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生物选修一(考点)资料

选修1—1：《酶的应用》
一、酶在洗涤等方面的应用
【选学（了解）】——果胶酶及其应用：
1. 果胶酶：→是指一类酶的总称。包括：半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶。
2. 果胶酶的来源：→来自霉菌等微生物。常采用霉菌等微生物发酵的方法生产果胶酶。
★提取果胶酶的条件：→低温（0～4℃）、偏酸环境（pH：3～4）、激活剂（10%NaCL）。
3. 果胶酶的作用：→能分解植物细胞壁及胞间层的果胶。
4. 果胶酶的应用：→常用于提高果汁的出汁率和澄清度。
5. 探究果胶酶作用的最适条件（最适温度和pH）和用量的实验要点：
◆遵循单一变量原则和对照实验原则。◆以果汁出汁量或澄清度作为判断酶活性的指标。
（一）酶在洗涤方面的应用【A】
1. 普通洗衣粉的主要成分：→表面活性剂、软水剂（三聚磷酸钠）、碱剂、漂白剂、香精等。
★表面活性剂：→是洗衣粉的核心成分，作用：→降低表面张力。
2. 加酶洗衣粉：→是指加入了蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶的洗衣粉。
（1）酶不能直接加入洗衣粉，所加的是用特殊化学物质包裹成的复合酶制剂。
①★加入洗衣粉的酶制剂不是固定化酶，其包裹材料能溶于水。
②加入洗衣粉中的酶来源：→基因工程生产的酶。能耐酸、耐碱、耐较高温度等。
（2）加酶洗衣粉降低了表面活性剂和三聚磷酸钠的用量。
★使用加酶洗衣粉不仅能增强了洗涤效果，还能减少对环境的污染（磷污染）。
（3）在洗涤剂中应用最广泛、效果最明显的酶是：→ 碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。
3. 酶制剂的洗涤原理：
（1）碱性蛋白酶：→可将血渍、奶渍等中蛋白质分解成可溶性氨基酸和易脱落小分子多肽。
（2）碱性脂肪酶：→可将油渍、汗渍和口红等中的脂肪水解成脂肪酸和甘油等。
（3）淀粉酶： →可将面、粥等中的淀粉水解为麦芽糖、葡萄糖等可溶性成分。
（4）纤维素酶：→本身不能去污垢，但能使纤维结构变得蓬松，利于洗衣粉与纤维深处
污垢接触，增强洗涤效果。★纤维素酶能去除衣物浮毛，不会分解衣物纤维素。
4. 加酶洗衣粉使用注意事项：
（1）不能用于洗涤：→毛织品和丝织品等蛋白质类衣物
（2）不能用70℃及其以上水温洗涤。（★适宜水温：35～50℃；适宜pH：9～11）。
（3）不宜长期存放（酶会失效）。◆加酶洗衣粉对人的皮肤有腐蚀性，应注意防护。
（二）探究加酶洗衣粉洗涤效果实验【B】
1. 观察指标：→（各实验都是）污物消失时间（或污物缩小的面积）。
2. 各对照实验共有的无关变量：
→水用量、洗衣粉用量、污物量、布的质地大小、洗涤方式、浸泡和洗涤时间等。
3. 比较普通洗衣粉与加酶洗衣粉洗涤效果的实验：
★自变量：→洗衣粉种类。 无关变量：→除共有的外，还有水温、pH、洗衣粉品牌。
4. 探究不同种类加酶洗衣粉洗涤效果的实验：
★自变量：→加酶洗衣粉种类。无关变量：→除共有的外，还有水温、pH等。
5. 探究使用加酶洗衣粉的最适宜温度实验：→各组温度形成自身对照。
（1）自变量：→温度。 无关变量：→除共有的外，还有pH等。
（2）应在最适温度左右等梯度设置多组温度进行对照实验。★温度梯度越小越准确。
6. 探究使用加酶洗衣粉的最适宜pH实验：→各组pH形成自身对照。
（1）自变量：→pH。 无关变量：→除共有的外，还有水温等。
（2）应在最适pH左右等梯度设置多组pH进行对照实验。★pH梯度越小越准确。
二、制备和应用固相酶：
（一）固定化酶和固定化细胞技术及其应用【A】：
1. 固定化酶：→是指用物理学或化学方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有
酶活性的酶复合物。
★固定化酶可以反复使用，原因是酶与水溶液反应物和产物可以分离。
2. 制备固定化酶的主要方法：→包括：吸附法、交联法、包埋法等。
交联法 吸附法 包埋法
（1）吸附法：→利用离子键、物理吸附等
方法将酶分子吸附在固相载体的表面。
