健脾通络方对结直肠癌细胞侵袭迁移的影响及机制研究_黄人可.pdf

39国际消化病杂志 2023 年 2 月第 43 卷第 1 期 Int J Dig Dis，February 25，2023，Vol.43，No.1 论著 健脾通络方对结直肠癌细胞侵袭迁移的影响及 机制研究黄人可 任建琳 靖 琳 吴杏黎 刘湘君 刘 怡 储金砚【摘要】目的 探究健脾通络方对结直肠癌细胞侵袭、迁移的影响及机制。方法 构建敲减 MALAT1 基因的 HCT116 细胞模型。采用细胞划痕实验和 Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力。采用蛋白质印迹法检测经健脾通络方干预后的MALAT1 正常/敲减表达的 HCT116 细胞中 Wnt3a、-catenin 蛋白水平。采用实时荧光定量 PCR 法检测 MALAT1 的表达水平。构建裸鼠肺转移模型，采用小动物活体成像技术监测肿瘤转移情况，并检测转移灶中 Wnt3a、-catenin 和 MALAT1 的表达水平。结果 经健脾通络方干预后，HCT116 细胞中 MALAT1、Wnt3a 和-catenin的表达水平均降低，HCT116 细胞迁移能力下降。在裸鼠肺转移模型中，经健脾通络方干预后裸鼠的转移灶减少，转移灶中 Wnt3a、-catenin 和 MALAT1 的表达水平均降低。结论 健脾通络方通过下调HCT116细胞中MALAT1的表达，使Wnt/-catenin信号通路中 Wnt3a、-catenin 的蛋白表达水平降低，从而抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。【关键词】结直肠癌；侵袭；迁移；MALAT1；Wnt/-catenin 信号通路DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2022.06.009Effect of Jianpi Tongluo Decoction on invasion and migration of colorectal cancer cells and its mechanism HUANG Renke,REN Jianlin,JING Lin,WU Xingli,LIU Xiangjun,LIU Yi,CHU Jinyan.Department of Oncology,Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200071,China【Abstract】Objective An attempt is made in this paper to investigate the effect and mechanism of Jianpi Tongluo Decoction on invasion and migration of colorectal cancer cells.Methods The MALAT1 knockdown HCT116 cell model was constructed.Cell scratch test and Transwell test were conducted to detect cell invasion and migration.Western blotting was conducted to detect Wnt3a and-catenin protein levels in HCT116 cells with normal/knockdown expression of MALAT1 after treatment with Jianpi Tongluo Decoction.The expression of MALAT1 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.The lung metastasis model of nude mice was established,and the tumor metastasis was monitored by utilizing the small animal in vivo imaging technology.The expressions of Wnt3a,-catenin,and MALAT1 in metastatic lesions