几种药食两用类物质对酒精性...护及其抑制幽门螺旋杆菌作用_王雨阳.pdf

几种药食两用类物质对酒精性胃黏膜损伤的保护及其抑制幽门螺旋杆菌作用王雨阳，杨 焱，吴 迪，李 文，陈万超，张 忠（农业部南方食用菌资源利用重点实验室 国家食用菌工程技术研究中心 上海市农业科学院食用菌研究所，上海；上海海洋大学食品学院，上海）摘要 通过体外抑制幽门螺旋杆菌和抗炎试验，考察了猴头菌、茯苓、甘草、黄芪、葛根、蒲公英、陈皮几种药食两用类物质的提取物对幽门螺旋杆菌的抑制作用以及缓解炎症的效果，结果表明：黄芪提取物、甘草提取物具有良好的体外抑制幽门螺旋杆菌的作用；葛根提取物、甘草提取物具有较好的缓解炎症的效果。通过构建人胃黏膜上皮细胞 损伤模型，明确了猴头菌和茯苓的提取物对酒精损伤的人胃黏膜上皮细胞 增殖具有促进作用。根据试验结果，筛选出猴头菌、茯苓、黄芪和甘草 种药食两用物质的提取物，将其按照一定比例混合，制成 种组方，考察其对大鼠急性酒精性胃黏膜损伤的保护作用，结果表明：种组方对胃黏膜损伤均具有一定的保护作用，组方（猴头菌、茯苓、黄芪、甘草）在 时对大鼠急性酒精性胃黏膜损伤具有更好的保护作用。关键词 药食两用；胃黏膜损伤；幽门螺旋杆菌；抑菌；抗炎中图分类号 文献标识码 文章编号（）：开放科学（资源服务）标识码（）：，（），；，），；，（，）；作者简介 王雨阳（），男，江苏连云港人，硕士研究生，研究方向：食药用菌的功能营养。通信作者，副研究员，硕士，从事食药用菌的研究与开发。收稿日期 近年来，随着人们生活节奏的加快，过度饮酒、刺激性食物等外源性损伤因素引起的胃损伤逐渐增多，特别是饮酒引起的急性胃黏膜损伤病变临床日益常见。人们饮酒后，高浓度酒精在胃内滞留，侵蚀胃黏膜组织，使胃黏膜屏障受损，直接引起胃黏膜急性炎症，黏膜出现充血、水肿、出血、糜烂及溃疡形成等症状。随着饮酒人数的增加，酒精性胃黏膜损伤相关疾病的发病率呈逐年上升趋势。幽门螺旋杆菌（）是一种革兰氏阴性微需氧杆菌，也是胃黏膜损伤、慢性胃炎和胃十二指肠溃疡发生的主要因素之一。现有临床治疗胃黏膜损伤的药物还存在一些弊端，如副作用大、易复发和需长期使用等。因此，从营养预防的角度出发，寻找安全、有效、能保护胃黏膜免受损伤的有效产品，具有重要的实际应用价值。在胃黏膜保护方面，已有研究表明，猴头菌、茯苓、黄芪和陈皮等药食两用类物质对胃黏膜损伤具有一定的保护作用。杨行堂等研究发现，甘草、葛根和蒲公英具有预防幽门螺旋杆菌感染及降低胃癌发病危险性的作用。等研究发现，苦瓜多糖可以通过抗炎作用机制对胃黏膜损伤起保护作用，这一机制与炎性细胞因子介导的抗氧化能力有关。关于利用猴头菌和茯苓、黄芪、甘草等组方进行胃黏膜损伤方面的研究鲜见报道，因此，笔者通过体外抗炎，抗幽门螺旋杆菌和酒精损伤的人胃黏膜上皮细胞 增殖模型，探讨猴头菌等几种药食两用类物质潜在的胃黏膜损伤修复活性，筛选出几种药食两用类物质制成组方，建立无水乙醇诱导的大鼠胃黏膜损伤模型，探讨组方对大鼠胃黏膜损伤的保护作用，为胃黏膜损伤类疾病的防治提供理论和试验依据，也为猴头菌、茯苓等药食两用类物质应用于胃黏膜保护类功能食品的开发利用提供科学依据。