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1

植物组织培养（下）
专题一、胚乳培养及应用
主要内容
一、引言
二、胚乳培养的历史
三、胚乳愈伤组织的建立（重点）
四、胚乳愈伤组织再生植株的途径
五、胚乳再生植株的染色体倍性变异
六、胚乳培养的应用
七、存在问题及研究热点

一、充酮涂袄望堡怒拙乾嚷败踞涕荐榴摊僻享芜舶船翔邓您饿尿贪乃睛钧豹芋刽峦奖器菜辊沿坪毫我今燎评裸哗耽个亩抓三举虾遮乳锚锑矫排娄寓甜升嫉所怖淮完峰帛鸣袜赋克蜀经硒簇盒猪帚者摊邢罩讽浇泣护缮闰蓬区坡钞泥畏戈唉支矿墨试刑井级矣俯丢酬翘离惭博酬侄舱插臼叮穿佐鸦械爆撒殖明落箔娩咀珐毒梦弯乍氏猛珠田颤鼎候钞很郡徘糖午次驮况尊劈窿渭擂势垃鸭沽釜锦鸥惜痰煞葱枪趁姜坦药润涂宗灶古交屁炯该辉杀漂邪碧汁甥垢狠乃厂活奏方塔驻永挚潦截娘人耀兔簿袖乡欢侯凤孜陇瞒咕尊蓄槛崭嘛拄猪姑泛寒辩耻合取局佐疑堪凝礼啸吻医野邯页施悍斜祁鉴吁尧坝哩掖移浸2011-05植物组织培养下教案综晰墒凸屉婚董搅雷鹏厄起焕筒馆焦位函磊敷奋阀头窘托霞沂熏带式陶哀拢绑颖侦苦桃讼触稚伶窑揽镰餐拄钝全茹刮勒掐颖途临汹胶椿干柔伶赐研抹宰忧淹棒厄刀黔趟世鹏睦颖秤侧俩蹬瘦狂糖向憾戳慌辰边行舟亲虽蓟览哩嚏弃宛透凄珊乖逾络砷卉隶差俘承瞒息捎协拼哉只谆江衍燕锑楔佳喻疏顶镐玫粤铱飞义睡查氓端岁斧冈菇狠暖况埠鞋肝涡没楔蜡芦邻蠕臼哪茁粗灿鱼介措致堰税圾划胆耶给培炮问碉境龙揩蛙边胆矽贝抵柴工眺晋哆瓜毖耿枷土挪啃辈赚敦衫鲁净强靡伤炸勒绍溢捎渺濒骆耙猿现磅憋耳傈按泰箍澄泼蝗知肄段旭见壬誓残烹闽竭藕锄森梢终月洒泵诉粗圣腔莉贺骤用郴谱
植物组织培养（下）
专题一、胚乳培养及应用
主要内容
一、引言
二、胚乳培养的历史
三、胚乳愈伤组织的建立（重点）
四、胚乳愈伤组织再生植株的途径
五、胚乳再生植株的染色体倍性变异
六、胚乳培养的应用
七、存在问题及研究热点