were detected.Results The expressions of MALAT1,Wnt3a,and-catenin in HCT116 cells are decreased after treatment with Jianpi Tongluo Decoction,and the migration ability of HCT116 cells is decreased.In the lung metastasis model of nude mice,the metastatic lesions of the nude mice treated with Jianpi Tongluo Decoction are reduced,and the expressions of Wnt3a,-catenin,and MALAT1 in the metastatic lesions are decreased.Conclusion Jianpi Tongluo Decoction inhibits the proliferation,invasion,基金项目：国家自然科学基金面上项目（81873279、82174452、81473628）；上海市科委科技支撑“中药新药临床前研究”项目（22S21901000）；上海申康医院发展中心“临床三年行动计划”疑难疾病精准诊治攻关项目（SHDC2020CR2047B）；上海市中医医院中医药传承院级名中医人才培育-院级名中医（WLJH2021ZY-MZY026）作者单位：200071 上海中医药大学附属市中医医院肿瘤科通信作者：任建琳，Email:40国际消化病杂志 2023 年 2 月第 43 卷第 1 期 Int J Dig Dis，February 25，2023，Vol.43，No.1and migration of colorectal cancer cells by down-regulating the expression of MALAT1 in HCT116 cells and mediating the reduction of Wnt3a and-catenin protein expression in Wnt/-catenin signaling pathway.【Key words】Colorectal cancer;Invasion;Metastasis;MALAT1;Wnt/-catenin signaling pathway结直肠癌是常见的消化道肿瘤，根据 2022年国家癌症中心发布的全国癌症数据统计显示，2016 年中国结直肠癌新发病率为 40.8/10 万，病死率为 19.6/10 万，均呈上升趋势1。结直肠癌起病隐匿，约 61.8%的患者确诊时疾病已进展至中晚期，患者 5 年总生存率仅为 10.5%2-3。MALAT1 是一种与肿瘤相关的长链非编码 RNA（lncRNA），最初被确定为非小细胞肺癌转移的重要标志物4。MALAT1 的高表达提示肿瘤患者预后不良，研究发现 MALAT1 参与了肿瘤细胞迁移相关基因的调节5。本课题组的前期研究结果表明，MALAT1 在结肠癌组织中的相对表达量是癌旁组织的 2.22 倍，并且 MALAT1 在结直肠癌转移灶中的表达水平明显高于原发灶6。中医药是恶性肿瘤的重要辅助治疗方式。在临床上，湿热和脾虚是结直肠癌的常见证型7，结直肠癌各个阶段贯穿着脾虚证，脾虚证与结直肠癌的进展有着密切关系。本课题组的前期研究结果表明，健脾为主的扶正中药可延长结直肠癌术后总生存期、晚期结直肠癌总生存期及无病生存期8-9。健脾通络方是基于络病理论针对中晚期结直肠癌的临床经验方。本研究拟通过检测健脾通络方对结直肠癌细胞侵袭、迁移的影响，探索其对结直肠癌的疗效及相关机制。1 材料与方法1.1 实验材料BALB/c 免疫缺陷裸鼠 40 只，雄性，4 周龄，体质量为 1315 g，均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司 合格证号 SYXK（沪）2014-0008。人结肠癌上皮细胞株 HCT116 细胞由中国科学院细胞库提供。lncRNA MALAT1 敲减慢病毒购自吉满生物科技（上海）有限公司，货号 GM-CS-121969；异氟烷购自美国 Baxter Healthcare Corporation 公司，货号 CN2L9100；D-萤光素钾盐购自上海睿铂赛生物科技有限公司，货号 12507。