一株血红栓孔菌的多糖抗氧化及抗Huh7肝癌细胞的活性_胡鑫.pdf

Research paper 研究论文 22 March 2023,42(3):793-807 菌物学报 Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q Doi:10.13346/j.mycosystema.220222 资助项目：特色食用菌种质资源创新研究与菌种繁育关键技术集成示范(XZ202001ZY0041N)This work was supported by the Innovative Research of Characteristic Edible Fungi Germplasm and Integrated Demonstration of Key Techniques for Strain Breeding(XZ202001ZY0041N).*Corresponding author.E-mail: ORCID:HU Xin(0000-0001-5282-0282),FU Junsheng(0000-0001-9854-2980)Received:2022-06-17;Accepted:2022-07-20 Copyright 2023 Institute of Microbiology,CAS.All rights reserved.| Http:/journals- Tel:[phone] 菌物学报 793 一株血红栓孔菌的多糖抗氧化及抗 Huh7 肝癌细胞的活性 胡鑫1,2，杨若菊1，吴丁兴1，朱雪峰3，吴小平1,2，傅俊生1,2*1 福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002 2 福建农林大学菌物研究中心，福建 福州 350002 3 西藏自治区农牧科学院蔬菜研究所，西藏 拉萨 850000 摘 要：对一株野生栓孔菌属的真菌子实体进行分离鉴定，探究其生长特性，并比较菌丝体胞内多糖和发酵液胞外多糖的抗氧化作用、抑癌活性及多糖组分。研究结果显示，该菌株经鉴定为血红栓孔菌Trametes sanguinea，菌丝生长最适条件碳源为甘露糖，氮源为酵母浸提物，pH值为6.0，温度为 35；胞外多糖比胞内多糖更具有化学抗氧化能力，当多糖浓度为 5 mg/mL 时，胞内多糖对DPPH、ABTS 和羟自由基的清除率分别为 57.54%、97.20%和 36.40%，铁离子还原力的 FRAP 值为1.14 mmol/L，而胞外多糖对 DPPH、ABTS 和羟自由基的清除率分别为 63.88%、99.36%和40.99%，FRAP 值为 2.34 mmol/L；胞外多糖的抑癌活性强于胞内多糖，在供试浓度下多糖溶液对LO2 细胞无毒副作用，但能明显抑制 Huh7 细胞增殖，胞内和胞外多糖的 IC50值分别是 4.154 和2.894 mg/mL；进一步对比分析其单糖的组分和含量，发现除了葡萄糖、盐酸氨基葡萄糖、甘露糖和半乳糖外，胞外多糖比胞内多糖还多了岩藻糖、葡萄糖醛酸和木糖，胞内多糖中仅有葡萄糖含量高于胞外多糖，这表明胞内多糖与胞外多糖活性可能与其单糖组成和含量有关。这为血红栓孔菌资源的进一步开发利用提供参考资料。关键词：血红栓孔菌；培养特性；抗氧化；抗癌 引用本文 胡鑫，杨若菊，吴丁兴，朱雪峰，吴小平，傅俊生，2023.一株血红栓孔菌的多糖抗氧化及抗 Huh7 肝癌细胞的活性.菌物学报，42(3):793-807 Hu X,Yang RJ,Wu DX,Zhu XF,Wu XP,Fu JS,2023.Antioxidant and anti-Huh7 hepatocarcinoma cell activities of polysaccharides from a strain of Trametes sanguinea.Mycosystema,42(3):793-807 胡鑫 等/一株血红栓孔菌的多糖抗氧化及抗Huh7肝癌细胞的活性 研究论文 菌物学报 794 Antioxidant and anti-Huh7 hepatocarcinoma cell activities of polysaccharides from a strain of Trametes sanguinea HU Xin1,2,YANG Ruoju1,WU Dingxing1,ZHU Xuefeng3,WU Xiaoping1,2,FU Junsheng1,2*1 College of