材料与方法 试剂与仪器细菌脂多糖（，）、美国 公司；培养基、培养基、胎牛血清，美国 公司；青霉素、链霉素，美国 公司；葡萄糖、氯化钠、磷酸等，国药集团药业股份有限公司；脑心浸液粉、哥伦比亚琼脂，上海信裕生物科技有限公司；脱纤维羊血，上海源叶生物科技有限公司。电子天平，梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；水套式三气培养箱，美国 公司；金净洁净安徽农业科学，（）：操作台，吴江市净化设备总厂；孔板酶标仪，美国 公司。供试细胞与菌株 细胞株（小鼠巨噬细胞株）购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。用含体积分数胎牛血清、青霉素及 链霉素的 培养基，在 条件下培养，取对数生长期细胞，用无色 培养基将细胞稀释到 个。幽门螺旋杆菌标准菌株 。和临床标准菌株 购自广东省微生物菌种保藏中心。幽门螺旋杆菌培养基：脑心浸液粉 、哥伦比亚琼脂 、蒸馏水，高压灭菌 后降至 后加入 去纤维羊血。脑心浸液肉汤：蛋白胨 、脑心浸液粉、氯化钠、葡萄糖、磷酸氢二钠 、蒸馏水 ，高压灭菌，备用。样品制备称取猴头菌、茯苓、黄芪、蒲公英、陈皮、甘草、葛根，分别按照重量比加 倍的蒸馏水浸泡 后，用文火煎煮 ，倒出药液，药渣再加等量蒸馏水煎煮 ，次药液合并，离心 ，倒出上清液，蒸发浓缩后冻干。将冻干后的各类药液破碎成粉即为提取物。精确称取猴头菌、茯苓、黄芪、蒲公英、陈皮、甘草、葛根提取物各 溶于 蒸馏水中，沸水浴 ，冷却至室温，离心 ，过 滤膜备用。不同提取物抑制幽门螺旋杆菌的活性试验 幽门螺旋杆菌菌悬液制备。将保存的菌株活化后转接到培养基上，、，孵育 。用脑心浸液肉汤洗下菌落，收集菌液。以脑心浸液肉汤校正菌悬液浓度，测量抑菌圈所用菌悬液浓度约 ，测定最小抑制浓度用 菌悬液。抑菌圈的测定。采用牛津杯法对抑菌圈进行测定。取直径，培养基厚度约 的羊血培养基的平板，每块平板加入约 幽门螺旋杆菌 的菌悬液，立即用涂布棒涂布均匀。然后，每个培养皿放置 个牛津杯，呈均匀分布。往每个杯中加入 不同的样品溶液。，培养 ，观察抑菌圈，测量其直径，每个样品重复 次。最小抑菌浓度的测定方法。采用 孔板法测定最小抑菌浓度。配置样品浓度梯度为 、和 。依次加入 孔板中，每个样品 组平行。趁热加入羊血培养基，混合均匀。待培养基凝固后，每个孔中加入 或者 的菌悬液。，培养 。观察细菌状态，确定最小抑菌浓度。不同提取物对 刺激巨噬细胞 释放 的影响 试剂的配制。在烧杯中加入 ，加入蒸馏水 ，分别加入 和 ，用磁力搅拌器搅拌至全部溶解，避光保存。样品的配制。将样品分别用 配制成、待测样品。标准曲线的绘制。配成不同浓度的亚硝酸钠溶液，浓度梯度为、共 个，取 于 孔板，加入 试剂，反应，测定 吸光值，每个浓度 个平行，根据吸光值绘制标准曲线。对 刺激巨噬细胞 释放 的影响。