本实验所用仪器包括 Applied Biosystems VeritiPro PCR 仪（购自美国Thermo Scientific 公 司）、ChemiDocTM XRSSystem with Image LabTM Software 型 Image Lab 影像采集系统（购 自 美 国 Bio-Rad 公 司）和 Ami HT/HTX 小动物冷光荧光活体影像系统（购自美国 Spectral Instrument Imaging 公司）。健脾通络方由生黄芪30 g、苦参15 g、党参15 g、炒白术 15 g、白茯苓 15 g、炒薏苡仁 15 g、白花蛇舌草 30 g、天龙 3 g、蜈蚣 3 g、甘草 6 g 组成，累计给药剂量为 195.3 g/kg。上述中药材取自上海市中医医院中药房。根据课题组前期实验结果，健脾通络方给药剂量为 20 mg/mL。中药饮片通过醇提的方法进行浓缩提取，调整质量浓度为 1 g/mL，在超净台中使用 0.22 m 规格的过滤器过滤除菌后使用。1.2 敲减细胞模型构建与细胞培养使用慢病毒转染 HCT116 细胞构建 MALAT1敲减表达模型。将 HCT116 细胞消化后接种至 12孔板中（密度为每孔 2105个细胞），按 MOI100 稀释病毒原液，将含有慢病毒液的培养基加入 HCT116 细胞中。在感染 16 h 后，将含有慢病毒的培养液更换为 1 mL 完全培养基。经药筛待细胞稳定后，使用 RPMI-164010%胎牛血清1%青链霉素双抗15 g/mL Blasticidin 完全培养基维持细胞。将 MALAT1 正常表达的 HCT116 细胞设为HCT116-NC 组，将 MALAT1 敲 减 表 达 的 HCT116细胞设为 HCT116-KD 组。将 MALAT1 敲减表达的HCT116 细胞与 MALAT1 正常表达的 HCT116 细胞上清液共培养，设为 HCT116-KDNC-exo 组；将MALAT1 正常表达的 HCT116 细胞与 MALAT1 敲减表达的 HCT116 细胞上清液共培养，设为 HCT116-NCKD-exo 组；2 组共培养时间均为 24 h。1.3 检测项目与方法1.3.1 HCT116 细胞增殖情况 使用 CCK-8 试剂盒检测HCT116细胞增殖情况。灭菌96孔板每孔注入 100 L生长良好的HCT116细胞（密度为5.5104个/mL），置于 37、5%CO2无菌恒温培养箱中；10 h 后弃去旧液，更换为含 1%胎牛血清的培养液，继续培养 24 h 后，分别给予上述细胞不同质量浓度的健脾通络方（0、30、60、90、120、150、180 mg/mL）干预，每组设立 3 个复孔。培养 24 h 后，吸弃旧液，加入 90 L RPMI-1640 无血清培养基和 10 L CCK-8 溶液，继续培养 2 h 后，使用酶联检测仪（双波长 490 nm/630 nm）检测光密度（OD）值，统计41国际消化病杂志 2023 年 2 月第 43 卷第 1 期 Int J Dig Dis，February 25，2023，Vol.43，No.1细胞生长抑制率。计算公式：细胞生长抑制率1A（加药）A（空白）/A（0加药）A（空白）100%；A（加药）指具有细胞、CCK-8 溶液和药物溶液的孔的吸光度，A（空白）指具有培养基和 CCK-8 溶液而没有细胞的孔的吸光度，A（0 加药）指具有细胞、CCK-8 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。之后，根据细胞生长抑制率在 50%左右，确定健脾通络方的质量浓度范围，并将细胞分为5 组（健脾通络方的质量浓度分别为 30、40、50、60、70 mg/mL）进行实验。1.3.2 HCT116 细胞迁移情况 采用细胞划痕实验检测 HCT116-KDNC-exo 组、HCT116-NCKD-exo 组、经健脾通络方干预后 MALAT1 正常/敲减表达的 HCT116 细胞（分别设为 HCT116-NCJPTL 组、HCT116-KDJPTL 组）的 细 胞 迁 移 数 量。将 覆盖率达到培养瓶 80%90%的细胞消化后接种至 12 孔板中，每孔补充完全培养基 1 mL。第 2 天进行观察，待 12 孔板内细胞覆盖至 80%90%时即可进行划痕实验。弃去旧培养基，对照组加入无血清不完全培养基，用 200 L 的灭菌加样枪头在12 孔板中央轻轻划线，避免贴壁细胞脱落，使用显微镜进行拍摄并统计。