Life Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,Fujian,China 2 Mycological Research Center,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,Fujian,China 3 Vegetable Research Institute,Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences,Lhasa 850000,Tibet,China Abstract:A wild Trametes strain was isolated and identified.Its growth characteristics and the antioxidative effects and antitumor activities of intracellular polysaccharide in mycelium and extracellular polysaccharides in fermentation broth were investigated.The strain was identified as Trametes sanguinea.The optimum carbon source was mannose,and the nitrogen source was yeast extract.The mycelia grew well at pH value of 6.0 and temperature of 35 C.Extracellular polysaccharide showed more antioxidant capacity than intracellular polysaccharide.Under polysaccharide concentration of 5mg/mL,the scavenging rates of intracellular polysaccharide on DPPH,ABTS and hydroxyl radicals were 57.54%,97.20%and 36.40%respectively,and FRAP value of iron ion reducing power was 1.14 mmol/L,while the scavenging rates of extracellular polysaccharide on DPPH,ABTS and hydroxyl radicals were 63.88%,99.36%and 40.99%respectively,and the FRAP value was 2.34 mmol/L.The antitumor activity of extracellular polysaccharides was stronger than that of intracellular polysaccharides.The polysaccharide solution had no side effects on LO2 cells,but could significantly inhibit the proliferation of Huh7 cells.The IC50 values of intracellular and extracellular polysaccharides were 4.154 and 2.894 mg/mL,respectively.Further analysis of the monosaccharide composition and content found that besides glucose,glucosamine hydrochloride,mannose and galactose,extracellular polysaccharide additionally contained fucose,glucuronic acid and xylose,which were absent in intracellular polysaccharides.In intracellular polysaccharides,only glucose level was higher in comparison with the content of monosaccharide