布 前 言 本标准按GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：吴斌、辛相启、王升吉、姜珊珊、张眉、辛志梅。大白菜芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒检测技术规程 1 范围 本标准规定了大白菜中芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒的间接ELISA、Dot-ELISA和普通RT-PCR检测方法。本标准适用于山东省芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒在传播介体蚜虫和大白菜中的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 样品采集与保存 3.1 蚜虫样品采集 在蚜虫盛发初期进行蚜虫样品采集，于白菜田、周边蔬菜田或田间杂草丛等蚜虫喜好栖息环境，采用直径33cm的35目纱网在田间随机进行扫扑，分拣装入试剂瓶中，100%乙醇浸泡，-20以下冰箱保存备用。3.2 叶片样品采集 采集表现TuMV和CMV花叶、皱缩、植株矮化、畸形等典型症状的大白菜叶片5g10g，单株样品袋存放。样品采集后，在冷藏条件下（2 C8 C）运送至实验室。如果样品在2天内检测，可暂时储存于2 C8 C冷藏箱；如果样品在2天以后检测，保存至-80超低温冰箱备用，样品避免反复冻融。4 主要仪器设备、用具和试剂 4.1 仪器设备 仪器设备主要有：a)酶标仪；b)洗板机；c)电子天平（感量 0.001g）；d)PCR 仪；e)电泳仪；f)水平电泳槽；g)凝胶成像仪；h)高速冷冻离心机；i)水浴锅；j)样品冷藏柜；k)低温冰箱（-20 C）；l)超低温冰箱（-80 C）；m)磁力搅拌器；n)高压灭菌锅；o)可调微量移液器（10L、100L、200L、1000L）。4.2 用具 用具主要有：a)无 RNase 吸头（10L、100L、200L、1000L）；b)酶标板；c)硝酸纤维素膜（NC 膜）；d)无 RNase 离心管；e)PCR 反应管；f)研钵；g)样品袋；h)标签；i)镊子。4.3 主要试剂 TuMV抗体、CMV抗体、酶标二抗、TuMV特异性引物、CMV特异性引物、Trizol、液氮、三氯甲烷、异丙醇、乙醇、M-MLV RT反转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶、DNA分子标记、Gelred、琼脂糖等。除特殊说明外，所有实验用试剂级别均为分析纯级。试验用水为无菌超纯水或去离子水，均符合GB/T 6682-2008。血清学和分子生物学检测试剂配制见附录A。5 检测 5.1 方法提要 芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒的血清学特性与分子生物学特性是该病毒检测方法的主要依据。两种病毒都具有很强的免疫原性，同时都是RNA病毒，因此可利用间接ELISA、Dot-ELISA和RT-PCR方法确定样品中是否带有上述两种病毒。5.2 间接酶联免疫吸附测定 5.2.1 样品制备 将单头蚜虫置于小型离心管内，加300L包被缓冲液研碎，4 C冰箱放置12h16h；称取待测植株样品0.1g以上，按1：10（质量：体积）加入包被缓冲液，用研钵研磨成浆，4 C冰箱放置4h5h。将两类研磨液8000r/min离心3min，上清液即为制备好的检测样品。设阴性对照和阳性对照，阴性对照样品为试验室保存的未感染病毒的健康大白菜叶片，阳性样品为试验室保存的感染TuMV或CMV的标准样品，阴性样品及阳性样品皆通过RT-PCR检测及测序验证。阴性对照、阳性对照作相同的处理，样品提取缓冲液作空白对照。5.2.2 加样 在酶标板上加入制备好的待检测样品、阴性对照、阳性对照、空白对照，每个样品平行加到两个孔中，每孔加样100L，加盖，4 C冰箱孵育12h16h。5.2.3 洗板 孵育结束后，用PBST清洗酶标板3次5次。每孔每次加PBST洗液700L，每次停留1min2 min。5.2.4 加抗血清 用抗体稀释缓冲液按照相应病毒抗血清的使用浓度进行稀释，每孔加入稀释好的抗体液100L，加盖，37 C孵育1.5h。5.2.5 洗板 同5.2.3。5.2.6 加酶标抗体 用抗体稀释缓冲液将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入到酶联板中，100L/孔，加盖，37 C孵育1.5 h。5.2.7 洗板 同5.2.3。5.2.8 加底物缓冲液 将现配的底物缓冲液按100L/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育1h。5.2.8.1 读数 每孔加100 L3 mol/L NaOH终止剂终止反应，用酶标仪在405nm波长下测定各孔的吸光值（OD405）。5.3 斑点酶联免疫吸附测定 5.3.1 NC 膜制备 剪裁7cm 7cm大小的NC膜，用铅笔在保护纸外划成7mm 7mm大小的方格，划好后去掉保护纸备用。