计算细胞个数，将 用无色 培养液稀释成 个 的细胞悬液，每组 于 孔板中，培养 至细胞完全贴壁后，样品组加入 （作用浓度 ）和 待测液（作用浓度、）。组每孔加入 和 ，组每孔加入 ，培养 后吸取上清液 加入 试剂，反应 ，酶标仪测定吸光值，根据标准曲线计算 释放量。不同提取物对胃黏膜上皮细胞 的损伤修复研究 细胞毒性试验。将人胃黏膜上皮细胞 用无色 培养液稀释成 个 的细胞悬液，每组 于 孔板中，培养细胞 ，分别加入上述配制的不同浓度待测样品液 ，培养 后，每孔加入 试剂继续培养，以 法测定所选作用浓度范围内不同样品对 细胞活力的影响，每个样品设置 个重复。乙醇处理及细胞损伤模型的构建。将处于对数生长期的 细胞以 个 的密度培养 。加入不同浓度的样品（作用浓度分别为、）预保护，然后去除培养液，使用 乙醇损伤 细胞 。对照组细胞用相同的培养液处理，但不加乙醇。每孔加入 试剂继续培养，以 法测定所选作用浓度范围内不同样品对 细胞活力的影响，每个样品设置 个重复。将样品组与对照组和模型组进行比较。所有结果均以 细胞增殖抑制率表示。不同提取物组方对乙醇损伤的大鼠胃溃疡的抑制作用研究 动物模型建立及试验分组。根据以上试验结果，将猴头菌提取物、茯苓提取物、黄芪提取物和甘草提取物按照药典和相关保健产品的要求，以一定比例均匀混合制成 种组方（表）。通过急性乙醇诱导胃黏膜损伤模型评价其预保护作用。将 大鼠随机分为 组（）。胃溃疡模型（模型组）和正常对照组（对照组）给予生理盐水（），其余组分别给予组方、组方 和组方，各组方分为低剂量（）、中剂量（）和高剂量（），分别对应于 组、组和 组。生理盐水和样品均通过灌胃给药，每天 ，持续 。用不同浓度的组方、组方 和组方 灌胃预保护 后，除对照组大鼠外，其余大鼠在最后一次给药前禁食并自由饮用自来水，然后每只大鼠给予 无水乙 安徽农业科学 年醇诱导胃溃疡。后，将大鼠颈椎脱臼处死，取出胃。每组大鼠的胃随机分为 个亚组。一个亚组中的样品立即用 磷酸盐缓冲福尔马林（）填充，并浸没在相同的溶液中 ，用于组织学研究。表 不同比例提取物组方 单位：组方猴头菌提取物茯苓提取物 黄芪提取物甘草提取物组方 组方 组方 胃溃疡评价。大鼠胃沿大弯切开，用生理盐水清洗，仔细观察胃黏膜层溃疡的发生情况。同时记录出血斑数，用游标卡尺测量溃疡条纹的长度和宽度。溃疡程度宏观评价得分按中国食品药品监督管理局标准（出版物第 号，年修订）计算：溃疡抑制率（损伤组溃疡面积给药组溃疡面积）损伤组溃疡面积 结果与分析 不同提取物抑制幽门螺旋杆菌的活性差异 抑菌圈的测定。以幽门螺旋杆菌 和 为试验菌株，测定各提取物溶液抑菌圈直径大小，结果见表。由表 可知，黄芪提取物、甘草提取物的抑菌圈直径均大于 ，对幽门螺旋杆菌 和 抑菌作用强，说明黄芪提取物和甘草提取物具有较强的抗幽门螺旋杆菌活性。对 而言，蒲公英提取物、陈皮提取物、葛根提取物抑菌圈均为 ，抗菌活性弱；对 而言，陈皮提取物、葛根提取物的抑菌圈大于 ，表现出一定的抗菌活性。表 提取物对 和 的抑菌圈直径 单位：样品 黄芪提取物 蒲公英提取物 陈皮提取物 甘草提取物 葛根提取物 注：同列不同小写字母表示处理间差异显著（）。