in the extracellular polysaccharide,suggesting that the intracellular and extracellular polysaccharide activity may be related to monosaccharide composition and content.This provides reference for further development and utilization of T.sanguinea resources.Keywords:Trametes sanguinea;culture characteristics;antioxidant;anti-cancer 血红栓孔菌 Trametes sanguinea(L.)Lloyd也称血红密孔菌，隶属于担子菌门、蘑菇纲、多孔菌目、多孔菌科(Cui et al.2019)。血红栓孔菌生长在针阔叶树倒木上，是一种常见的多孔菌(Dai 2012；Wu et al.2020)，其活性成分种类比较丰富，包括多糖、萜类和甾醇等，具有抑菌、抗肿瘤、去风湿和止血等药用价值，目前对它的活性研究较少(卯晓岚 2000；鲁铁和图力古尔 2013；Wu et al.2019)。血红栓孔菌含有多种酶，其中漆酶在食品、环保、造纸、检测等行业应用广泛(王宁宁 2018)，也可用于纺织工业中染料污染废水的脱色和解毒(Garcia et al.2006)。多糖是真菌的主要活性成分之一，由 10 个以上的单糖分子脱水和缩合形成，是每个单糖分Research paper 22 March 2023,42(3):793-807 Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q 菌物学报 795 子通过糖苷键连接而成的天然高分子聚合物(Jin et al.2020)。天然多糖具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降血糖和调节肠道菌群等功效(於雨碟等 2021；王文丽等 2022)。目前，人们通过液体发酵来获得大量真菌多糖。多糖包括胞内多糖(intracellular polysaccharides,IPS)和胞外多糖(extracellular polysaccharides,EPS)(Feng et al.2019)，胞内多糖大部分以糖原形式存在，位于原生质膜内侧或作为原生质膜的组分；胞外多糖是指菌丝体在生长代谢过程中分泌到液体培养基中的糖类化合物，属于次级代谢产物。二者在生物体内行使着多种生物学功能，活性与结构均存在一定的差异(包怡红等 2012；刘城移等 2020)。灵芝液体发酵的胞外多糖对 DPPH 自由基的清除活性和 Fe2+螯合能力高于胞内多糖，而对羟自由基的清除活性低于胞内多糖(罗钦和徐军伟 2021)。韩洪坤等(2011)利用铁离子还原法(FRAP)测定中国被毛孢菌丝体热水和乙醇提取物抗氧化活性，发现均具有一定的抗氧化活性。刘柯灵等(2021)研究发现，古巴栓孔菌的胞内多糖对 ABTS 自由基、DPPH 自由基和超氧阴离子的清除能力强于胞外多糖。此外，大量研究证明，多糖还具有其他功效，如李木霞(2019)发现血红栓孔菌多糖对硫酸葡聚糖诱导的慢性免疫疾病炎症性肠炎(IBD)具有明显的治疗作用，可缓解结肠肠道炎症反应，调节机体内免疫平衡。Feng&Tian(2021)经研究发现凤尾参多糖在体外可抑制 S180 肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡。谢飞等(2016)研究发现野生蝉花多糖在体内外均可显著达到抗肿瘤效果，并呈剂量效应地抑制肿瘤细胞生长。此外，还有研究发现黑木耳多糖能调节肠道菌群，达到降脂、抗炎的作用(郝敏等 2021；张廷婷等 2021)。目前，国内外关于血红栓孔菌遗传多样性、培养条件以及其发酵产物的抗氧化能力、抑癌活性等方面的研究报道不多。为此，本研究将形态学观察和分子生物学相结合对分离的血红栓孔菌进行鉴定。利用单因素试验开展生物学特性观察，探究其最适生长条件。同时比较分析胞内和胞外多糖对清除 DPPH、ABTS、羟自由基的能力及铁离子还原力和抗癌活性，从而为血红栓孔菌资源的进一步研究提供基础资料和参考价值。1 材料与方法材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 材料 供试血红栓孔菌子实体于 2021 年在福建省三明市尤溪县西滨镇采取。