应用ImageJ软件处理数据，总愈合率愈合面积/初始面积 100%。1.3.3 HCT116 细胞侵袭情况 采用 Transwell 法检测各组细胞的侵袭能力。使用包被后的 Transwell小室进行实验。使用 MALAT1 正常/敲减表达的HCT116 细胞进行实验，检测共培养后的 HCT116细胞，以及经健脾通络方干预后的细胞的侵袭能力。培养细胞，将覆盖率达 80%以上的细胞上清弃去，换成无血清不完全培养基培育 12 h。将消化后的细胞调整密度为 5105个/mL，分为对照组和共培养组（培养方法同 1.3.2）。将 100 L 细胞悬液加入上室，对照组下层加入含有10%胎牛血清的培养基，共培养组中 MALAT1 正常表达的 HCT116 细胞下室中加入 MALAT1 敲减表达的 HCT116 细胞上清液，MALAT1 敲减表达的 HCT116 细胞下室中加入MALAT1正常表达的HCT116细胞上清液进行实验。使用 0.4%结晶紫染色 30 min，在 10 物镜和 10目镜下拍摄细胞，随机选取 5 个镜下计数，计算其平均数。1.3.4 人结直肠癌 HCT116 细胞 MALAT1 表达情况 采用实时荧光定量 PCR 法检测 HCT116-KDNC-exo 组、HCT116-NCKD-exo 组、HCT116-NC JPTL 组、HCT116-KDJPTL 组 MALAT1 的 表 达水平。使用 TRIzol 试剂分别提取各组的 RNA，每管统一定量为 2 g，反转录合成 cDNA，保存于-20 冰箱中。PCR 反应条件：95 30 s，循环 1 次；95 5 s，60 34 s，循环40次。以GAPDH作为内参，根据得到的 Cq 值计算 MALAT1 的相对表达量。1.3.5 人结直肠癌 HCT116 细胞中 Wnt3a、-catenin蛋白表达情况 采用蛋白质印迹法检测各组细胞中 Wnt3a、-catenin 蛋白的表达水平。从细胞或组织样本中提取总蛋白，使用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量。将蛋白质样品调整为统一浓度后煮沸定性，保存于-20 中。将蛋白上样后进行电泳，将蛋白转移至凝胶中，通过电泳将凝胶中的蛋白质印迹到 PVDF 膜上。膜在 4 环境中孵育，加入一抗过夜，使用 PBST 洗膜 3 次，每次 10 min，然后加入二抗，37 孵育 2 h。使用超敏 ECL 化学发光试剂盒进行显影。应用 ImageJ 软件对样本条带进行灰度值分析。1.4 动物实验检测细胞侵袭迁移情况采用尾静脉注射 MALAT1 正常/敲减表达的HCT116 细胞构建裸鼠肺转移模型，注射 MALAT1敲减表达的 HCT116 细胞设为 HCT116 细胞敲减组，使用健脾通络方干预的、注射正常表达的 HCT116细胞设为健脾通络方干预组。接种后 28 d，使用小动物活体成像仪进行成像实验，应用成像软件直接测得光子数从而观察裸鼠肿瘤转移情况。检测后将裸鼠脱颈处死，取其转移灶，使用生理盐水漂洗后，同组别均分装入含有 4%多聚甲醛固定液的 EP 管及冻存管中，冻存管转入液氮罐中保存，用于后续实验。转移灶组织经包埋后切片，通过病理组织学检测观察裸鼠转移灶中的肿瘤组织，采用免疫组织化学法检测转移灶中 Wnt3a、-catenin蛋白的表达情况。1.5 统计学方法应用 GraphPad Prism 9 和 SPSS 26.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数 标准差（xs）表示，组间比较采用单因素方差分析。P0.05 表示差异有统计学意义。2 结果2.1 MALAT1 对 HCT116 细胞侵袭迁移的影响2.1.1 MALAT1 敲 减 表 达 的 HCT116 细 胞 株 构建 实时荧光定量 PCR 结果显示，HCT116-NC 组中 MALAT1 的相对表达量为 0.9010.010，显著高42国际消化病杂志 2023 年 2 月第 43 卷第 1 期 Int J Dig Dis，February 25，2023，Vol.43，No.1于 HCT116-KD 组（0.2920.130），2 组比较差异有统计学意义（P0.05），这提示 MALAT1 敲减表达的 HCT116 细胞株构建成功。