：（）最小抑制浓度的测定。由表 可知，甘草提取物对幽门螺旋杆菌的抑制浓度最小，为 ，抑菌作用强；葛根提取物对幽门螺旋杆菌的抑制浓度较小，为 ，抑菌作用较强。黄芪提取物、蒲公英提取物、陈皮提 取 物 对 和 最 小 抑 制 浓 度 均 大 于 ，抑菌活性弱。表 提取物抗幽门螺旋杆菌的最小抑菌浓度 单位：样品 黄芪提取物 蒲公英提取物 陈皮提取物 甘草提取物 葛根提取物 注：同列不同小写字母表示处理间差异显著（）。：（）不同提取物的体外抗炎活性分析 通过典型的 法检测不同浓度提取物对 诱导的巨噬细胞炎症反应模型中降低 释放量的效果，结果如图 所示。从图 可见，细胞经过 刺激后，含量相对于对照组（）明显升高。黄芪提取物、蒲公英提取物、陈皮提取物、甘 草 提 取 物 在 低 浓 度 时 抗 炎 效 果 不 明 显，浓 度 达 到 时甘草提取物、葛根提取物表现出较强的抗炎活性，其中葛根提取物缓解炎症的效果最好。注：表示与 组差异极显著（），表示与 组差异显著（），表示与 组差异极显著（）。：（），（），（）图 不同浓度样品对 细胞 释放量的影响 不同提取物对胃黏膜上皮细胞的损伤修复分析 分别考察了不同样品的作用浓度（、）对 细胞活力的影响，结果如图 所示。从图 可见，在设置浓度范围内，细胞的增殖率均在 附近，表现出明显的促进细胞生长的作用。猴头菌提取物对细胞增殖的促进作用具有浓度依赖性，随浓度的增大效果越好；茯苓提取物在 时的增殖率低于 和 ，其中 时增殖率最高。不同提取物对酒精损伤大鼠胃溃疡的抑制作用 为观察各组方的胃保护作用，对胃黏膜病变进行了显微观察。如 卷 期 王雨阳等 几种药食两用类物质对酒精性胃黏膜损伤的保护及其抑制幽门螺旋杆菌作用图 所示，对照组未见病变条带，模型组大鼠胃黏膜有明显的充血或坏死。与模型组相比，各组方处理组胃黏膜损伤明显减轻。溃疡抑制率如图 所示，结果表明，组方 在低浓度和高浓度时对胃黏膜上皮细胞的保护作用不明显。组方 和组方 在低浓度和高浓度时也具有较好的保护作用，各组方均在中浓度时（）时抑制效果最好，均能明显保护胃黏膜上皮细胞，抑制胃溃疡的形成，其中，组方 对大鼠胃溃疡抑制率最为明显。为检测胃组织的病理状态，采用 染色和组织学评分法观察胃组织的组织学变化。胃黏膜组织染色结果显图 不同样品对酒精损伤的 细胞增殖率的影响 图 大鼠胃黏膜显微观察 示（图），对照组胃黏膜组织结构完整，无上皮细胞脱落坏死，未见明显炎性细胞浸润。模型组胃黏膜组织腺体结构紊乱，上皮细胞脱落严重，可见多处坏死灶，伴有广泛的血细胞浸润，且炎症细胞浸润明显。组方 预处理后，上述症状均有不同程度的缓解。病理切片结果表明，组方 具有保护胃黏膜上皮免受酒精损伤和预防溃疡的作用。值得注意的是组方 中 组胃黏膜基本光滑，未见明显的腺结构紊乱，黏膜充血、炎症细胞浸润。组织病理评分结果如图 所示，组方 对胃黏膜具有显著的剂量依赖性保护作用，高浓度时，病理评分较低，说明组方 可能通过降低炎症反应起到胃黏膜保护作用。讨论胃黏膜类疾病，包括消化性溃疡、急慢性胃炎等，是临床常见及多发疾病。