人正常肝细胞 LO2、人肝癌细胞 HuH7，均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。1.1.2 主要试剂 四甲基偶氮唑盐(MTT)、ABTS+、DPPH 购于Sigma 公司；真菌 DNA 提取试剂盒购于 OMEGA公司；RPMI1640 细胞培养液、青霉素-链霉素、胎牛血清购自 Gibco 公司；二甲基亚砜、果糖、葡萄糖等试剂购于国药集团化学试剂有限公司。1.1.3 培养基 加富固体培养基(PDA)：土豆 200 g，葡萄糖 20 g，蛋白胨 5 g，MgSO4 1.5 g，K2HPO4 2 g，VB1 10 mg，琼脂 20 g，水 1 L，pH 值自然。加富液体培养基(PDB)：土豆 200 g，葡萄糖 20 g，蛋白胨 5 g，MgSO4 1.5 g，K2HPO4 2 g，VB1 10 mg，水 1 L，pH 值自然。碳源探究培养基：土豆 200 g，碳源(葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、淀粉)20 g，蛋白胨 5 g，MgSO4 1.5 g，K2HPO4 2 g，VB1 10 mg，琼脂 20 g，水 1 L，pH 值自然。氮源探究培养基：土豆 200 g，葡萄糖 20 g，氮源(脲、酵母粉、硫酸铵、牛肉粉、蛋白胨、硝酸铵)5 g，MgSO4 1.5 g，K2HPO4 2 g，VB1 10 mg，琼脂 20 g，水 1 L，pH 值自然。pH 探究培养基：土豆 200 g，葡萄糖 20 g，蛋白胨 5 g，MgSO4 1.5 g，K2HPO4 2 g，VB1 10 mg，琼脂 20 g，水1 L，配置 1.0 mol/L NaOH 和 1.0 mol/L HCl 溶液来调节培养基 pH，分别为 5.0、6.0、7.0、8.0、胡鑫 等/一株血红栓孔菌的多糖抗氧化及抗Huh7肝癌细胞的活性 研究论文 菌物学报 796 9.0。温度探究培养基：加富 PDA 培养基，pH值在 7.0 左右，设置温度梯度分别为 15、20、25、30、35、40。1.2 方法 1.2.1 供试菌株的形态学鉴定 参照李海蛟(2013)的方法观察子实体外观形态，对菌丝体形态进行观察记录。菌丝形态特征使用插片法(金珊珊等 2018)观察，将已活化好的供试菌株接入平板 PDA 培养基正中央，在距离菌块 1 cm 处，将已灭菌的盖玻片斜插入培养基中(倾斜 45)，25 避光培养；待菌丝平铺至盖玻片上，制成切片于显微镜下观察菌丝形态；并在其产孢后，收集制片，于显微镜下观察拍照。1.2.2 分子生物学鉴定 供试菌株 DNA 的提取：将收集到的供试菌株菌丝，按照真菌 DNA 提取试剂盒说明书操作。ITS 序列检测：ITS 序列扩增引物为 ITS1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)和 ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)。PCR 反应体系：总反应体系 25 L。其中 2Fine Taq PCR SuperMix(+dye)12.5 L，引物 ITS1、ITS4 各1 L，模板 DNA 1 L，ddH2O 9.5 L。经 PCR扩增后，获得的产物送至福州白鲸生物科技有限公司测序。ITS 序列分析：将 ITS 序列输入 GenBank 数据库中(http:/www.ncbi,nlm.nih.gov)进行 BLAST比对，选取下载同源性较高的 ITS 序列进行多序列比对，判断供试菌株种性的分类学地位。1.2.3 供试菌株生物学特性 利用打孔器将活化的菌饼(直径 6 mm)接种于供试的碳源、氮源和 pH 试验培养基中，放置在 25 培养箱中避光培养；温度探究试验将已接种好的平板培养基分别放入不同温度的恒温培养箱中避光培养。每个处理 5 个重复。以十字交叉法测量菌丝长度，待菌丝体直径长至平板的2/3 后，停止培养，测量记录并拍照。菌丝生长速率(cm/d)=菌落直径长度(cm)/培养天数(d)1.2.4 胞内、胞外粗多糖的制备 参考张居作等(2015)的方法稍作修改。供试菌株于 PDB 培养基中培养 10 d 后，离心，分别收集上清液和菌丝备用。