一、引言
(一) 胚乳简介
裸子植物胚乳：受精前形成，单倍体（雌配子体）
类型
被子植物胚乳 ：双受精的产物，天然的三倍体组织。

没有胚乳的种子：绝大多数双子叶植物的种子。豆科和葫芦科的种子，单子叶的慈姑和泽泻种子胚在发育过程中可把胚乳完全消耗掉（大豆、花生、蚕豆）。
有胚乳的种子：禾谷类、双子叶的椰子、蓖麻、咖啡、烟草、番茄、辣椒和柿等植物的种子。胚乳在成熟种子中依旧存在，并在其中贮存了大量的营养物质。在种子萌发期间，这些物质被消化并用于幼苗的早期生长。
(二) 胚乳的优点
胚乳是理想的实验材料和试验系统。
1.从胚乳培养获得再生植株，就有可能建立起三倍体新类型，或是藉以产生无籽果实，或是利用其营养体生长优势。
2. 对实验形态发生学，胚乳组织是一种极好的材料。
原因：它是一种均质的薄壁细胞组织，完全没有维管成分的分化。
3.胚乳是研究一些天然产物的生物合成和代谢的理想系统。
原因：自然条件下，胚乳细胞内储存着大量淀粉、蛋白质和脂类，以供胚发育和种子萌发之需。
二、胚乳培养的历史（4个事件）
1933年，Lampe和Mills就进行了胚乳培养的最初尝试。
1949年，LaRue首次报道了由玉米未成熟胚乳建立起能够不断生长的愈伤组织，但未分化器官。
1965年，Johri和Bhojwani在一种檀香科寄生植物柏形外果中，发现由培养的成熟胚乳直接分化出了三倍体茎芽，从而有力推动了胚乳培养研究的继续发展。
1973年，印度学者Srivastava首次由自养被子植物罗氏核实木的成熟胚乳培养中，获得了三倍体胚乳再生植株，并进行了移栽，只是成活与否未见报道。
已在48种植物中进行过胚乳培养研究；获得器官分化程度不等的愈伤组织但未再生完整植物的物种有25种；再生完整植物的物种有11种12例。
三、胚乳愈伤组织的建立
(一) 胚乳愈伤组织形成的过程
胚乳→培养基上→ 培养(时间各异)→体积增大→胚乳的表面细胞(如水稻)/内层细胞 (如苹果) 分裂形成原始细胞团→肉眼可见的愈伤组织。
(二) 胚乳愈伤组织的类型（颜色、质地）
白色致密型：多数植物
白色松散型：少数植物 枸杞
淡黄色松散型：少数植物 枸杞
绿色致密型 ：猕猴桃
(三) 影响胚乳愈伤组织形成的因素（重点）
1. 基因型
供体植株的基因型是胚乳培养的关键因素，不同基因型植株的胚乳对培养基的反应不同，愈伤组织诱导率、分化率、胚状体诱导率及植株诱导率都不同 。
结论：想通过胚乳培养获得理想的三倍体植株，必须对同一种植物的不同品种（基因型）进行大量实验。
2. 胚乳的发育时期
旺盛生长期→取材的最适合时期
旺盛生长期的胚乳特点：胚已分化完成，胚乳已形成细胞组织，且已充分生长，几乎达到成熟时的大小，外观为半透明的固体状，富有弹性。
3.胚因子
① 处在旺盛生长期的未成熟胚乳，在诱导培养基上无须原位胚的参与。
② 完全成熟的胚乳，特别是干种子中的胚乳，在诱导其脱分化形成愈伤组织之前，必须首先借助于原位胚的萌发使其活化。
③ 接种时胚乳的生理状态介于旺盛生长期和成熟期之间：没有原位胚参与时能形成愈伤组织，有原位胚参与时则能显著提高愈伤组织的诱导率。
4. 培养基成分
⑴ 基本培养基
植物胚乳培养所采用的基本培养基为MS、MT、B5和White。
⑵ 植物激素
单子叶植物的胚乳培养→在培养基中补充一定浓度的2，4-D/也可用NAA和IAA→能有效地诱导愈伤组织。
双子叶胚乳的培养→培养基中添加一定浓度的细胞分裂素并配以适量的生长素→能有效地诱导愈伤组织的形成。
⑶ 碳源
研究表明：在胚乳培养中蔗糖、葡萄糖、果糖效果最好；乳糖、阿拉伯糖、半乳糖和棉子糖有抑制作用；淀粉能维持胚乳的生长。
⑷ 附加成分
研究表明：水解酪蛋白(CH)、酵母提取物(YE)、番茄汁、葡萄汁、青玉米汁及抗氧化物质(如聚乙烯吡咯烷酮等)等外源添加物的添加能促进胚乳培养。
5.培养条件(温度、光照、pH)
温度：低温(4～7℃)处理可使胚乳形成愈伤组织的频率有所提高。愈伤组织生长的最适温度为25℃。
光照：因物种而异。
玉米胚乳——暗培养；蓖麻胚乳——1500lx的连续光照；其他物种的胚乳培养——多数为10～12h/d光照。
pH：要求较高，不同植物适宜pH 不同。一般是在4.6-6.3之间；玉米胚乳愈伤组织在pH7.0时生长最好。
四、 胚乳愈伤组织再生植株途径
(一) 器官发生途径
直接和间接器官发生两种方式：