（2）交联法：→利用（双）多功能试剂进行
酶与载体之间交联，形成三维网状结构。
（3）包埋法：→将酶或细胞包埋在不溶于水的多孔载体中。
◆常用固相载体：→海藻酸钠、纤维素、琼脂糖、明胶、聚丙烯酰胺、多孔玻璃等。
3.★制备固定化酶（细胞）的要求和方法选择：
（1）选择的固定化方法及材料不能影响酶活性；要避免高温、强酸、强碱等。
（2）制备固定化酶时：→常用吸附法和化学结合法，不用包埋法。
★酶分子小，容易从包埋材料中漏出。
（3）制备固定化细胞时：→常用包埋法。 不用吸附法和化学结合法。
★细胞个大，难以吸附或结合，不易从包埋材料中漏出。
4. 直接使用酶、固定化酶和固定化细胞的比较：

主要优点
主要缺点
直接使用酶
催化效率高，耗能低、低污染。
不能反复使用，影响产品质量。
固定化酶
①能与产物分离，能反复使用。
②★易与反应物接触。
不能催化系列反应。
固定化细胞
①能与产物分离，能反复使用。
②★能催化系列反应。
③★酶活性高而稳定、
④★操作容易，成本更低
◆酶不易与反应物接触，反应
效率降低。
◆只能用于生产胞外酶和分泌到细胞外的产物。
5. 固定化酶的应用实例：
（1）固定化葡萄糖异构酶：→用于生产高果糖浆。见右图：
（2）固定化青霉素酰化酶：→用于生产各种新型青霉素。
（3）尿糖试纸：→测试尿糖。（含量：浅蓝→浅绿→棕色→浅棕色）。
①尿糖试纸上含固定化葡萄糖酶和过氧化氢酶及无色化合物。
②尿糖试纸不能反复使用，因为用过的试纸上有颜色。
（4）固定化硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、一氧化氮还原酶：→进行废水处理。
（二）固定化酵母细胞的制备与应用（实验）【B】
1. 制备固定化细胞常用凝胶包埋法。
①★制备固定化酵母细胞常用海藻酸钠凝胶包埋法。
②★凝胶是多孔载体，调节凝胶溶液的浓度，可以改变凝胶的孔径大小。
2. 制备固定化酵母细胞的方法步骤：→关键步骤：配制海藻酸钠溶液。
（1）活化酵母细胞：→目的：→使酵母菌从休眠状态恢复到正常生活状态。
①操作：→将1克干酵母和10ml蒸馏水放在50ml烧杯中混合并搅拌均匀，放置1小时。
②注意事项：→容器要大一些，以防活化液溢出；混合后要进行搅拌。
（2）配制0.05mol/L的CaCL2 溶液：
①操作：→将0.83克无水CaCL2和150mL蒸馏水，放在200ml烧杯中使其充分溶解。
②★CaCL2溶液的作用：→（起凝胶聚沉作用）促使凝胶珠的形成。
（3）配制海藻酸钠溶液（最关键）：
①操作：→将0.7g海藻酸钠和10ml蒸馏水加入50ml小烧杯中，小火间断加热至
完全溶化，加蒸馏水定容至10ml。
②注意事项：→★应采用小火间断加热，以防焦糊；海藻酸钠浓度不宜过高过低。
③★海藻酸钠溶液浓度过高时：→难以形成凝胶珠或凝胶珠形态异常。
④★海藻酸钠浓度过低时：→凝胶珠中包埋的细胞数量少，凝胶珠色浅呈白色。
（4）海藻酸钠溶液与酵母细胞混合：
★应将海藻酸钠溶液冷却至室温后，再加入已活化的酵母细胞；并充分搅拌均匀。
（5）固定化酵母细胞：
①操作：→用注射器吸取混合液，以恒定的速度缓慢地滴加到CaCL2溶液中，并不
断搅拌（磁力搅拌器搅拌），将凝胶珠在CaCL2溶液中浸泡30分钟。
②注意事项：→注射器距液面距离不能太近、凝胶珠浸泡时间不能过短。
③★注射器距液面距离过近时：→凝胶珠会出现拖尾现象。
④★凝胶珠浸泡时间过短时：→凝胶珠不能形成稳定结构，容易裂开。
（6）冲洗：→取出凝胶珠后，要用蒸馏水冲洗2～3次。
★冲洗的目的：→洗去凝胶珠表面的氯化钙溶液和杂菌。
（7）发酵实验：→将10%的葡萄糖溶液150ml加入200ml的锥形瓶中，加入固定化酵母
细胞在25℃下发酵24h。观察气泡产生（CO2）和闻酒味，并用重铬酸钾检测酒精。
3. 实验结果分析：——酵母细胞凝胶珠质量检测。
（1）合格凝胶珠的标准：
①乳白色，圆形或椭圆形。②摔打容易弹起。③挤压不易破裂、无液体流出。
（2）凝胶珠异常的原因：
①色浅呈白色：→海藻酸钠溶液浓度偏低，此种凝胶珠中包埋的酵母细胞数量少。
②不呈圆形或椭圆形：→海藻酸钠溶液浓度偏高。
★此种凝胶珠为制作失败，不能使用；需要重新制作。
③拖尾现象：→混合液浓度低，或注射器距氯化钙溶液液面距离太近。