胞内粗多糖制备：收集的菌丝用蒸馏水清洗 3 遍，真空冷冻干燥后，研磨成粉，按料(g):液(mL)=1:20 加入 75%乙醇，超声 2 h，离心取滤渣，按料(g):液(mL)=1:30 加入蒸馏水，90 浸提 2 h，真空抽滤，取滤液，重复次，合并滤液；于旋转蒸发仪中浓缩滤液至原体积的 1/3 后，加入 4 倍体积的无水乙醇，4 静置过夜；离心取沉淀，加水复溶；加入等体积的 Sevage 溶液(氯仿:正丁醇=4:1)搅拌，10 000 r/min 离心 3 min，取上清液，重复 2 次，流水透析 48 h，冷冻干燥得胞内粗多糖。胞外粗多糖制备：将收集的上清液浓缩至原体积的 1/3，加入 4 倍体积的无水乙醇，4 静置过夜；离心取沉淀，加水复溶，用 Sevage 法除蛋白，流水透析，冷冻干燥得胞外粗多糖。1.2.5 多糖化学抗氧化活性测定 样品处理：准确称量 10 mg 粗多糖，溶于2 mL 去离子水配置成 5 mg/mL 的粗多糖溶液，加去离子水将其依次稀释为 0.025、0.05、0.25、0.5、1、2 和 5 mg/mL 粗多糖溶液。阳性对照组Vc 溶液的浓度依次为 0.025、0.05、0.25、0.5、1、2 和 5 mg/mL。DPPH 自由基清除能力测定：参照Saiga et al.(2003)的方法并稍作改动。用无水乙醇溶解，准确配置 0.2 mmol/L DPPH 溶液。96 孔板中依次分别加入 100 L 不同浓度的多糖溶液和 100 L 0.2 mmol/L DPPH 溶液，轻轻振荡混匀，25 避光反应 30 min，利用酶标仪测 517 nm 处 OD 值，记为 At。空白组和对照组的 OD 值以无水乙醇分别替代多糖样品和 DPPH 的反应体系，检测值记为 Ac、Ap。设 5 个平行。计算公式为：DPPH 自由基清除率(%)=1(AtAp)/Ac100 Research paper 22 March 2023,42(3):793-807 Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q 菌物学报 797 ABTS 自由基清除能力测定：参照Miller et al.(1993)的方法并稍作改动。ABTS+母液制备：吸取 7.0 mmol/L ABTS 溶液 5 mL 及 2.45 mmol/L过硫酸钾溶液 88 L，混匀后室温避光静置1216 h。ABTS+工作液制备：去离子水稀释ABTS+母液，使其 OD734值为 0.7000.023，30 避光静置 30 min。样品组为分别吸取 100 L 不同浓度的多糖溶液和 100 L ABTS+工作液，依次加入96孔板中，混匀后25 避光放置20 min，于 734 nm 处测 OD 值，记 At。空白组和对照组的吸光值以去离子水分别替代多糖样品和ABTS，记为 Ac、Ap。设 5 个平行，求均值。计算公式为：ABTS 自由基清除率(%)=1(AtAp)/Ac100 羟基自由基清除能力测定：参照张鹏等(2019)的方法，略做调整。准确配置 9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液、9 mmol/L 硫酸亚铁溶液、8.8 mmol/L H2O2溶液。在 96 孔板中依次加入75 L不同浓度的多糖溶液和15 L FeSO4溶液、水杨酸-乙醇溶液及H2O2溶液，37 水浴反应30 min，测定 510 nm 波长处 OD 值，记为 At。空白组和对照组的 OD 值以去离子水分别代替多糖样品和 H2O2溶液，记为 Ac和 Ap。设 5 个平行，求均值。计算公式为：羟自由基清除率(%)=1(AtAp)/Ac100 铁离子还原力测定：FRAP 测定参照 Benzie&Strain(1996)的方法并稍作改动。FRAP 工作液的配制：按 10:1:1 的比例分别取 0.3 moI/L 醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 3.6)、0.02 mol/L FeCl3溶液及 0.01 mol/L TPTZ 溶液配置成混合液，现用现配。吸取 0.025、0.1、0.15、0.2、0.4、0.5、0.8、1.0 和 1.5 mmol/L 的 FeSO4溶液 0.5 mL，分别加入 3.0 mL FRAP 工作液，振荡混匀后 37 反应 15 min，测 593 nm 处吸光值，制作标准曲线。样品 FRAP 测定：参照标准曲线操作步骤测定各反应体系在 593 nm 处的吸光值。其中，样品组反应体系的OD值为多糖样品溶液与FRAP工作液，记为 At；空白组和对照组的吸光值为去离子水分别替代多糖样品和 FRAP，记为 Ac和 Ap。得到 AtAcAp的差值在标准曲线上获得相应的FeSO4浓度，记为 FRAP 值。