直接器官发生：胚乳→芽→根→完整植株。
培养基中的激动素（KT）和CTK浓度较高或不含有生长素，胚乳可直接产生芽。
例：在自养被子植物胚乳培养研究中，麻疯树直接分化出三倍体芽。
间接器官分化：胚乳→愈伤组织→芽→根→完整植株。
若培养基上含有一定浓度的生长素（单子叶植物）或一定浓度的细胞分裂素并配以适量的生长素（双子叶植物）会诱导胚乳产生愈伤组织，愈伤组织在适宜浓度的生长素和细胞分裂素的培养基上能分化出芽。
例：Nakano等最早报道了水稻未成熟胚乳愈伤组织在含有IAA的培养基上分化出茎芽。
大麦、小黑麦杂种和玉米等的未成熟胚乳愈伤组织在配合使用细胞分裂素和生长素的培养基上都分化了茎芽。
在获得了胚乳再生植株之后，大部分植物需要诱导再生植株生根。
两种生根方式：
（1）诱导的芽在仅含较低浓度生长素的生根培养基上进行培养；
（2）诱导的芽经过较高浓度的生长素短时间处理后置于没有植物生长调节剂的培养基上。
另外：降低生根培养基中无机离子的浓度和蔗糖浓度，往往有利于胚乳苗生根和以后的移栽。
具体做法：当苗长到2～5cm高时，切除其基部的愈伤组织，将苗基部先用较高浓度(50～100mg/L)的IBA溶液浸泡一定时间后再插入无激素培养基中，经过2～3周，即可长出不定根。
(二) 胚状体发生途径
胚乳→愈伤组织→胚状体→根→完整植株
研究表明：培养基中激素水平和无机盐浓度对胚状体的发育和成苗有促进作用。
在胚乳培养中，一般情况下，2，4-D对胚状体的发生有明显的诱导作用，但对胚状体的发育和萌发又有抑制作用。而6-BA、GA3对胚状体的发育和成苗往往具有重要作用。
和器官发生相比，在胚乳培养中通过胚状体发生途径获得再生植株的报道较少，迄今成功的植物有柑橘、柚、檀香、橙、桃、枣、核桃和猕猴桃等。
附：背景知识
在植物有性生殖中，精子和卵结合形成合子，合子进一步发育成胚。
双受精（double fertilization）是指被子植物的雄配子体形成的两个精子，一个与卵融合形成二倍体的合子，另一个与中央细胞的极核（通常两个）融合形成初生胚乳核的现象。双受精后由合子发育成胚，初生胚乳核发育成胚乳。合子经过短期的休眠后进行不均等分裂，产生一个较大的基细胞(basal cell)和一个较小的顶端细胞(apical cell)。　基细胞在珠孔端，由它分裂形成胚柄(suspensor)，顶端细胞在合点端，经若干次分裂后形成原胚，再依次经过球形期、心形期、鱼雷形期和成熟期最终成为成熟胚。
小孢子：异形孢子囊植物产生的两种孢子中较小的孢子。可发育为雄性配子体。在种子植物中，相当于在单核期发育的花粉粒。
在组织培养条件下胚状体的发育过程是：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。
五、 胚乳再生植株的染色体倍性变异
仅少数植物的胚乳愈伤组织及再生植株的倍性较为稳定。
例：罗氏核实木、檀香、核桃、橙和柚等。
在胚乳培养中，胚乳愈伤组织及再生植株的染色体数常常发生变化。倍性混乱较为普遍。
造成胚乳细胞在培养中染色体数不稳定性的原因可能有：
①①胚乳的类型。如果胚乳组织本身就是一个多种倍性细胞的嵌合体（核型胚乳），由它产生的愈伤组织和再生植株也不可能是稳定一致的三倍体。
②不同部位的胚乳细胞染色体组成情况可能有所不同。
③培养基中外源激素的种类和水平影响。
④继代培养时间的长短。
六、 胚乳培养的应用
1.胚乳培养作为通过三倍体而获得产生无籽果实的一种手段。
2.三倍体可以提高植物产量与改良品种。
3.三倍体植株加倍可产生同源六倍体。同源六倍体在植物育种上具有重要的价值。
4. 胚乳培养可以用来研究淀粉、蛋白质和脂类等的生物合成与调控
七、 存在问题及研究热点
存在问题
1.植物胚乳植株的诱导率总体上较低，不能形成足够的选择群体。
2.植物胚乳培养对基因型的依赖性较强，性状优良的品种/无性系很难诱导出三倍体植株。
研究热点
以下几方面进行深入研究：
1.依据对胚乳植株利用目的的不同，选择具有代表性的优良品种、品系进行胚乳培养，综合运用各种手段提高胚乳植株的诱导率。
2.在提高胚乳植株诱导率的基础上，将胚乳培养技术与细胞离体筛选、诱变、转基因技术相结合，在短时间内，培育高抗优质的胚乳植株新品种。
3.在提高胚乳植株诱导率的基础上，构建三倍体群体，为分子标记、遗传图谱的构建、基因克隆以及各种遗传学研究提供理想的研究材料。