随着现代社会生活节奏的加快，该病的发图 不同组方对酒精损伤的大鼠胃溃疡抑制率 生率也逐渐提高，尽管其发生的病理机制尚未完全清楚，但与工作压力过大、创伤、幽门螺旋杆菌感染、大量饮酒、胃酸 安徽农业科学 年分泌过多等多种因素引起的胃黏膜防御与攻击因素平衡的破坏密切相关。急性胃黏膜损伤病变的机制比较复杂，包括乙醇、细菌等侵袭因素对胃黏膜的直接损伤、促进炎症介质的释放、诱导细胞凋亡等，目前认为炎症是胃黏膜抵御内源性和外源性损伤因子的重要病理过程，炎症损害可以导致胃黏膜的损伤和修复过程的受损。图 大鼠胃黏膜组织形态病理观察 图 组织病理切片评分 该研究首先通过幽门螺旋杆菌抑菌试验考察了几种药食两用类物质的提取物对幽门螺旋杆菌的抑制作用，结果表明，黄芪、甘草提取物具有良好的抑菌作用，如果作为胃黏膜损伤修复类产品，能抑制细菌的生长，防止细胞滋生，从而在胃黏膜恢复的过程中减少细菌损害；通过体外抗炎试验，发现葛根、甘草提取物具有较好的缓解炎症的效果。通过构建乙醇处理的胃黏膜上皮细胞 的损伤修复模型，明确了猴头菌、茯苓提取物对损伤的胃上皮细胞增殖具有促进作用。筛选出猴头菌、茯苓、黄芪和甘草提取物按照一定比例混合，制成 种组方，利用体内动物试验考察其对急性胃黏膜损伤的修复作用，结果表明组方（猴头菇、茯苓、黄芪、甘草）在 时对胃急性胃黏膜损伤的修复效果最好。综上所述，笔者利用体外抗幽门螺旋杆菌和抗炎活性试验及体外胃黏膜上皮细胞 的损伤修复试验，以及大鼠体内胃黏膜损伤试验评估了不同药食两用类物质提取物组成的组方的胃黏膜损伤保护作用，该研究结果可为开发具有胃黏膜损伤保护作用的功能食品、保健食品及药品提供科学的理论依据和参考价值。参考文献 阮研硕，赵江燕，李艳梅，等岩藻多糖对急性酒精性胃黏膜损伤的保护作用中国食品学报，（）：孙晓艳，常冰，王炳元，等急性酒精性胃黏膜损伤大鼠胃黏膜组织中 和血浆、血清 的改变现代医药卫生，（）：，卷 期 王雨阳等 几种药食两用类物质对酒精性胃黏膜损伤的保护及其抑制幽门螺旋杆菌作用，（），（）：，（）：刘睿，珠娜，郝云涛，等核桃低聚肽对大鼠胃黏膜损伤的保护作用食品科学，（）：周春晖，廖兵武，段迪，等三种猴头菇口服液对大鼠胃黏膜损伤的保护作用研究食品工业科技，（）：冯小东赤土茯苓苷对运动后小鼠应激性胃溃疡的保护作用动物医学进展，（）：蔡甜甜，潘华峰，张成哲，等黄芪甲苷保护胃癌前病变大鼠胃黏膜损伤研究中华中医药杂志，（）：虎喜成，田文荣，刘敬霞，等加味陈皮膏治疗慢性萎缩性胃炎临床观察中国中西医结合消化杂志，（）：，：，：潘世杰，丁丽婷，胡婕伦，等茯苓多糖对乙醇致小鼠急性胃黏膜损伤的辅助保护作用食品研究与开发，（）：杨行堂，林永辉，张俊杰，等甘草活性成分抗幽门螺杆菌实验研究同济大学学报（医学版），（）：刘海昀幽门螺旋菌患者应用葛根芩连汤治疗的临床观察健康导报（医学版），（）：赵家彪，廖军蒲公英联合奥美拉唑治疗幽门螺杆菌阳性糜烂性胃炎 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