2.1.2 MALAT1 敲减表达对 HCT116 细胞迁移的影响 划痕实验结果显示，经 24 h 培养后 HCT116-NC 组 的 总 愈 合 率 为（30.80.8）%，显 著 高 于HCT116-KD 组（13.10.6）%，2 组 比 较 差 异有统计学意义（P0.05），见图 1。Transwell 实验结果显示，HCT116-KD 组的细胞侵袭数量相较于HCT116-NC 组明显减少，见图 2。2.1.3 MALAT1 敲 减 表 达 对 HCT116 细 胞 中 Wnt/-catenin 信 号 通 路 的 影 响 蛋 白 质 印 迹 实 验 结果 显 示，HCT116-NC 组 中 Wnt3a 的 蛋 白 表 达水 平 为 0.9930.002，-catenin 的 蛋 白 表 达 水平 为 0.9680.007，均 显 著 高 于 HCT116-KD 组（0.4670.006、0.6780.003），2 组比较差异均有统计学意义（P 均0.05）。见图 3。图 1 划痕实验检测 MALAT1 敲减表达对 HCT116 细胞迁移的影响HCT116-NC 组 HCT116-KD 组图 2 Transwell 实验检测 MALAT1 敲减表达对 HCT116 细胞侵袭的影响 0.4%结晶紫染色 100 A HCT116-NC 组 B HCT116-KD 组图 3 蛋白质印迹法检测细胞中 Wnt3a、-catenin 蛋白表达水平HCT116-NC 组 HCT116-KD 组 相对分子质量-catenin Wnt3aGAPDH86 00037 00036 0002.2 MALAT1 对 HCT116 细胞迁移的作用机制2.2.1 MALAT1 敲 减 表 达 对 HCT116 细 胞 迁 移能力的影响 划痕实验结果显示，经 24 h 培养后 HCT116-NC 组 的 总 愈 合 率 为（30.80.8）%，HCT116-KD 组 的 总 愈 合 率 为（13.10.6）%，HCT116-NCKD-exo 组 的 总 愈 合 率 为（26.5 0.5）%，HCT116-KDNC-exo 组 的 总 愈 合 率 为（15.80.6）%。HCT116-KDNC-exo 组 的 总 愈 合率相较于 HCT116-KD 组显著升高，差异有统计学意义（P0.05）；HCT116-NCKD-exo 组的总愈合率相较于 HCT116-NC 组差异无统计学意义，见图4。Transwell 实验结果显示，HCT116-KDNC-exo组的细胞侵袭数量相较于 HCT116-NCKD-exo 组明显增多，见图 5。2.2.2 MALAT1 敲减表达对 HCT116 细胞-catenin蛋白的影响 采用蛋白质印迹法检测共培养后MALAT 正常/敲减表达的 HCT116 细胞中-catenin蛋白水平，结果显示 HCT116-NC 组中-catenin 的蛋 白 表 达 水 平 为 0.9680.007，HCT116-KD 组 中-catenin 的蛋白表达水平为 0.6780.003，HCT116-NCKD-exo 组 中-catenin 的 蛋 白 表 达 水 平 为0.8270.009，HCT116-KDNC-exo 组 中-catenin的 蛋 白 表 达 水 平 为 0.4190.010。HCT116-KD NC-exo 组 的-catenin 蛋 白 表 达 水 平 显 著 高 于HCT116-KD 组，差异有统计学意义（P0.05），见图 6。2.3 健脾通络方对 HCT116 细胞侵袭迁移能力的影响及机制2.3.1 健脾通络方对 HCT116 细胞增殖的影响 采用 CCK-8 法检测健脾通络方的质量浓度。经健脾通络方干预 24 h 后，检测 HCT116 细胞的增殖情况。结果显示，当 HCT116 细胞的死亡率为 50%时，健AB43国际消化病杂志 2023 年 2 月第 43 卷第 1 期 Int J Dig Dis，February 25，2023，Vol.43，No.1脾通络方的质量浓度为 50 mg/mL，并且生长抑制率随着健脾通路方质量浓度升高而升高，后续实验取 IC50 值。2.3.2 健脾通络方对 HCT116 细胞侵袭迁移能力的影响 划痕实验结果显示，经 24 h 培养后 HCT116-NC 组 的 总 愈 合 率 为（30.80.8）%，HCT116-KD组 的 总 愈 合 率 为（13.10.6）%，HCT116-NCJPTL 组 的 总 愈 合 率 为（18.10.1）%，HCT116-KDJPTL 组 的 总 愈 合 率 为（5.10.5）%。