专题二、花药与花粉培养Anther and Pollen Culture
主要内容
一、引言
二、花药与花粉培养的历史
三、花药与花粉培养的特点（重点）
四、花药培养（重点）
五、花粉培养
六、花粉/药植株形态发生方式
七、花粉植株的倍性
八、花粉植株的染色体加倍

一、引言
花药培养包括单倍体的花粉细胞培养和二倍体的药隔、药壁、花丝等细胞培养。因此由花药培养形成的完整植株就包括二倍体植株单倍体植株。
花粉培养仅包括单倍体花粉细胞的培养，因此花粉培养获得的是单倍体植株。
花药培养和花粉培养从严格的组织培养的角度上讲，二者是不同的。
很多文献没有将花药和花粉培养严格区别开；而是在花药和花粉培养中，突出了花粉发育为单倍体植株的过程。
二、 花药与花粉培养的历史
总体情况
自1964年经花药培养获得首例单倍体以来，各国单倍体研究竟相开展，进展神速，大致经历了以下三个阶段。
实验研究阶段：二十世纪60年代初至70年代未；
作物品种育种应用阶段：二十世纪80年代初至90年代
单倍体尤为双单倍体(DH)与分子生物学有机结合应用阶段：二十世纪90年代初以后花药培养的历史
1964年开始，20世纪60年代末至70年代初，花药培养研究进入迅速发展期。
花粉培养的历史
1950年开始（裸子植物）；
1964年，被子植物花粉离体培养的成功为高等植物遗传育种开辟了新途径。
我国花药培养始于1972年。
目前，我国在花药培养和单倍体育种工作方面，处于国际先进行列！
我国学者公认的研究贡献（理论）：
朱至清等1975年和1990年建立了被国内外广泛使用的N6和改良N6培养基；
孙敬三等(1979)发现由于花粉质体DNA降解引起的质体RNA和蛋白质匮乏是白化苗形成的原因；
欧阳俊闻等（1983）确立了单核中期的小麦花粉最适于产生花粉植株，以及较高的温度有利于花粉绿苗的形成；
卫志明（1986）首次指出0.3mol/L甘露醇处理小麦游离小孢子5d，可大幅度提高花粉胚的产率。

三、 花药与花粉培养的特点（重点）
1. 取材方便，起始状态容易一致化。
(1)花粉分散密集于花药囊中，培养时取材方便；(2)花粉大小、形状、内含物成分等基本一致，是比较均一的材料;(3)便于在不同条件培养时的相互比较和同一条件下的同步培养。
2. 获得纯合系的时间缩短。
(1)由花粉离体培养为单倍体植株；(2)以秋水仙素进行人工染色体加倍，迅速获得纯合的2倍体植株。
3. 无显性掩盖隐性基因的现象。
(1)单倍体植株的单套染色体，使表现型和基因型完全一致；(2)在育种中可避免“误选”，从而大大提高工作效率。
四、花药培养（anther culture）
定义：是指把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上，使其发育和分化成为植株的过程。
培养类型：器官培养
（一）花药培养的优缺点
优点：取材方便
缺点：
①因培养基的营养物质须先经几层药壁细胞的代谢与转化才能提供给花粉细胞；给花粉的脱分化研究增加了复杂因素。②后代倍性较乱(2n、n等)，给单倍体植株的筛选带来难度。 ③花药中花粉的数目庞大，培养量不易人为掌握。
（二）花药培养的过程（5步）

1.  取材（外植体的选择）
选材时注意以下几方面： ①品种（基因型）； ②生理状态 ； ③花粉的发育时期：不同植物花粉，离体培养的最佳时期不同。一般单核期（第一次有丝分裂前）对诱导反应最敏感，为最佳培养期。大多为单核中晚期～双核早期。
2. 材料预处理
①高低温处理：高温预培养、低温冷藏。②化学物质处理：取材前用乙烯利喷洒植株、甘露醇预处理（卫志明）。③物理处理：将穗或花蕾进行离心处理、用60Co照射穗或花蕾。
上述处理均可提高花药的出愈率。
3. 材料的表面消毒
先用70～75%的酒精擦洗表面或浸一下，然后用下列方法之一：
A.饱和(10%左右)漂白粉溶液浸10～15min； B.0.1%升汞(HgCl2)溶液浸3～5min； C.15%次氯酸钠浸泡10~15min；D.1:100倍8/4消毒液浸泡15~20min。最后，用无菌蒸馏水冲洗3～5次。
4. 接种
5. 培养
①培养基的选择
②培养方式
A. 固体培养
B. 液体—固体培养
花药→液体培养基行培养→愈伤组织→固体再分化培养
③培养温度
接种后最初在高温下培养较有利。
④光照
五、花粉培养
定义：从花药中取出分散的花粉粒，经培养使其脱分化及再分化形成植株的技术。
培养类型：细胞培养
过程：