④凝胶珠漂浮：→混合溶液中含气泡。
⑤★凝胶珠容易裂开：→凝胶珠在氯化钙溶液中浸泡时间过短。
选修1—2：《生物技术在食品加工中的应用》
一、发酵食品加工的基本方法【A】
（一）传统发酵中所利用的微生物的比较：

酵母菌
醋酸菌
毛霉
乳酸菌
生物类型
真核生物
原核生物
真核生物
原核生物
代谢类型
异养兼性厌氧型
异养需氧型
异养需氧型
异养厌氧型
适宜生长温度
18℃～25℃
30℃～35℃
15℃～18℃
室温
主要用途
酿酒、发面
酿醋
制作腐乳
制酸奶、泡菜
（二）各类发酵食品的制作原理及方法：
1. 制作果酒原理：→以果汁为原料，利用酵母菌在无氧条件下（酒精发酵）产生酒精。
（1）自然发酵：→利用附着在葡萄皮上的野生型酵母菌进行酒精发酵。
（2）工业生产上：→用人工培养的纯种酵母菌进行酒精发酵。
（3）红葡萄酒是用带皮葡萄酿制而成，白葡萄酒是用去皮葡萄酿制而成。
（4）果胶酶可用于酒的陈酿化；蛋白酶可使酒体清澈透明。
2. 制作果醋原理：→以果汁或果酒为原料，利用醋酸菌在有氧条件下产生醋酸。
3. 制作腐乳的原理： →利用毛霉等微生物分泌的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶将豆腐中的
蛋白质、脂肪和淀粉分解为多种氨基酸、有机酸等；使腐乳鲜香可口，易消化吸收。
（1）在腐乳制作中，多种微生物参与了豆腐的发酵，但起主要作用的是毛霉。
①毛霉是丝状真菌，其代谢类型属于异养需氧型；适宜生长温度：15℃～18℃。
②毛霉孢子分布广泛，空气中含有大量毛霉孢子。
（2）家庭和实验制作腐乳时，将豆腐坯暴露在空气中接种毛霉孢子。
（3）工业生产腐乳时，在严格无菌条件下接种优良毛霉菌种孢子。★腐乳品质好。
①工业上生产腐乳步骤：→①接种孢子。→②培养和晾花。→③压坯与装坛
②“晾花”的目的：→增强酶的作用，散失霉味。
（4）醉方（添加黄酒制成）、红方（添加红曲制成）、青方（不加调料制成）。
4. 酸奶和泡菜制作原理：→利用乳酸菌在无氧条件下发酵产生乳酸。
（1）泡菜中亚硝酸盐含量变化规律：→先增加再下降至原含量水平。
（2）泡菜制作要求：→①压实和严格密封。②加盐量不宜过多过少，控制在5%。
（3）食用时间：→腌制10～11天以后。★是否能食用，需要检测亚硝酸盐含量。
①比色法检测：→将样品液显色情况与亚硝酸钠标准显色液比较估测出其含量。
②不同浓度的显色液呈不同程度的玫瑰红色。
二、果酒和果醋的制作【B】
（一）果酒制作：→果酒中酒精含量应控制在10%～20%。
1. 果酒制作方法步骤（及注意事项）：
（1）对发酵瓶、纱布、榨汁机等进行清洗和消毒：
★发酵瓶要用温水反复清洗后，再用75%酒精擦拭消毒，晾干。
（2）取葡萄500克，先冲洗干净，再去除枝梗和腐烂籽粒，再次冲洗。
①冲洗目的：→去除葡萄表面污物杂物。★不能先去枝梗再冲洗。
②不能反复冲洗，否则会冲洗掉附着在葡萄表面的野生型酵母菌。
（3）用榨汁机榨取葡萄汁，之后将葡萄汁装入发酵瓶中，并盖好瓶盖：
【注意】→果汁不能装满（装入量不超过发酵瓶总体积的2/3）。★目的是：
①让酵母菌有氧呼吸大量繁殖，保证发酵时有较大起始数量。
②防止发酵时发酵液溢出。
（4）将发酵瓶放置在18℃～25℃条件下发酵10～12天：
（5）每天定期排气1～2次（排CO2），以防瓶爆裂。
①为了防止发酵瓶爆裂，最好选用塑料瓶。
②排气时要防止杂菌污染，常拧松瓶盖排气，不能打开瓶盖。
③★右图发酵装置中排气管设计成长而弯曲状，既能排气，又能防止杂菌污染。
（6）取样检测酒精（10天后）：→用酸化重铬酸钾检测；也可闻酒味、镜检酵母菌。
【检测方法】→①取两支试管编号1、2，分别装入2mL酒精、2mL发酵液。
②向两试管中分别滴加3滴3mol/L的硫酸溶液，并振荡混匀。
③再向两试管中各加入饱和重铬酸钾溶液3滴，振荡后观察溶液颜色变化。
2.★制作果酒和果醋中防止杂菌污染的措施：
（1）对用具清洗并用酒精消毒。 （2）葡萄先清洗后除枝梗。
（3）排气管设计为长而弯曲状。 （4）无菌操作。
（二）果醋制作：
1. 利用葡萄汁等果汁制作果醋：
（1）要向果汁中接种醋酸菌，并置于30℃～35℃条件下进行有氧发酵。
酶
（2）发酵时需要不断通入无菌空气，同时也需要定期排气（排CO2）。