1.2.6 多糖对 LO2 细胞的生长作用 参照戚梦等(2018)的方法将对数生长期的LO2 细胞稀释至 1105个/mL，按照每孔 100 L接种至 96 孔板中，于 5%CO2、37 的细胞培养箱中培养。其中对照组和处理组为含有细胞的细胞培养液，空白组为不含细胞的细胞培养液。待细胞完全贴壁后，吸去培养液；对照组中加入细胞培养液，处理组中分别加入含不同浓度多糖(0.025、0.05、0.25、0.5、1、2 和 5 mg/mL)的细胞培养液，培养 24 h 后除上清，各孔加入5 mg/mL MTT 100 L，培养 4 h 后弃上清；最后加入 150 L 二甲基亚砜(DMSO)，轻振混匀至紫褐色沉淀完全溶解，使用酶标仪在 490 nm 波长处测 OD 值。每组 5 个平行。计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(OD处理组OD空白组)/(OD对照组OD空白组)100 1.2.7 多糖对肝癌细胞的抑制作用 参照 1.2.6 的方法利用 MTT 法检测 Huh7 细胞活力。1.2.8 多糖组分测定 取 16 种单糖标准品(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D 氨基葡萄糖、古罗糖醛酸和甘露糖醛酸)配成标准母液溶液。参照文愉熙等(2022)的方法，精密称取 10 mg 样品置于安瓿瓶中，加入 10 mL 3 mol/L 三氟乙酸溶液(TFA)，120 水解 3 h。准确吸取酸水解溶液转移至管中，用氮吹仪吹干，加入 10 mL 水涡旋混匀，吸取 100 L 加入 900 L 去离子水中，12 000 r/min 离心 5 min。取上清进行 IC 分析。离子色谱检测条件为色谱柱：DionexCarbopacTMPA20(3*150)；流动相：A：H2O；B：15 mmol/L NaOH；C：15 mmol/L NaOH 和 100 mmol/L NaOAC；流 胡鑫 等/一株血红栓孔菌的多糖抗氧化及抗Huh7肝癌细胞的活性 研究论文 菌物学报 798 速：0.3 mL/min；进样量：5 L；柱温：30。1.3 数据统计和分析 用 SPSS 26.0 软件进行数据处理分析，数值用 xs 表示，利用 t 检验、LSD 检验分析组间显著性，其中 P0.05 表示存在显著差异，P淀粉葡萄糖蔗糖果糖麦芽糖(图 2A)。在氮源试验中，除脲组外血红栓孔菌均能生长，其中，菌丝在酵母 图 1 待测菌株的形态学观察 A：子实体形态.B，C：菌落形态.D，E：菌丝形态.D、E 图中箭头指向为锁状联合.F，G：孢子.F、G 图中箭头指向为孢子.标尺=50 m Fig.1 Morphological observation of the strain to be tested.A:Fruiting body.B,C:Colony on PDA.D,E:Mycelium.Arrows in figures D and E point to clamp connection.F,G:Conidiophores.Arrows in figures F and G point to conidiophores.Bars=50 m.Research paper 22 March 2023,42(3):793-807 Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q 菌物学报 799 图 2 不同培养条件对血红栓孔菌菌丝生长的影响 A：菌丝在不同碳源下的生长速度.：蔗糖；：甘露糖；：麦芽糖；：淀粉；：葡萄糖；：果糖.B：菌丝在不同氮源下的生长速度.：脲；：酵母浸提粉；：硫酸铵；：牛肉粉；：蛋白胨；：硝酸铵.C：菌丝在不同温度下的生长速度.：15；：20；：25；：30；：35；：40.D：菌丝在不同 pH 下的生长速度.：5.0；：6.0；：7.0；：8.0；：9.0.