这 提示经健脾通络方干预后，HCT116 细胞的迁移能力下降，见图 7。Transwell 实验结果显示，与正常培养的 HCT116 细胞相比，经健脾通络方干预后的HCT116 细胞侵袭数量减少，见图 8。图 4 划痕实验检测共培养后细胞的迁移能力图 5 Transwell 实验检测共培养后细胞的侵袭能力 0.4%结晶紫染色 100 A HCT116-NC 组 B HCT116-KD 组 C HCT116-NCKD-exo 组 D HCT116-KDNC-exo 组注：1 为 HCT116-NC 组，2 为 HCT116-KD 组，3 为 HCT116-NCKD-exo 组，4 为 HCT116-KDNC-exo 组图 6 蛋白质印迹法检测共培养后细胞中-catenin 的蛋白表达水平HCT116-NC 组 HCT116-KD 组 HCT116-NC+KD-exo 组 HCT116-KD+NC-exo 组1234相对分子质量100 00036 000-catenin GAPDH2.3.3 健脾通络方对 HCT116 细胞中 MALAT1 表达水平的影响 实时荧光定量 PCR 实验结果显示，MALAT1 在 HCT116-NC 组 中 的 相 对 表 达 量为 0.9000.010，HCT116-KD 组为 0.2920.130，HCT116-NCJPTL 组为 0.7200.005，HCT116-KDJPTL 组为 0.5900.010。与 MALAT1 正常/敲减表达的 HCT116 细胞相比，经健脾通络方干预后HCT116 细胞中 MALAT1 表达水平降低，这提示健脾通络方可抑制 MALAT1 表达。2.3.4 健 脾 通 络 方 对 HCT116 细 胞 中 Wnt/-catenin 信 号 通 路 的 影 响 蛋 白 质 印 迹 实 验 结果 显 示，HCT116-NC 组 中 Wnt3a 的 蛋 白 表 达 水平 为 0.9930.002，-catenin 的 蛋 白 表 达 水 平 为0.9680.007；HCT116-KD 组中 Wnt3a 的蛋白表达水平为 0.4670.006，-catenin 的蛋白表达水平为0.6780.003；HCT116-NCJPTL 组 中 Wnt3a 的 蛋BCDA44国际消化病杂志 2023 年 2 月第 43 卷第 1 期 Int J Dig Dis，February 25，2023，Vol.43，No.1白表达水平为 0.5120.010，-atenin 的蛋白表达水平 为 0.5060.006；HCT116-KDJPTL 组 中 Wnt3a的蛋白表达水平为 0.5730.020，-catenin 的蛋白表达水平为 0.3450.002。结果提示，与正常培养的 HCT116 细胞相比，经健脾通络方干预后的HCT116 细胞中 Wnt3a、-catenin 的蛋白表达水平均降低，见图 9。图 8 Transwell 实验检测经健脾通络方干预后细胞的侵袭能力 0.4%结晶紫染色 100 A HCT116-NC 组 B HCT116-KD组 C HCT116-NCJPTL 组 D HCT116-KDJPTL 组图 7 划痕实验检测经健脾通络方干预后细胞的迁移能力HCT116-NC 组 HCT116-KD 组 HCT116-NCJPTL 组 HCT116-KDJPTL 组注：1 为 HCT116-NC 组，2 为 HCT116-KD 组，3 为 HCT116-NCJPTL 组，4 为 HCT116-KDJPTL 组图 9 蛋白质印迹法检测经健脾通络方干预后细胞中 Wnt3a、-catenin 的蛋白表达水平1234相对分子质量100 00037 00036 000-catenin Wnt3aGAPDH2.4 健脾通络方对 HCT116 细胞肺转移的影响2.4.1 健脾通络方对 HCT116 细胞肺转移的抑制作用 构建裸鼠肺转移模型，采用小动物活体成像技术检测 HCT116 细胞发光现象。健脾通络方干预后，每周进行 1 次成像，观察结果显示在干预初始各组裸鼠均出现少量转移，干预结束时各组裸鼠均出现转移，见图 10。HCT116 细胞组的发光 光 子 数 为（2.970.90）106个，HCT116 细 胞敲减组为（1.260.70）106个，健脾通络方干预组为（0.970.30）106个。