（3）反应式：C6H12O6 ＋2O2 2 CH3 COOH ＋2CO2＋2 H2O＋能量
2. 利用果酒制作果醋的方法步骤：
（1）将醋酸菌（醋曲或醋酸菌膜）接种到制作好的果酒中，并通入无菌空气。
（2）将发酵装置放在30℃～35℃环境中，不断通入无菌空气进行有氧发酵7～8天。
（3）检测果醋是否制作成功，并对发酵液（果醋）进行过滤、灭菌：
【检测方法】→①pH测定、②观察醋酸菌膜形成、③闻酸味、品尝、镜检等。
【提醒】→①变酸的果酒表面白色菌膜是由醋酸菌形成的。
酶
②泡菜坛内表面白色菌膜是由酵母菌形成的。
（4）果酒制果醋反应式： C2H5OH ＋O2 CH3 COOH ＋ H2O ＋能量
（三）★果酒制作与果醋制作的比较：

果酒制作
果醋制作
发酵菌种
酵母菌
醋酸菌
最适发酵温度
18℃～25℃
30℃～35℃
对氧气需求
前期需氧，后期不需氧
一直需要氧
pH
4.0～5.8
5.4～6.3
发酵时间
10～12天
7～8天
方法与流程
挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵（果酒）→醋酸发酵（果醋）
三、腐乳的制作【A】
1. 腐乳制作的基本流程：→见下图：
让豆腐上长出毛霉
◆直接接种或利用空气中
毛霉孢子，15℃～18℃培养。
加盐腌制
◆逐层加盐，随层数增高而增加盐量；近瓶口处铺厚些。
加卤汤装瓶
◆卤汤由酒和
香辛料配成。
密封腌制
◆用酒精灯对瓶口
灭菌后密封。

（1）让豆腐上长出毛霉：
①将豆腐切成小块（4cm×4cm×1.5cm），用沸水消毒后微微晾干，制成腐乳坯。
在晾干过程中空气中毛霉孢子落到腐乳坯上，完成接种过程。
★所用豆腐含水量应控制在70%左右，含水过多腐乳不成形。
②将腐乳坯竖立放在清洁容器内彼此间隔1cm，将温度控制在15～18℃，并保持
一定湿度让毛霉生长；当菌丝变成淡黄色，有大量灰褐色孢子形成时停止发酵。
★若某些豆腐上长出青霉，应剔除这种豆腐或重新制作。
（2）加盐腌制：→将长满毛霉的豆腐块用食盐水清洗后整齐地摆放在瓶中，用食盐腌制10天。
①★加盐方法：→逐层加盐，加盐量逐层递增，接近瓶口的表面盐要铺厚一些。②盐量：腐乳坯量= 5 ：1。★加盐过多会影响继续发酵，过少豆腐会腐败变质。
【加盐目的】→①析出豆腐中水分，使豆腐变硬，防止过早酥烂。
②抑制微生物生长，防止豆腐腐败变质。 ③调节口味。
（3）配制卤汤：→用食盐、水和料酒及各种香辛料等进行配制。
①卤汤中酒含量控制在12%左右。
◆酒的作用：→抑制微生物的生长，并使腐乳具有独特酒香味。
★酒用量过多会抑制蛋白酶活性和影响腐乳风味；酒用量过少豆腐会腐败。
②香辛料的作用：→调味、防腐杀菌。
（4）加卤汤装瓶，密封腌制：→将配制好的卤汤加入瓶中，将瓶口通过酒精灯火焰，再用胶带密封瓶口，密封腌制6个月。
★装瓶时要迅速，瓶口要通过酒精灯的火焰，再密封。
2. 腐乳品质鉴定及有关提醒：
（1）评价腐乳品质：→应从形状、色、香、味、质地等方面进行评价。
（2）影响腐乳品质的因素：→盐、酒、香辛料和发酵温度。
◆前期发酵温度为：15℃～18℃；后期发酵温度（腌制时）为常温或30℃。
★在腌制过程中，毛霉等微生物（酶的作用）仍可继续发酵一段时间。
（3）腐乳外表的皮是附着在豆腐上的毛霉菌丝形成的，可使腐乳成形。
（4）用于腌制的玻璃瓶洗刷干净后要用沸水消毒，装瓶、密封等环节要无菌操作。
选修1—3：《微生物的利用》
一、微生物的分离和培养【A】
（一）微生物与培养基：
1. 微生物：→是指除动物界和植物界以外的所有生物，包括病毒、原核生物、真菌和原生生物等
2.培养基：→是指为人工培养微生物而制备的，适合微生物生长、繁殖或积累代谢产物
的营养基质。
3.培养基的营养成分：→一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等，有的还含生长因子。
（1）碳源：→如：无机碳（含碳无机物）、有机碳（糖类、脂质、蛋白质等）。
①无机碳：→能为自养微生物提供碳素营养。★无机碳是自养微生物的碳源。
②有机碳：→能为异养微生物提供碳素营养和能源。
（2）氮源：→如：无机氮（含氮无机物）、有机氮（蛋白胨、尿素、氨基酸等）。
①为微生物提供氮素营养。 ②★氮气（N2）是固氮微生物的氮源，