柱形图上标记的小写字母表示同一指标标注相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著，P0.05 Fig.2 Effects of different culture conditions on mycelial growth of Trametes sanguine.A:Growth rate of mycelium under different carbon sources.:Sucrose;:Mannose;:Maltose;:Starch;:Glucose;:Fructose.B:Growth rate of mycelium under different nitrogen sources.:Urea;:Yeast extract powder;:Ammonium sulfate;:Beef powder;:Peptone;:Ammonium nitrate.C:Growth rate of mycelium at different temperatures.:15 C;:20 C;:25 C;:30 C;:35 C;:40 C.D:Growth rate of mycelium at different pH.:pH 5.0;:pH 6.0;:pH 7.0;:pH 8.0;:pH 9.0.The lowercase letters marked on the column chart indicate that the same index marked with the same letter means that the difference is not significant,while different letters mean that the difference is significant,P蛋白胨硫酸铵硝酸铵牛肉粉脲(图 2B)。菌丝生长对温度比较敏感，且在高温条件下菌丝体的生长速度更旺盛，菌丝在 15 不能生长，35 生长最佳，20 长势最弱，供试温度下血红栓孔菌菌丝体生 长 速 度 由 大 到 小 依 次 为 35 40 30 25 20 15 (图 2C)。在 pH 值试验中，菌丝在 pH值为 5.09.0条件下均能生长，当 pH 值为 6.0 时，长势最佳，pH 值为 5.0、7.0时次之，在供试 pH 值下菌丝生长速度依次为6.05.07.08.09.0(图 2D)。综合菌丝生长速度及菌丝长势、粗细等，菌株菌丝培养的最适碳源为甘露糖，其次为淀粉；最适氮源为酵母浸提粉，其次为蛋白胨；最适温度为 35；最适 pH 值为 6.0。2.4 胞内与胞外多糖的化学抗氧化活性比较 DPPH 自由基是一种合成的、具有单电子、稳定的、以氮为中心的顺磁化合物。此法快速稳定重现性好，被用作评价抗氧化物自由基清除能力的常用方法(熊双丽等 2012)。DPPH 自由基清除率与多糖质量体积浓度呈正相关(图 3A)，当浓度为 5 mg/mL 时，清除率最高，分别为63.88%、57.54%。ABTS 为水溶性自由基引发剂，图 3 血红栓孔菌中胞内与胞外多糖抗氧化活性比较 A：DPPH 自由基清除能力.B：ABTS 自由基清除能力.C：OH 自由基清除能力.D：铁离子还原力.Vc 为阳性对照；IPS 为胞内多糖；EPS 为胞外多糖 Fig.3 A comparison of antioxidant activities between intracellular and extracellular polysaccharides in Trametes sanguine.A:DPPH free radical clearance ability.B:ABTS free radical clearance ability.C:OH free radical clearance ability.D:Ferric reducing antioxidant power.Vc is a positive control;IPS:Intracellular polysaccharides;EPS:Extracellular polysaccharides.Research paper 22 March 2023,42(3):793-807 Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q 菌物学报 801 遇到抗氧化活性的物质时，溶液颜色变浅，吸光值降低(Liu et al.2016)。两种多糖对 ABTS 自由基有一定的清除作用(图3B)，随着多糖质量浓度的增加，清除率上升，且胞外多糖在各个供试浓度值对应的清除率均显著高于胞内多糖。随着胞外多糖浓度的增加，其清除率能力逐渐平缓。当浓度为 5 mg/mL 时，清除率最高分别为 99.36%、97.20%，与 0.55 mg/mL Vc 的效果相当，表现出很好的清除活性。羟自由基是一种氧化能力强、寿命短、氧化效率高、反应速度快的自由基，能够攻击生物大分子而造成损伤，对生物体危害极为严重(李云等 2014；Zhang et al.2016)。