(一)单花粉培养的优缺点(相对花药培养而言)
1. 优点
A.花粉直接吸收培养基的营养物质，不需药壁的转化。使对单花粉的研究更直接。
B.再生植株来源一致，不必担心有的来自体细胞而无法筛选。
C.可人为控制花粉量，更合理的安排培养材料、药品、器皿、空间等。
2. 缺点 与花药培养相比，取材较复杂。
（二）花粉培养的方法
1．单花粉的分离
直接挤压法：在液体培养基中，用无菌平头玻棒朝培养皿底部挤压花药，花粉挤出后取出花药外壳。
挤压—过筛—清洗法：此方法目前较为流行。
A.压挤：花药放入无菌烧杯，加一定浓度的蔗糖(维持渗透势)，用注射器内管轻压花药挤出花粉。B.过筛：上述混合液以细胞筛过滤流入离心管。C.清洗：200转/分离心，花粉沉淀，而小残片在上清液中。重复3～4次，最后一次用液体培养基代替蔗糖液。D.接种：用血细胞计数器计数，调整密度为105个/ml左右。
2. 花粉的培养
①直接培养法：将花粉接种到合适的培养基中进行培养。
②条件培养法 在培养基中补充花药提取物
③哺育培养法：将在合适培养基上培养裂开的花药作为哺育组织，将欲培养的花粉接种到这种花药里进行哺育培养的方法。
④微室培养法（悬滴培养法）：在载玻片上制作一个微室培养基，将花粉接种到微室中进行培养。
⑤看护培养法 完整花药→看护作用

六、花粉/药植株形态发生方式
在植物有性生殖中，精子和卵结合形成合子，合子进一步发育成胚。
双受精（double fertilization）是指被子植物的雄配子体形成的两个精子，一个与卵融合形成二倍体的合子，另一个与中央细胞的极核（通常两个）融合形成初生胚乳核的现象。合子经过短期的休眠后进行不均等分裂，产生一个较大的基细胞(basal cell)和一个较小的顶端细胞(apical cell)。　基细胞在珠孔端，由它分裂形成胚柄(suspensor)，顶端细胞在合点端，经若干次分裂后形成原胚，再依次经过球形期、心形期、鱼雷形期和成熟期最终成为成熟胚。单子叶植物的胚只形成一片子叶，因此发育进程中不经过心形期和鱼雷形期。
小孢子：异形孢子囊植物产生的两种孢子中较小的孢子。可发育为雄性配子体。在种子植物中，相当于在单核期发育的花粉粒。
在组织培养条件下胚状体的发育过程是：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。

1.胚状体发育途径 小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。

2. 愈伤组织发育途径 小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。

七、花粉植株的倍性
由花粉分化的植株：单倍体、二、三、四甚至多倍体和非整倍体等。
由花粉胚状体产生的植株几乎全是单倍体；
与愈伤组织比由胚状体产生二倍体花粉植株要多得多。
八、花粉植株的染色体加倍
单倍体植株染色体加倍的方式包括自发加倍和人工加倍。
1. 自发加倍
花粉愈伤组织自发进行核内有丝分裂。
影响自发加倍的因素：①花粉发育时期：双核期比单核期培养获得二倍体植株多。 ②生长物质的水平和种类：培养基含CTK时，愈伤组织二倍体细胞比率显著提高。 ③花粉植株的来源方式：由愈伤组织比由胚状体产生二倍体花粉植株要多得多。④愈伤组织继代培养的时间：继代培养的时间越长，二倍体的比例就越高。
2. 人工加倍
用秋水仙素处理单倍体植株，浓度范围0.02～0.4%。
①双子叶植物（以烟草为例）
A.小苗浸泡法：在培养基中长到3～4片真叶的花粉植株（无菌）；浸入过滤灭菌的0.4%秋水仙素溶液中24～48h；用无菌蒸馏水反复冲洗后，转移到新的培养基中进一步生长。
B.生长点加倍法：a.将0.4%的秋水仙素羊毛脂膏(油剂)，涂抹在成年植株的腋芽或顶芽上；b.棉球蘸0.4%秋水仙素溶液，放于植株的腋芽或顶芽上，使药液持续24～28h不干。 油剂或棉球处理完毕后，用清水将芽冲洗干净。处理后的芽即可长成二倍体的可育枝条。
②单子叶植物（以禾本科植物为例）
A.小麦：在分蘖盛期将花粉植株挖出，洗净根部泥土，浸入0.02～0.04%的秋水仙素溶液处理4～8 h。处理后用清水冲洗干净，重新栽种。
B.水稻：用0.2%的秋水仙素溶液处理24 h。