（3）水和无机盐：→分别为微生物提供水、无机盐营养。
（4）生长因子：→如：维生素、必需氨基酸、碱基等，满足异养微生物合成酶和核酸。
【提醒】→①含C、H、O、N的有机化合物既是碳源，又是氮源和能源。
②蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、麦芽汁等既含碳源又含氮源、生长因子等营养。
4. 培养基的种类及其用途：
（1）按物理状态可将培养基分为：液体培养基、半固体培养基和固体培养基。
①液体培养基：→未加凝固剂（琼脂）。◆主要用于工业生产。
②半固体培养基：→加入琼脂0.2～0.5%。用于观察微生物的运动、分类和鉴定。
③固体培养基：→加入琼脂1.5～2%。★用于微生物的分离、纯化、计数和鉴定。
★琼脂是最常用凝固剂，熔点：96℃，凝固点：40℃，微生物一般不能利用琼脂。
（2）按化学成分可将培养基分为：合成培养基和天然培养基。
①合成培养基：→化学成分明确。 ★用于微生物的分类和鉴定。
②天然培养基：→化学成分不明确。◆用于工业生产。
（3）按用途（或功能）可将培养基分为：基础培养基、选择培养基和鉴别培养基。

制备方法
主要用途
实例
基础培养基
含微生物生长所需要的基本物质
选择培养基
添加或缺少某种
化学物质
从众多微生物中
分离出
所需微生物
◆加入青霉素分离酵母菌、霉菌等。
★加高浓度食盐分离金黄色葡萄球菌
★无氮培养基分离固氮菌。
★不含有机碳培养基分离自养微生物
鉴别培养基
加入某种指示剂或化学药品
鉴别不同种类
的微生物
伊红—美蓝培养基可使大肠杆菌的菌落
呈深紫色，可以鉴别大肠杆菌。
5. 培养不同微生物所需要的温度、pH和时间：

细菌
放线菌
霉菌
培养温度
30～37℃
30～37℃
25～28℃
培养基pH
6.5～7.5
7.5～8.5
5.0～6.0
培养天数
1～2d
5～7d
3～4d
（二）微生物培养中的无菌操作技术：
1.无菌操作：→是指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
★获得纯净培养物的关键：→防止外来杂菌入侵（污染）。
2.消毒与灭菌的区别：

条件
效果与目的
常用方法
消毒
较温和的物理
或理化方法
杀死物体上大部分有害微生物
部分灭菌，不包括杀灭芽孢和孢子。
煮沸消毒法、巴氏消毒法、
紫外线或化学药剂消毒法等
灭菌
强烈的
理化因素
杀死物体内外所有微生物，
包括芽孢和孢子
灼烧灭菌、干热灭菌、
高压蒸汽灭菌。
3.常用消毒方法：
（1）煮沸消毒法：→100℃煮沸5～6min。◆常用于罐装食品、日常食品的消毒。
（2）巴氏消毒法：→70～75℃下煮30min或80℃下煮15min。◆用于牛奶、果汁消毒。
（3）化学药剂消毒法：→①70～75%酒精、碘酒、新洁尔灭等可用于皮肤、伤口等处消毒。
②氯气用于水源消毒。
（4）紫外线消毒：→30W紫外线灯照射30min。★用于对接种室的空气进行消毒。
4.常用灭菌方法及其应用：

主要方法（及器械）
★适用范围
灼烧灭菌
用酒精灯火焰（外焰）灼烧
接种环、接种针、试管口、三角瓶口。
干热灭菌
置于干热灭菌箱中，
160～170℃加热1～2h。
①培养皿、试管等玻璃器皿，
②不适合其他方法灭菌的金属用具等
高压蒸气灭菌
（湿热灭菌）
置于高压灭菌锅中
100 kPa、121℃、15～30 min
培养基、无菌水及多种器材、物品。
5.无菌技术具体做法：
（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洗和消毒。
（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。
（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近（旁）进行。
（4）实验操作时应避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。
6.（高压灭菌锅）高压蒸汽灭菌的操作方法：
（1）加水：
→装水量要没入电热管，
以防干烧爆裂，加水后
放入灭菌桶。
（2）装锅：→将所要灭菌的材料装入锅内。
（不要装得太满），
（3）密封：→盖上锅盖，两两对称地拧紧螺栓。
