临床基因检测实验室建设要求.docx

临检试验室建设原则与规定一、高通量测序（NGS）试验室简介1.1 NGS试验室又叫高通量测序检测试验室。NGS是下一代测序技术( Next Generation Sequencing)即高通量测序技术简称。高通量测序技术是对老式Sanger测序（称为一代测序技术）革命性变化, 可同步对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定，同步高通量测序使得对一种物种转录组和基因组进行细致全貌分析成为也许, 也称为深度测序(Deep sequencing)。1.2 由于NGS技术对所检测核酸模板进行大量扩增，轻易出现试验室污染导致检测成果精确性下降；此外NGS技术规定高、影响原因多，试验过程处理不妥易导致检测成果精确性下降或检测失败。因此临床基因扩增检查试验室技术验收和规范化管理是NGS技术自身需要，也是在临床上顺利应用该技术前提。二、NGS试验室临床应用基本条件2.1 必须拥有符合临检中心有关规定原则NGS试验室。2.2 检测设备必须符合原则NGS试验室设置规定：高通量测序仪及配套服务器；高通量测序检测试剂盒；通用电脑；自动分析软件，试验室样本信息管理系统等。2.3 检测人员必须通过专门技能培训，并获得省级以上卫生计生行政部门颁发临床基因扩增检查技术上岗证书。NGS试验室必须建立严格试验室管理制度、建立原则化操作程序（SOP）、建立系列质量管理文献等，保证试验室平常运行符合国家卫生部规定，保证检测成果精确、保证试验室卫生安全，保证试验室长期稳定运行。2.4 NGS临床应用必须在无菌无尘环境下进行操作。三、NGS试验室建设基本规定3.1 主体构造主体为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金50内圆角铝，从而处理轻易污染、积尘、不易打扫等问题。构造牢固，线条简要，美观大方，密封性好。3.2 原则各辨别隔和气压调整将检测过程提成试剂准备、样本制备、PCR扩增和高通量测序四个独立试验区。整个区域有一种整体缓冲走廊。每个独立试验区设置有缓冲区， 同步各区通过气压调整，使整个检测试验过程中试剂和标本免受气溶胶污染并减少扩增产物对人员和环境污染。可打开缓冲区和 PCR 扩增区排风扇往外排气，在试验区外墙上和各扇门上都安装有风量可调回风口，空气通过回风口向室内换气。3.3 消毒在每个试验区和缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯，供消毒用。在各区还设置移动紫外线灯，对试验桌进行局部消毒。3.4 机械连锁不锈钢传递窗试剂和标本通过机械连锁不锈钢（不提议使用电子连锁方式）传递窗传递，保证试剂和标本在传递过程中不受污染（人物分流）。3.5 地面地面提议使用PVC卷材地面或自流坪地面，整体性好。便于进行打扫，耐腐蚀。没有条件也可采用水磨石地面，或大块瓷砖（至少800mm800mm）接缝需要不不小于2mm。3.6 照明灯具要选用净化灯具，能到达便于清洗、不积尘特点。3.7 平面布局NGS试验室应根据自己检查项目、所采用检测技术平台和工作量来决定分区多少及各区域空间大小，至少详细需要多少个区，同样是“个体化”，以“工作有序、互不干扰、防止污染、汇报及时”作为基本原则。四、各项目试验室建设原则n 产前筛查与产前诊断（全基因组低拷贝测序技术）1. 试验室平面图图1：产前筛查与诊断试验室平面图2. 技术流程图图2：产前筛查与诊断技术流程图3. 技术参数分区压力温度相对湿度照明专用走廊0Pa20-2540%60%主试验室300LX，其他房间200300LX缓冲区+5Pa试剂准备室+15Pa标本与文库制备区+10Pa文库扩增与检测区-5Pa测序区-10Pa4. 分区功能4.1 试剂准备室重要功能：在NGS过程中使用到试剂配制、分装和保留。4.2 标本与文库制备区重要功能：血液处理、血浆制备、DNA提取、DNA片段化、DNA样品纯化、DNA浓度检测、末端修复、接头连接、构建样本测序文库。4.3 文库扩增与检测区重要功能：文库构建后PCR扩增与纯化、文库浓度检测、文库混合及混合后质检分析。4.4 测序区重要功能：测序模板制备（乳液PCR与磁珠富集回收）、上机测序、数据分析、汇报审核及发放。5. 仪器配置5.1 试剂准备室重要仪器设备：加样器、冰箱、分析天平、微量台式离心机、涡旋振荡器、移液器、可移动紫外灯和超净工作台等。5.2 标本与文库制备区重要仪器设备：冷冻离心机、微量台式离心机、掌上三管离心机、涡旋震荡器、垂直混合仪、移液器、可移动紫外灯、生物安全柜、冰箱、托盘天平、Qubit 2.0核酸定量仪、电脑（可连接互联网）、条形码打印机、一般打印机、扫描枪、磁力架等。5.3 文库扩增与检测区重要仪器设备：PCR仪、QPCR仪、Qubit2.0核酸定量仪、可移动紫外灯、超净工作台、冰箱、微量台式离心机、涡旋振荡器、UPS、冰箱、移液器、磁力架等。