与 HCT116 细胞组相比，HCT116 细胞敲减组和健脾通络方干预组的发光光子数均较少，这提示 HCT116 细胞敲减组、健脾通络方干预组的 HCT116 细胞迁移数量均少于HCT116 细胞组。H-E 染色结果显示，健脾通路方干预组和 HCT116 细胞组小鼠肺部均存在转移灶，见图 11。BCDA45国际消化病杂志 2023 年 2 月第 43 卷第 1 期 Int J Dig Dis，February 25，2023，Vol.43，No.12.4.2 健脾通络方对结肠癌肺转移组织中 MALAT1表达水平的影响 实时荧光定量 PCR 实验结果显示，HCT116 细胞组中 MALAT1 的相对表达量为0.9900.010，HCT116 细胞敲减组为 0.8100.080，健脾通络方干预组为 0.7200.020。与 HCT116 细胞组相比，HCT116 细胞敲减组和健脾通络方干预组的肺转移灶中 MALAT1 的表达水平均降低，差异均有统计学意义（P 均0.05）。2.4.3 健脾通络方对结肠癌肺转移组织中 Wnt3a、-catenin 蛋白表达水平的影响 蛋白质印迹法实验结果显示，HCT116 细胞组中 Wnt3a 的蛋白表达水平为 0.8900.020，-catenin 的蛋白表达水平为0.9500.070；HCT116 细胞敲减组中 Wnt3a 的蛋白表达水平为 0.6700.090，-catenin 的蛋白表达水注：1为HCT116细胞组，2为HCT116细胞敲减组，3为健脾通络方干预组图 12 蛋白质印迹法检测裸鼠肺转移灶中 Wnt3a、-catenin 的蛋白表达水平图 10 小 动 物 活 体 成 像 技 术 检 测 裸 鼠 肺 转 移 情 况 A HCT116 细胞组 B HCT116 细胞敲减组 C 健脾通络方干预组图 11 各组裸鼠肺组织病理图 H-E 染色 50 A HCT116 细胞组 B HCT116 细胞敲减组 C 健脾通络方干预组ABC123相对分子质量100 00037 00036 000-catenin Wnt3aGAPDH均有统计学意义（P 均0.05）。免疫组织化学染色法检测结果同样显示，HCT116 细胞敲减组和健脾通络方干预组中 Wnt3a、-catenin 的蛋白表达水平均较 HCT116 细胞组降低，其中健脾通络方干预组最低，见图 13。3 讨论结直肠癌病位在肠，与脾相关，发病隐匿，病程长，符合中医“久病入络”病机，脾胃受损，气血不能运化。清代叶天士提出“久病入络”，使络病成为内伤疑难杂病的病机，在临床实践中有助于提高肿瘤等多种难治性疾病的临床疗效10-11。中医认为络病作为经脉的分支，遍布全身，具有运行气血，渗濡灌注的作用，络脉的功能及形态结构与现代微循环系统十分相似12。在健脾基础上运用通络药，根据其通络行气血的特点，以健脾通络行气为治法，共奏抗癌之功。近年来，肿瘤相关的研究中关于非编码基因的研究进展迅速，研究表明 lncRNA 与肿瘤有着十分密切的关系，lncRNA 可以通过调控基因转录、蛋白表达等过程参与肿瘤的进展13。lncRNA 平为 0.8100.002；健脾通络方干预组中 Wnt3a 的蛋白表达水平为 0.4200.040，-catenin 的蛋白表达水平为 0.3980.060，见图 12。与 HCT116 细胞组相比，HCT116 细胞敲减组和健脾通络方干预组中 Wnt3a、-catenin 的蛋白表达水平均降低，差异ABC46国际消化病杂志 2023 年 2 月第 43 卷第 1 期 Int J Dig Dis，February 25，2023，Vol.43，No.1MALAT1 在 2003 年肺癌的相关研究中被首次发现可参与肺癌的进展，随后研究发现 MALAT1 可参与多种恶性肿瘤的发生和进展，并且与恶性肿瘤的转移及复发密切相关4,14。Yang 等15研究发现，在淋巴结转移的人原发性肠癌组织中 MALAT1 表达上调，这提示 MALAT1 在结直肠癌的发生中发挥着潜在作用。MALAT1 基因敲除后可导致基因表达改变，并参与了肿瘤细胞的分化，以及原癌信号通路的基因剪接模式的改变，从而导致细胞生物学表型的改变16-17。多项研究表明，MALAT1的异常表达可以作为恶性肿瘤预后的生物标志物；在结直肠癌组织中 MALAT1 高表达，且与患者生存期缩短有着密切联系18-21。本研究结果显示，MALAT1 基因敲减后能降低 HCT116 细胞的侵袭、迁移能力。给予健脾通络方干预能通过下调MALAT1 表达，从而抑制 MALAT1 对 HCT116 细胞侵袭、迁移能力的影响。