（4）加热排气：→打开排气阀，接通电源加热；
约2分钟后有气体排出，排气约
5分钟后关闭排气阀。
【注意】→★一定要将冷空气排尽，否则达不到灭菌效果。
（5）保温保压：→当压力上升至100kPa（0.1MPa）或温度达121℃时,维持20～30
分钟；然后关掉电源。
（6）出锅：→待压力表指针回到零，温度下降至60℃以下，打开排气阀，开盖取出
锅内物品。
★一定要等到压力表指针回到零时，才能排气开盖。否则压力过大会导致培养基
等内容物冲出，造成污染。
★灭菌完成后要将锅内余水倒出，保持内壁内胆干燥。
（三）培养基的配制、灭菌和倒平板。
1. 培养基的配制原则：→①目标要明确。②营养要协调。③pH要适宜。
2. 细菌培养基的配制：——牛肉膏蛋白胨培养基的配制过程：
1000mL牛肉膏蛋白胨固体培养基配方
成分
牛肉膏
蛋白胨
NaCl
琼脂
含量
5.0g
10.0g
5.0g
20.0g

将上述物质溶解后，添加蒸馏水定容至1000mL
（1）计算和称量：→根据表中配方计算培养基各成分用量，并逐一称取。
【注意】→①牛肉膏和蛋白胨容易吸潮，称取时动作要迅速。
②牛肉膏粘稠度较大称取时要细心。
（2）溶化：→将称取的各成分与水混合后进行加热溶化。
①★应将称量好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯；待溶化干净后取出。
②★在加热溶化过程中要用玻璃棒不断搅拌，以防止糊底而导致烧杯破裂。
（3）调节pH：→用pH试纸测pH，通过滴加3%HCI或NaOH将pH调到7.0～7.5。
（4）分装：→将培养基分装到试管或三角烧瓶中，分装好后用棉塞塞紧管口或瓶口。
①培养基分装量：→试管：为其高度的1/5。三角烧瓶：不超过瓶容积的1/2。
②分装时培养基不能污染试管口或瓶口。★对试管或三角烧瓶要标记和编号。
（5）包扎：→①试管：3～5支扎成一捆，外包一层牛皮纸（防污染），用线扎好。
②三角烧瓶：用牛皮纸包扎好，以防水蒸汽污染。
（6）灭菌：→将包扎好的试管或三角烧瓶放入高压灭菌锅内进行高压蒸汽灭菌。
★培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，160～170℃下灭菌1～2h后备用。
（7）倒平板：→待培养基冷却到50℃左右（刚刚不烫手）在酒精灯火焰附近倒平板。
①将灭菌过的培养皿放在酒精灯火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，
左手拨出棉塞。
②右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰2-3次，以防瓶口附近微生物污染培养基。
③用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的
培养基约10～20mL倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。
④等待平板冷却凝固，约需要5～10 min；然后将平板倒过来放置。
★平板冷凝后要倒置的原因：→防止皿盖上冷凝水落入培养基，造成污染。
★倒平板操作应在酒精灯火焰附近进行，以防杂菌污染。
★倒平板时，培养基不能溅在皿盖与皿底之间的部位，也不能溅在皿盖与皿壁上。
★若是装入试管的培养基，灭菌后要搁置斜面，斜面长度不超试管长度的1/2。
（8）无菌检查：→检查培养基灭菌是否彻底，方法是：→将灭菌的培养基放入37℃
的恒温箱中培养24～48h，观察有无菌落形成。

（四）微生物接种技术：
1.接种器具：→包括：接种环（划线接种）、接种针（穿刺接种）、玻璃刮铲（涂布用）。
2.接种方法：→包括：平板划线法、涂布平板法、穿刺接种法、斜面接种法等。
★微生物分离纯化的最常用接种方法：→平板划线法和稀释涂布平板法。
3. 平板划线法：→◆特点：→操作简单，但单菌落不易分离。
（1）原理：→通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步
稀释分散到培养基的表面。★在数次划线后, 可以分离到由一个细胞繁
殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.