5.3.2 样品制备 将单头蚜虫置于小型离心管内，加300 LPBS磷酸盐缓冲液研碎；称取待测植株样品0.1g以上，按1：10（质量：体积）加入PBS磷酸盐缓冲液，用研钵研磨成浆。将两类研磨液8000r/min离心3min，上清液即为制备好的检测样品。设阴性对照和阳性对照，阴性对照样品为试验室保存的未感染病毒的健康大白菜叶片，阳性样品为试验室保存的感染TuMV或CMV的标准样品，阴性样品及阳性样品皆通过RT-PCR检测及测序验证。阴性对照、阳性对照作相同的处理，样品提取缓冲液作空白对照。5.3.3 加样 分别取2L制备好的待检测样品、阴性对照、阳性对照、空白对照，点到NC膜的相应格子中，室温干燥10min。每个样品平行在膜上重复一次。5.3.4 封闭 在平皿（F9cm）中加入20mL封闭液，并将干燥好的NC膜浸入，室温下封闭30min。5.3.5 加抗血清 用封闭液按照相应病毒抗血清的工作浓度进行稀释，并将NC膜浸入，室温孵育30min60min。5.3.6 洗膜 将平皿中抗体液倒出，加入PBST 20mL洗膜3次4次，每次3min。5.3.7 加酶标抗体 用抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并将NC膜浸入，室温孵育30min60min。5.3.8 洗膜 同5.3.6。5.3.9 显色 显色底物NBT 66L和BCIP 33L加到10mL底物缓冲液中混匀，洗好的膜用滤纸吸干后放入底物显色液中反应，待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时终止反应（显色5min20min），即在蒸馏水中漂洗，肉眼观察并记录结果。5.4 逆转录-聚合酶链式反应检测 5.4.1 总 RNA 提取 取单头蚜虫或称取0.1g植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移入灭菌的无RNase 1.5mL离心管中，加人1mL的Trizol试剂，剧烈振荡摇匀，室温静置5 min；4 C，12000g离心10min，取上清液；加入200L三氯甲烷，上下颠倒混匀，室温静止15min；4 C，12000g离心10min，取上层水相移入新的离心管中；加等体积的异丙醇（约600L），轻柔颠倒混匀，室温放置15min；4 C，12000g离心10min，小心弃上清液；加1mL预冷的75%的乙醇洗涤沉淀，4 C，7500g离心5min，弃乙醇；沉淀于室温下干燥5min10min，溶于30L无RNase的ddH2O，轻弹管壁使之溶解，-80 C保存备用。设阴性对照和阳性对照，阴性对照样品为试验室保存的未感染病毒的健康大白菜叶片，阳性样品为试验室保存的感染TuMV或CMV的标准样品，阴性样品及阳性样品皆通过RT-PCR检测及测序验证，用超纯水作空白对照。阴性对照、阳性对照作相应的处理。5.4.2 引物合成 委托引物合成公司进行引物合成，引物配制成10mol/L储存液备用，引物序列见表1。表1 检测引物序列 检测病毒 引物名称及序列 扩增片段大小 芜菁花叶病毒 TuMV-F:5-GTAACCAAGACCGACCATAC-3 228bp TuMV-R:5-TATGCCTCTCCGTGTTCT-3 黄瓜花叶病毒 CMV-F:5-AACCACCCAACCTTTGTAG-3 460bp CMV-R:5-GCTCGACGTCAACATGAA-3 5.4.3 逆转录 逆转录总体积为20L。在无RNase的PCR管中依次加入3L待检测RNA，1L相应病毒下游扩增引物（20M），8L无RNase的ddH2O，在65 C恒温水浴，放置5 min后迅速置于冰上5min。再向PCR管中加入M-MLV RT（200U/L）1 L、RNasin（40U/L）1L、5 RT缓冲液4L、dNTP（10mmol/L）2L，混匀，置于PCR仪中42 C反应1h，70 C反应5min。同样处理阳性对照、阴性对照和空白对照，合成的cDNA置于-20 C以下冰箱中保存备用。5.4.4 PCR 扩增 依次在灭菌的PCR管中加入ddH2O 14.8L、10 PCR缓冲液2.5L、MgCl2（25mmol/L）2.5L、dNTP（10mmol/L）2L、10pmol/L上游引物1L、10pmol/L下游引物1L、Taq酶（5U/L）0.2L、cDNA模板1L，混匀。置于PCR仪中，设置反应程序95 C 5min，95 C 30s，56 C 30s，72 C 1min，35个循环后72 C 10min，4 CPCR仪中保存。5.4.5 琼脂糖凝胶电泳检测 制备1%的琼脂糖凝胶。取上述PCR产物10L，加入1L上样缓冲液，混匀后移入胶孔，并在样品孔一侧加入DNA分子量标记，120V电压下电泳30min。电泳结束后，在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性条带，并与阳性对照比较，拍摄并记录。