5.4 测序区重要仪器设备：高通量测序仪、PC电脑、打印机、UPS、恒温金属浴、纯水仪、冰箱、微量台式离心机、涡旋振荡器、移液器、超净工作台、可移动紫外灯、磁力架、PCR仪等。n 胚胎植入前遗传学诊断（全基因组低拷贝测序）1. 试验室平面图图3：PGD试验室平面图2. 技术流程图图4：PGD技术流程图3. 技术参数分区压力温度相对湿度照明专用走廊0Pa20-2540%60%主试验室300LX，其他房间200300LX缓冲区+5Pa试剂准备室+15PaWGA制备室+10pa扩增一区-5pa标本检测区-10Pa测序区-15Pa电泳区0Pa4. 分区功能4.1 试剂准备室重要功能：在NGS过程中使用到试剂配制、分装和保留。4.2 WGA制备区重要功能：基因组DNA释放、全基因组DNA扩增。4.3 电泳区重要功能： DNA电泳检测及成果反馈、DNA打断等4.4 扩增一区重要功能：DNA片段末端修复与纯化、接头连接与纯化、文库混合、缺口平移。4.5 文库检测区重要功能：文库浓度质检分析。4.6 测序区重要功能：测序模板制备（乳液PCR与磁珠富集回收）、上机测序、数据分析、汇报审核及发放。5. 仪器配置5.1 试剂准备区重要仪器设备：冰箱、分析天平、微量台式离心机、涡旋振荡器、移液器、可移动紫外灯和超净工作台等。5.2 电泳区重要仪器设备：电泳仪、微波炉、凝胶成像仪、冰箱、掌式离心机、涡旋振荡器、移液器、可移动紫外灯等。5.3 WGA制备区重要仪器设备：PCR仪、超净工作台、冰箱、掌式离心机、涡旋振荡器、移液器、可移动紫外灯等。5.4 扩增一区重要仪器设备：PCR仪、可移动紫外灯、超净工作台、冰箱、微量台式离心机、涡旋振荡器、UPS、移液器、磁力架等。5.5 文库检测区重要仪器设备： QPCR仪、Qubit2.0核酸定量仪、可移动紫外灯、超净工作台、冰箱、微量台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、移液器等。5.6 测序区重要仪器设备：高通量测序仪、PC电脑、打印机、UPS、恒温金属浴、纯水仪、冰箱、微量台式离心机、涡旋振荡器、移液器、超净工作台、可移动紫外灯、磁力架、PCR仪等。n 遗传病诊断+肿瘤诊断与治疗（杂交捕捉测序技术+Sanger测序验证）1. 试验室平面图图5：肿瘤诊断试验室平面图2. 技术流程图图6：肿瘤诊断技术流程图图7：一代测序试验流程图3. 技术参数分区压力温度相对湿度照明洁净走廊0Pa20-2540%60%主试验室300LX，其他房间200300LX缓冲区+5Pa试剂准备室+15Pa标本与文库制备区+10PaDNA打断区+10Pa杂交捕捉区（扩增一区）-5Pa文库扩增区（扩增二区）-10Pa文库检测区-10Pa测序区-15Pa电泳区0 Pa4. 分区功能4.1 试剂准备区重要功能：在NGS过程中使用到试剂配制、分装和保留。4.2 标本与文库制备区重要功能：样本接受、样本前处理、全基因组DNA提取以及多种样本DNA或者RNA提取、DNA片段化、DNA纯化、DNA浓度测定、DNA片段末端修复与纯化、接头连接与纯化。4.3 DNA打断区重要功能： DNA打断（片段化）。4.4 电泳区重要功能： 片段化DNA电泳检测及成果反馈。4.5 杂交捕捉区（扩增一区）重要功能：目DNA片段杂交捕捉与纯化，Sanger测序目片段扩增与纯化、Sanger测序PCR前准备。4.6 文库扩增区（扩增二区）重要功能：杂交捕捉后扩增与纯化、文库浓度质检分析、及Sanger测序PCR扩增反应与纯化。4.7 测序区重要功能：测序模板制备（乳液PCR与磁珠富集回收）、上机测序、及Sanger测序。5. 仪器配置5.1 试剂准备区重要仪器设备：加样器、冰箱、分析天平、微量台式离心机、涡旋振荡器、移液器、可移动紫外灯和超净工作台等。5.2 标本与文库制备区重要仪器设备：微量台式离心机、掌上三管离心机、恒温金属浴、移液器、可移动紫外灯、生物安全柜、冰箱、托盘天平、Qubit 2.0核酸定量仪、PCR仪、电脑（可连接互联网）、条形码打印机、一般打印机、扫描枪等。5.3 DNA打断区重要仪器设备：Covaris S220超声波打断仪、冰箱、掌式离心机、涡旋振荡器、移液器、可移动紫外灯等。5.4 电泳区重要仪器设备：电泳仪、微波炉、凝胶成像仪、冰箱、掌式离心机、涡旋振荡器、移液器、可移动紫外灯等。5.5 杂交捕捉区（扩增一区）重要仪器设备：PCR仪、可移动紫外灯、超净工作台、冰箱、微量台式离心机、涡旋振荡器等。5.6 文库扩增区（扩增二区）重要仪器设备：PCR仪、Qubit 2.0核酸定量仪、微量台式离心机、掌上三管离心机、涡旋震荡器、移液器、可移动紫外灯、超净工作台、冰箱、磁力架等。5.7 测序区重要仪器设备：高通量测序仪、Sanger测序仪、PC电脑、打印机、UPS、恒温金属浴、纯水仪、冰箱、微量台式离心机、涡旋振荡器、移液器、超净工作台、可移动紫外灯、磁力架、PCR仪等。