（2）操作方法：
①将接种环放在火焰上灼烧，至接种环烧红；在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。
②将试管口通过火焰数次，将已经冷却的接种环伸入菌液，沾取一环菌液。
③将试管口通过火焰数次，并塞上棉塞。
④左手将培养皿盖打开一条缝隙，右手将接种环迅速伸入平板内，划3～5条
平行线，盖上培养皿盖。【注意】→★不要划破培养基。
⑤烧灼接种环，待接种环冷却后；从第一区域划线的末端开始往第二区域划线。⑥重复以上操作，在三、四、五区域内划线。★最后区域不能与第一区域相连。
⑦将平板倒置，放入恒温箱中培养。
（3）【提醒注意】
①接种全过程都需要在酒精灯火焰旁进行，每次划线前后都要灼烧接种环。
★第一次划线前灼烧接种环的目的：→烧掉接种环上被污染的杂菌。
★第二次及其之后划线前后灼烧接种环的目的：→烧掉接种环上残留的菌种。
②每次划线接种时都需要将灼烧的接种环冷却后才能划线，以防烫死菌种。
③接种划线时不能划破培养基，最后区域所划线不能与第一区域的相连
4. 稀释涂布平板法：→◆特点：操作复杂，但单菌落容易分离。
（1）原理：→将菌液进行一系列的梯度稀释（常为10倍梯度），然后将不同稀释度
的菌液分别涂布到琼脂平板表面，经过培养，在稀释度足够高的菌液里，
聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，在培养皿表面形成单个菌落。
（2）操作方法：
①取合适稀释度的少量菌液（0.5mL）在酒精灯火焰附近滴加到平板表面。
②从酒精溶液中取出涂布器，把涂布器上粘附的酒精在酒精火焰上燃尽灭菌。
③在酒精灯火焰附近，用冷却后的涂布器（即玻璃刮铲）把菌液涂布均匀。
④把用涂布接种的培养皿放在恒温箱中（37℃恒温）培养1～2天取出。
★稀释涂布平板法统计的菌落数目比活菌的实际数目少。
原因：→当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是1个菌落。
（五）菌种保藏方法：
1. 临时保藏：→接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。
2. 长期保存：→甘油冷冻管藏法（即：甘油管藏法。－20℃保存）。
二、微生物的分离和培养（实践）【B】
（一）分离纯化大肠杆菌：
1. 配制牛肉膏蛋白胨培养基：→包括：计算→称量→溶化（含调pH）→灭菌→倒平板。
2. 分离纯化大肠杆菌的接种方法：→划线平板法和稀释涂布平板法。
3. 接种后的培养基的培养：→置于恒温箱中37℃培养1～2d。
4. 挑取大肠杆菌菌落多次进行接种培养可以纯化大肠杆菌菌种。
5. 菌种保存方法：→临时保藏（4℃保存）和长期保存（甘油管藏：－20℃保存）.
（二）土壤中分解尿素的微生物的分离与计数：
1.筛选原理及方法：
（1）原理：→尿素分解菌能合成脲酶，能利用脲酶分解尿素，因此可以尿素为氮源。（2）筛选方法：→用以尿素为唯一氮源的培养基培养土壤微生物进行筛选。
2. 实验方法步骤：→本实验采用稀释涂布平板法和活菌计数法。
（1）土壤取样：→从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
【注意】→取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要灭菌。
（2）制备培养基：→按下列配方制备以尿素为唯一氮源的培养基。
KH2PO4
Na2HPO4
MgSO4·7H2O
葡萄糖
尿素
琼脂
pH调至7.0～7.2，
加蒸馏水定容至1000ml
1.4g
2.1g
0.2g
10.0g
1.0g
15.0g
★需要设置无尿素培养基作空白对照，即：表中尿素用等量的无菌水替换。
（3）土壤样品稀释：→制备不同稀释度的土壤悬液。方法如下：
①称取0.5g土壤，倒入盛有50mL无菌水的锥形瓶，振荡20min，充分打散土壤，
制成10－2g/mL的土壤悬液。
②用无菌移液管吸取0.5mL（10－2g/mL）的土壤悬液注入盛有4.5mL无菌水的
1号试管，配制成10－3g/mL的土壤悬液。
③取另一支无菌移液管吹吸1号管3次，使悬液均匀，再吸取0.5mL注入盛有
4.5mL无菌水的2号试管，配制成10－4g/mL的土壤悬液.。依此类推，配制
10－5、10－6、10－7、10－8g/mL的等浓度的土壤悬液。
★每次吸取土壤悬液前都要用移液管吹吸悬液3次的目的：→使土壤悬液均匀。
④分离不同的微生物采用不同稀释度（因不同微生物在土壤中含量不同）。见下表：

细菌
放线菌
霉菌
稀释度
104、105、106
103、104、105
102、103、104
目的
保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板
【提醒】→人教版是配制10mL不同浓度的土壤悬液，其方法与上述方法相同。