Wnt/-catenin 信号通路中的 Wnt3a、Wnt5a 和-catenin 均参与了结直肠癌的转移22-23。-catenin蛋白在胞质中累积一定浓度后与 TCF/LEF 作用，诱导 Wnt 转录目的基因，诱导细胞反应发生，从而促进肿瘤发生、发展24。中医药防治结直肠癌的相关研究表明，针对“脾虚证”可通过健脾防止结直肠癌的发生、发展，改善患者生活质量，抑制远处转移，从而延长患者生存期25-26。健脾方剂可以通过多种环节和多条信号通路调控结直肠癌细胞的侵袭、迁移。体外实验发现，健脾解毒方可以抑制环氧合酶-2（COX-2）表达，进而阻断-catenin在 LoVo 细胞核中累积，下调 MMP7 表达，从而发挥抑制肿瘤转移的作用27。另有研究表明，健脾复方可以抑制人结肠癌细胞 LoVo 细胞的增殖、侵袭及迁移28。本 研 究 结 果 提 示，健 脾 通 络 方 通 过 降 低HCT116 细胞中 MALAT1 的表达水平，下调 Wnt/-catenin 信号通路中 Wnt3a、-catenin 的蛋白表达，从而抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力。课题组前期在肿瘤细胞外泌体中也检测出 Wnt3a的表达，之后将进一步探索健脾通络方在结直肠癌肿瘤微环境中的作用和机制，以期明确其是否可通过肿瘤微环境发挥抑制作用。参 考 文 献1 Zheng RS,Zhang SW,Zeng HM,et al.Cancer incidence and mortality in China,2016J.J Natl Cancer Cent,2022,2(1):1-9.2 胡淼,刘玲,顾佳麟,等.早发性结直肠癌的研究进展 J.中国肿瘤外科杂志,2022,14(2):195-199.3 Robinson JR,Newcomb PA,Hardikar S,et al.Stage colorectal cancer primary site and patterns of distant metastasisJ.Cancer Epidemiol,2017,48:92-95.4 Ji P,Diederichs S,Wang W,et al.MALAT-1,a novel noncoding RNA,and thymosin beta4 predict metastasis and survival in early-stage non-small cell lung cancerJ.Oncogene,2003,22(39):8031-8041.5 Gutschner T,Hmmerle M,Eissmann M,et al.The noncoding RNA 图 13 各组肺转移灶中 Wnt3a、-catenin 蛋白的阳性表达情况 免疫组织化学染色 50 A HCT116 细胞组中-catenin 蛋白 B HCT116 细胞敲减组中-catenin 蛋白 C 健脾通络方干预组中-catenin 蛋白 D HCT116 细胞组中 Wnt3a 蛋白 E HCT116 细胞敲减组中 Wnt3a 蛋白 F 健脾通络方干预组中 Wnt3a 蛋白ABCDEF47国际消化病杂志 2023 年 2 月第 43 卷第 1 期 Int J Dig Dis，February 25，2023，Vol.43，No.1MALAT1 is a critical regulator of the metastasis phenotype of lung cancer cellsJ.Cancer Res,2013,73(3):1180-1189.6 季青,周宁,刘宣,等.MALAT1、COX-2、-catenin、MMP-3、MMP-9 等基因在结直肠癌发生发展中的意义 J.国际肿瘤学杂志,2012,39(6):477-480.7 Vassallo I,Zinn P,Lai M,et al.WIF1 re-expression in glioblastoma inhibits migration through attenuation of non-canonical WNT signaling by downregulating the lncRNA MALAT1J.Oncogene,2016,35(1):12-21.8 张彦博,刘宣,季青,等.健脾解毒方联合化疗治疗转移性结直肠癌临床研究 J.中