羟自由基清除率与多糖质量体积浓度呈正相关(图 3C)，当浓度为 5 mg/mL 时，清除率最高，分别为 40.99%、36.40%。结果表明，胞内外多糖具有一定的羟基自由基清除能力，但效果弱于阳性对照 Vc。常被用来评价抗氧化剂总抗氧化活性的评价指标还有物质的还原能力。FRAP 法就是利用 Fe3+可被还原成 Fe2+，使其与 TPTZ 反应后呈蓝色。还原力越强，抗氧化活性就越高(Meir et al.1995；袁博等 2018)。试验以 FeSO4浓度为横坐标、吸光值为纵坐标作标准曲线，回归方程为：y=0.470 1x0.147，相关系数 R2=0.991 2。两种多糖都具有一定的还原能力(图 3D)，随着多糖质量浓度的增加，还原力呈剂量依赖性逐渐增强，且胞外多糖还原能力强于胞内多糖，在多糖质量浓度为 5 mg/mL 时，FRAP 的值最高，分别是 2.34 mmol/L、1.14 mmol/L；在胞外多糖浓度为 5 mg/mL 时，FRAP 的值与 Vc接近，表明胞外多糖在该浓度时，具有很强的抗氧化能力。2.5 血红栓孔菌多糖对细胞毒性的影响 通过 MTT 法检测血红栓孔菌多糖对细胞的毒性作用(图 4)。结果表明，两种多糖均对LO2 细胞形态无明显影响，在多糖质量浓度为5 mg/mL 时胞内和胞外多糖组的细胞存活率分别为 95.80%和 90.72%，无显著差异(图 4A，4B)。血红栓孔菌多糖可抑制 Huh7 肝癌细胞的增殖(图 4C，4D)，随着多糖浓度的增加，胞内和胞外多糖均明显抑制 Huh7 细胞的增殖，降低细胞的存活率，且在统一浓度下，胞外多糖抑制活性高于胞内多糖，胞内和胞外多糖的 IC50值分别是 4.154 mg/mL 和 2.894 mg/mL。通过显微观察细胞形态变化，与对照组(0 mg/mL)相比，经多糖处理后的 Huh7 肝癌细胞数量随着浓度的增加明显减少，贴壁细胞逐渐脱壁，形态变化明显，细胞逐渐皱缩。综上所述，在供试浓度下，血红栓孔菌的胞内和胞外多糖对人正常肝细胞LO2 无明显毒性，但能明显抑制肝癌 Huh7 细胞增殖，且胞外多糖抑制 Huh7 细胞增殖作用比胞内多糖更强。2.6 胞内与胞外多糖的组成及含量 血红栓孔菌菌丝多糖主要由葡萄糖、盐酸氨基葡萄糖、甘露糖和半乳糖 4 种单糖组成，含量由高到低依次排列；胞外多糖则主要由 7 种单糖组成，含量由高到低依次为葡萄糖、盐酸氨基葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸和木糖(表 1)。进一步对比分析胞内与胞外单糖含量，发现除葡萄糖在胞内多糖中的含量高于胞外多糖，其他 6 种单糖含量均低于胞外多糖，胞内多糖的葡萄糖含量是胞外多糖的 2.90 倍，而胞外多糖的半乳糖、甘露糖和盐酸氨基葡萄糖分别是胞内多糖的 4.16、2.56 和 6.09 倍。综上所述，2 种多糖的单糖组成种类以及含量均存在较为明显的差异。3 讨论讨论 本试验采用传统形态学分类和 ITS 分子鉴定相结合的方法，鉴定出该供试红色野生菌 PL 2021 为血红栓孔菌。通过对血红栓孔菌的生物学特性进行探究表明，不同碳源中，血红栓孔菌PL 2021 菌丝体都能正常生长，最适碳源为甘露糖。在氮源为酵母浸提粉、蛋白胨时，血红栓孔菌的菌丝生长速度更快，菌丝更浓密，而菌丝在 胡鑫 等/一株血红栓孔菌的多糖抗氧化及抗Huh7肝癌细胞的活性 研究论文 菌物学报 802 无机氮源硫酸铵、硝酸铵、脲中其生长较慢且稀疏甚至不能生长，血红栓孔菌对有机氮源的利用率更高，可能原因是有机氮源中含有可以促进菌丝生长的其他物质如维生素和其他微量元素等(王婷等 2016)。这一特性与郝金斌等(2021)鉴定奶油栓孔菌的生物学特性相似。在 pH 筛选试验中发现，血红栓孔菌在不同供试 pH 条件下都能生长，当 pH 为偏弱酸时，其菌丝生长速度较弱碱时更快，最适 pH 为 6.0。温度培养试验表明，在固体培养基上，温度对血红栓孔菌的菌丝生 图 4 血红栓孔菌多糖对 LO2、Huh7 细胞活性的影响 A：LO2 细胞形态.a：对照组；b：胞内多糖组；c：胞外多糖组.B：LO2 细胞存活率.C：Huh7 细胞存活率.胞内多糖与对照组(多糖浓度为 0 mg/mL)相比，*P0.05，*P0.01；胞外多糖与对照组相比，#P0.05，#P0.01.D：多糖对 Huh7 细胞形态的影响.a，e：对照组；bd：胞内多糖处理组；fh：胞外多糖处理组 Fig.4 Effects of polysaccharides of