（4）接种：→采用（稀释）涂布平板法。◆具体操作如下：
→从最低浓度（10－8g/mL）土壤溶液开始，分别用无菌移液管吸取1mL（人教版
为0.1mL）加入到相应编号的培养基中，每个浓度设置至少3个重复（三个平板），再用涂布器（玻璃刮铲）涂布均匀。
①每次吸取土壤悬液前都要将土壤悬液充分振荡，混合均匀；每一步都应做到
无菌操作。★操作时，移液管和试管口应在离火焰1～2cm处。
②实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。
（5）培养与观察：→将已标明培养基种类、培养日期和样品稀释度的培养皿，倒置放在37℃的恒温箱培养1～2d，观察细菌菌落。
（6）计数菌落：→每隔24h统计菌落一次，选取菌落数目稳定时的数据作结果，以防
止培养时间不足而遗漏某些菌落。
①★计算时应选择菌落数为30～300的平板上进行计数，要计算平均数。
②★每克样品菌落数（用液1mL）＝某一稀释度重复培养菌落平均数×稀释倍数。
③★统计的菌落数比活菌的实际数目少。
原因是：→当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是1个菌落。
4. 结果分析与评价：→ ★同一土样的重复组统计的结果应相近。
（1）若未接种的培养基中没有菌落，说明培养基未被杂菌污染，反之，则被污染。
（2）若空白对照组培养基上有菌落生长，原因可能是被固氮微生物污染或培养基中混入了其他氮源。
（3）若实验中得到2个或2个以上菌落数在30～300的平板，表明稀释操作成功，可以进行计数统计。
（4）若同一稀释度的3个重复的菌落数相差悬殊，表明试验不精确，需要重新实验。
【知识拓展】
1．土壤中微生物数目的统计方法：→包括：直接计数法和间接计数法（活菌计数法）。
（1）直接计数法：→用血球计数板制片后在显微镜下观察计数。
①取样计数方法与培养液中酵母菌计数方法类似。
②土壤微生物的稀释要求：→以达到每小格内有5～10个菌体为宜。
③经稀释的土壤样品应重复计数3次，取其平均值。
④★1mL土壤悬液中菌体总数 = 4×106×每小格中的菌体数×土壤悬液稀释倍数。
（2）间接计数法（活菌计数法）→采用稀释涂布平板法，统计菌落数进行计数。
①要设置对照和重复，每个稀释度土壤悬液至少设置3个重复。
②选择菌落数为30～300的平板上进行计数，并计算平均数。
③每克土壤样品中菌落数＝菌落数 × 稀释倍数 ÷ 涂布体积。
2. 鉴定能分解尿素的微生物的方法：→脲酶检测法。
（1）原理：→尿素经脲酶分解后形成氨，使pH升高，会使酚红指示剂变红。
（2）方法：→在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红，若酚红指示剂变红，则
说明该微生物能分解尿素。
（三）分离土壤中能分解纤维素的微生物：
1.基础知识和原理：
（1）能分解纤维素的微生物都能分泌纤维素酶，该类微生物能以纤维素为唯一碳源。
（2）纤维素酶：→是一种复合酶，包括：C1酶（外切酶）、CX酶（内切酶）和葡萄糖苷酶。
纤维素
纤维二糖
葡萄糖
C1酶、CX酶
葡萄糖苷酶

（3）刚果红：→能与纤维素形成红色复合物，不能与纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
★在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，能分解纤维素的微生物形成的菌落
周围由于纤维素被分解，因此不呈红色，而是形成透明圈。
2.操作步骤：
（1）土壤取样：→应从富含纤维素的环境中进行土壤取样。如：树林中多年落叶形成
的腐殖土等。▲若找不到合适的环境，可将滤纸埋在土壤中（深10cm）再取样。
（2）选择培养：→★目的：→增加纤维素分解菌的浓度（即：浓缩所需要微生物）。
①按下表配方制备液体选择培养基：
纤维素粉
5g
Na2HPO4·7H2O
1.2g
溶解后加蒸馏水定容至1000mL
NaNO3
1g
KH2PO4
0.9g
KCL
0.5g
酵母膏
0.5g
MgSO4·7H2O
0.5g
水解酪素
0.5g
【提醒】→该培养基为液体培养基，属于选择培养基。 ★原因是：→该培养基中
虽然含有其他碳源（酵母膏），但含量很少，培养基中的主要碳源还是
纤维素；在此种培养基中只有能分解纤维素的微生物才能大量繁殖。
★水解酪素：→提供氮源和生长因子。
②设计对照组培养基时，用葡萄糖代替该配方中纤维素粉。
【操作】→称取20g土样加入装有30mL选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下（30℃），振荡培养1～2天，直至培养液变浑浊。
（3）梯度稀释：→将选择培养后的培养基进行等梯度稀释101～107倍。
（4）将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上：
①制备