6 结果判定及表述 6.1 结果判定 6.1.1 间接酶联免疫吸附测定 6.1.1.1 对照孔的 OD405值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：a)缓冲液孔和阴性对照孔的 OD405值2；d)孔的重复性基本一致。以上同时具备则本批次检测有效，否则判定本批次检测无效，需重新检测。6.1.1.2 在满足了质量控制要求后，结果原则上可判断如下：a)样品 OD405值/阴性对照 OD405值2，判为阳性；b)样品 OD405值/阴性对照 OD405值=2，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法验证；c)样品 OD405值/阴性对照 OD4052，判为阴性。6.1.2 斑点酶联免疫吸附测定 肉眼观察，阳性对照应出现棕红色或深褐色圆形斑点，阴性对照应无显色斑点。对照成立的情况下，肉眼观察各个被检测样品，凡出现棕红色或深褐色圆形斑点者判为阳性，与阴性对照相同不出现可见斑点者判为阴性，介于两者之间判为可疑，需重新做一次，或用其他方法验证。重复孔结果不一致时，视此次结果无效，需进行重新验证。6.1.3 逆转录-聚合酶链式反应 根据阳性对照、阴性对照和空白对照的电泳图表现判断检测是否有效，如无效时，则需重新检测。如果阴性对照和空白对照正确，待测样品出现与阳性对照一致的所测病毒的扩增条带，判定结果为阳性。阳性对照、阴性对照和空白对照正确，且样品无扩增条带，判定结果为阴性。6.2 结果表述 检测结果表述如下：a)检出芜菁花叶病毒或未检出芜菁花叶病毒；b)检出黄瓜花叶病毒或未检出黄瓜花叶病毒。A A 附 录 A（规范性附录）试剂配制 A.1 间接酶联免疫吸附测定 A.1.1 包被缓冲液（pH9.6）碳酸钠（Na2CO3）1.59g，碳酸氢钠（NaHCO3）2.93g，溶解于900mL蒸馏水中，用盐酸调节pH至9.6，用蒸馏水定容至1000mL。A.1.2 PBST缓冲液（pH7.4）氯化钠（NaCl）8.0g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g，磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.15g，氯化钾（KCl）0.2g，0.5mL Tween-20，溶解于900mL蒸馏水中，用盐酸调节pH至7.4，蒸馏水定容至1000mL。A.1.3 抗体缓冲液 PVP（MW 244000）（聚乙烯吡络烷酮）2g，脱脂奶粉1g，溶解于100mL PBST中。A.1.4 底物稀释缓冲液（pH9.8）二乙醇胺9.7mL，氯化镁（MgCl2）0.01g，溶解于80mL蒸馏水中，用盐酸调节pH至9.8，用蒸馏水定容至100mL。A.1.5 底物溶液（现配先用）1mg PNPP（对-硝基苯磷酸二钠）溶于1mL底物缓冲液中。A.1.6 抗血清 病毒特异性抗体。A.1.7 酶标抗体 碱性磷酸酶标记抗体。A.2 斑点酶联免疫吸附测定 A.2.1 PBS磷酸盐缓冲液（pH7.2）氯化钠（NaCl）8.0g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g，磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.15 g，氯化钾（KCl）0.2g，溶解于900mL蒸馏水中，用盐酸调节pH至7.2，蒸馏水定容至1000mL。A.2.2 PBST缓冲液（pH7.4）氯化钠（NaCl）8.0g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g，磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.15g，氯化钾（KCl）0.2g，0.5mL Tween-20，溶解于900mL蒸馏水中，用盐酸调节pH至7.4，蒸馏水定容至1000mL。A.2.3 封闭液 取脱脂奶粉5g加入到100mL PBST，充分溶解，4 C保存。A.2.4 底物稀释缓冲液（pH9.5）Tris Cl 12.11g，氯化镁（MgCl2）2.38g，氯化钠（NaCl）5.85g，溶解于900mL蒸馏水中，用氢氧化钠调节pH至9.5，用蒸馏水定容至1000mL。A.2.5 底物溶液（现配先用）BCIP(5 0mg/mL)溶于100%二甲基甲酰胺；NBT(50mg/mLl)溶于70%二甲基甲酰胺。每5 mL 底物稀释缓冲液中先加入33L的NBT，混匀后再加入16.5L的BCIP，该试剂配制好后，应在1h内使用。A.2.6 抗血清 病毒特异性抗体。A.2.7 酶标抗体 碱性磷酸酶标记抗体，为病毒特异性抗体的抗体。A.3 逆转录-聚合酶链式反应 A.3.1 50 TAE Tris Cl 242g，冰乙酸52.1mL，Na2EDTA 2H2O 37.2g，溶解于900mL蒸馏水中，蒸馏水定容至1000mL。使用时加水稀释至1 TAE。A.3.2 上样缓冲液 0.05%溴酚蓝，0.9%SDS，50%甘油水溶液。_