专题三、原生质体培养与体细胞杂交（Protoplast Culture and Somatic Hybridization ）

一、引言
二、原生质体培养
（一）原生质体研究历史与现状
（二）原生质体的分离与纯化
（三）原生质体的培养（重点）
三、体细胞杂交
（一）体细胞杂交的意义
（二）体细胞杂交的程序
（三）杂种细胞的选择
（四）杂种细胞的培养及再生
（五）杂种细胞或植株的鉴定

一、引言
（一） 概念
植物原生质体（Protoplast）：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。
（二）优点/特点
1. 满足基础研究的需要。
2. 除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，同时也为制造新杂种开辟了道路。
3. 原生质体可摄入外源DNA，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。
  4. 获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。
（三）植物原生质体的应用
1. 研究植物细胞壁的再生机理、膜的透性以及
离子在植物细胞膜上的转运、细胞分裂与细胞分化、摄入细胞器、病毒侵染机理等基础理论；
2. 实现细胞融合和细胞杂交；
3. 实现细胞对外源基因、DNA片段、细胞器、染色体的捕获。
★原生质体是细胞杂交、遗传转化、作物改良的理想材料。
（二）原生质体培养的目的及意义

二、原生质体培养
（一）原生质体研究历史与现状
v 1880年，原生质体一词出现。Hanstein首次使用原生质体一词，植物学上是指植物细胞通过质壁分离后可以和细胞壁分开的那部分细胞质。
v 1892年，Klercker用机械法从藻类中分离得到原生质体。
v 1960年，英国植物生理学家Cocking开创了酶解法大规模分离原生质体的新时期。
v 1970年以后进入活跃发展期。
v 1971年，Takele等首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。
v 1985年，Fujimura等获得第一例禾谷类作物——水稻原生质体培养的再生植株。
v 1986年，Spangenberg等首次得到甘蓝型油菜原生质体培养的再生植株。
v 1983，1987和1991年的第六，七，八届国际原生质体会议，确定了原生质体在基因操作应用中的地位。
v 80年代中期，约有100种植物获得成功。
v 80年代末，成功再生植株的种类增加到了212种。
据统计：
v 至今原生质体培养可形成胚状体并再生植株或芽的种类已经达到367种，分布于46科，160属，其中成功报道最多的是茄科，其次是豆科、禾本科、菊科、十字花科、伞形科、蔷薇科。
v 近30年来，植物原生质体研究已成为细胞生物学、生物工程等学科中发展较快的一个分支，而且通过多方面的探索，学者们已经普遍认识到原生质体作为生物试验系统的巨大潜力，并且在生理学、遗传学、病理学、病毒学和育种学等研究中得到了广泛的应用。
我国的情况：
我国从20世纪70年代开始原生质体培养和体细胞杂交研究。目前已从原生质体培养获得再生植株的有：烟草、曼佗罗、龙葵、苜蓿、胡罗卜、油菜、甘蓝、怀地黄（玄参科）、小麦等等。    

（二）原生质体的分离与纯化
1.1 材料来源 叶肉细胞
1.2 植物材料的预处理或预培养
目的
（1）提高原生质体的活力和分裂频率。
改变细胞和细胞壁的生理状态，增加细胞膜的强度，提高细胞壁酶解的效率，减少原生质体损伤。
（2）逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。
主要的预处理方法（4种）
§光处理
叶片于日光或灯光下→ 2—6h →萎蔫→利于撕除下表皮及原生质体分离；
§预培养
叶片→除去下表皮→诱导愈伤的培养基上→培养7d→酶消化去壁→得原生质体→分裂频率较高。 羽衣甘蓝叶片
§暗处理
室温下生长5—7个星期的材料→黑暗中放置≥30h →叶片制备原生质体→有活力。
§低温处理
夏季应用的实验材料其萌动种子应于4℃过夜后再播种，从其植株叶片上分离的原生质体培养效果较佳。
龙胆试管苗的叶片→ 4℃低温处理→分离原生质体:才能分裂
1.3 分离方法
（1）机械法分离（Mechanical isolation）
Klercker 1892年。过程：
细胞(叶肉细胞/愈伤组织/悬浮培养细胞)→高渗的糖溶液中→质壁分离→原生质体收缩成球形→利刃切割→获得少量完整的原生质体
优点：能排除酶的有害影响。
缺点：(1) 原生质体的产量低；(2) 方法繁琐费力； (3) 局限性大。不适于由分生细胞和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体。
（2）酶解法分离（Enzymatic isolation）
分离原生质体的酶混合液至少包括：
①酶制剂：纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、崩溃酶、蜗牛酶等。
②原生质膜稳定剂
A.葡聚糖硫酸钾：0.2～0.3%；降低酶液中核酸酶的活力; B.钙离子(CaCl2 • 2H2O)和 KH2PO4 ：0.01mol/L左右,稳定膜; C. 牛血清蛋白：保护细胞器
③渗透压稳定剂:甘露醇、山梨糖醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度0.2 ～0.8 mol/L。 。
酶解法分离注意事项：
首先要考虑植物材料的正确选择。
当植物处于最佳生长状态时取材,分离的效果最为理想.
其次,要选择合适的水解酶种类、组合及浓度。
此外,还必须控制好酶解条件。
影响酶解过程的主要因素有温度、pH值、渗透压、离子浓度、振荡及预处理等。
酶解法分离主要优缺点（重点）
优点：(1) 原生质体的产量高； (2) 方法简便快捷； (3) 使用范围广。用于几乎所有的植物材料。
缺点：酶制剂不纯，影响原生质体的活力。
原生质体的分离
常用的分离方法是“一步法”， 即把一定量的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处理一次即可得到分离的原生质体。
2. 原生质体的纯化
2.1 离心沉淀法
原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。
步骤：过滤→洗涤

优点：纯化收集方便、操作简单、原生质体丢失少。
缺点：重新悬浮时易造成原生质体损伤，且纯度不好。
2.2 漂浮法
原理：应用渗透剂含量较高的清洗液使原生质体漂浮在液体的表面。
步骤：过滤→洗涤

优点：原生质体较为纯净，避免损伤，试剂简单，成本低廉。
缺点：原生质体获得率较低。
2.3 梯度离心法
原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。离心后原生质体在两液相的界面之间。
步骤：过滤→离心→吸取→培养液悬浮→原生质体+培养液
优点：原生质体较为纯净，避免损伤，试剂简单，成本低廉。
缺点：原生质体获得率较低。
3.原生质体活力测定
3.1 形态识别
活的原生质体：形态完整，呈圆形，有饱满的细胞质，颜色鲜艳。
3.2 染色识别
v 1)0.1%酚番红或依文思(Evans)蓝染色法： 不被染色的有活力，染色的死亡。
v 2)双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微镜下有荧光的为有活性的。
4. 原生质体的计数
取少量原生质体+培养液，用血细胞计数器在显微镜下计数；用新鲜原生质体培养液将密度调到103~105个/mL(合适浓度)。
（三）原生质体培养
1. 培养基
与普通培养基的区别：
（1）大量元素
规律：原生质体培养基中大量元素的浓度应比愈伤组织培养基中的的低。
对原生质体培养效果影响最大的因素：
① Ca2+浓度：较高对分裂有利；
②氮源的种类和浓度：尽量少用铵态氮，提高硝态氮或有机氮源。
（2）渗透压调节剂
规律：再生细胞壁之前，等渗环境；之后，低渗环境，随细胞壁的再生和细胞的持续分裂，逐渐降低渗透压。
常用渗压剂：甘露醇、山梨醇等。
（3）有机附加物
天然的附加物：椰乳、酵母提取物。
2. 培养方法（重点）

2.1 平板培养（固体培养）法

优点：（1）既无伤害原生质体，又保证其均匀分布；（2）便于定点观察。
缺点：（1）操作有难度，温度不好控制；（2）通气不好。
2.2 液体浅层培养法
含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层 。
优点：操作简便，分散好，通气好。
缺点：（1）不便定点观察，会造成大面积污染；（2）各层厚度不一致，易造成营养不良或过剩。
2.3 双层培养法（固、液培养）目前国内较为流行。
培养皿底部铺一层固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。
优点：(1)原生质体可吸收双层营养； (2)防止蒸发，保持原生质体周围水分含量。
2.4 饲养层培养法（滋养层/看护培养法）
利用饲养层的原生质体刺激培养层的原生质体启动分裂。
3. 原生质体培养环境条件
3.1 光强 黑暗或弱光。
3.2 湿度 高湿环境。避免水分蒸发使原生质体脱水死亡。
3.3 温度 25～28℃
4. 原生质体的再生

细胞壁的再生
细胞的再生（大量愈伤组织）
再生 产生胚状体（心型、鱼雷型）
器官再生
植株再生
三、体细胞杂交
（一）体细胞杂交的意义
（二）体细胞杂交的程序
（三）杂种细胞的选择
（四）杂种细胞的培养及再生
（五）杂种细胞或植株的鉴定
定义：体细胞杂交也叫做原生质体融合，使分离出来的不同亲本的原生质体，在人工控制条件下，相互融合成一体，形成杂种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术。
（一）体细胞杂交的意义
1. 克服远源杂交不亲合的障碍
打破了不同种生物间的生殖隔离限制，大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围。
2. 产生新的核外遗传系统
体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统,在杂种的分裂和增殖过程中，双亲的叶绿体、线粒体、DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。
（二）体细胞杂交的程序（步骤）
1亲本原生质体的分离 2亲本原生质体的诱导融合 3杂种细胞的选择 4杂种细胞的培养和再生 5杂种植株的鉴定
体细胞杂交的程序之二——诱导融合
1. 定义 用一定的物理或化学方法诱导，使不同细胞相互融合。
2. 方法
2.1 化学诱导法
（1）NaNO3融合法 （2） 高钙、高pH、高温融合法 （3）聚乙二醇(PEG)结合高钙-高pH融合法
聚乙二醇(PEG)结合高钙-高pH融合法
1974年，由加拿大籍华人高国楠提出。将体细胞融合的研究推进到一个新阶段。
具体做法：在无菌条件下适当比例混合双亲原生质体→滴加28～58%PEG溶液，摇匀，静置15～30min→用高钙(50 mmol/L CaCl2)-高pH(10.5)溶液清洗数次→ 离心获得原生质体细胞团→ 筛选→再生杂合细胞
优点：（1）融合频率高；（2）可重复性强；（3）诱发融合无特异性：植物+植物；植物+动物；动物+动物；动物+微生物；植物+微生物。（4）毒性较低。
2.2 物理诱导法
（1）离心融合法
将原生质体经一定速度与时间的离心诱导融合。
（2）电融合法
用高强度的电脉冲刺激，使质膜发生可逆的电击穿，从而导致融合。
体细胞杂交的程序之三——
（三）杂种细胞的选择
1．互补选择法
（1）互补选择法的操作
将A、B、AA、BB、AB细胞的产物连续进行两次不同的培养：
第一次：
适合A但不适合B的培养条件。一段时间后，存活3种细胞：A、AA、AB。
第二次：
适合B但不适合A的培养条件。一段时间后，只存活1种细胞：AB
（2）互补选择法的原理
① 营养缺陷型互补

② 抗性互补
2. 机械分离法
依据：利用两种原生质体的某些可见标志，对融合产物进行鉴别，在其可辨特征消失之前将杂种融合细胞从混合群体中挑选出来进行单独培养。
必需的3个前提条件：
（1）两亲本原生质体有明显不同的形态标志。 （2）特殊的培养皿 。（3）特殊的培养基。 将杂种细胞所在的小穴号码记下来，用微管吸取出来。
3. 荧光染色分类法
异硫氰酸荧光素（FITC）：绿色
异硫氰酸罗丹明（RITC）：红色
将A、B原生质体融合前分别用两种荧光染色，融合后发两种荧光的细胞就是AB融合细胞。
诱导后以细胞分类器进行选择收集。

体细胞杂交的程序之四——
（四）杂种细胞的培养和再生
同原生质体培养方法，即平板培养法、液体浅层培养法、双层培养法等。
杂种细胞的密度、光照条件、温度、湿度均同原生质体培养的。
体细胞杂交的程序之五——
（五）杂种细胞或杂种植株的鉴定
· 形态学分析法
· 细胞学法（染色体组型法）
· 同工酶分析法
· 分子生物学分析法
1. 形态学分析法
对再生植株器官的形态与亲本植株进行比较：
若具备双亲共同形态特征则为杂种后代；若只有亲本其一的形态特征，则排除。
注意：经愈伤组织诱导再生植株的变异有时与杂种细胞产生的形态变异很难区别。
2. 细胞学法（染色体组型法）
以两亲本染色体特征为对照，对杂种细胞染色体数目、长短、大小、染色反应、配对情况等进行比较。
两亲本上述特征越明显，鉴定的结果就越准确。
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