绍兴鸭血清生殖激素及下丘脑开产相关基因的鉴定分析_饶琳洁.pdf

3期755绍兴鸭血清生殖激素及下丘脑开产相关基因的鉴定分析饶琳洁1，张危红2，魏岳2，黎观红1，谢金防2，韦启鹏2*，黄江南2*（1江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌330045；2江西省农业科学院畜牧兽医研究所，江西南昌330299）摘要：【目的】比较开产和未开产绍兴鸭血清中的生殖激素水平，挖掘下丘脑组织中与开产性状相关的候选基因，为利用分子标记进行鸭开产性状选育打下理论基础。【方法】以105和128日龄开产与未开产绍兴鸭为研究对象，采用放射免疫测定法（RIA）测定血清中雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH）的浓度，利用转录组测序技术筛选105日龄开产与未开产绍兴鸭下丘脑组织中的差异表达基因（DEGs），通过GO和KEGG数据库对DEGs进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析，并以实时荧光定量PCR验证转录组数据的准确性。【结果】在105和128日龄，开产绍兴鸭血清的E2浓度极显著高于未开产绍兴鸭（P0.01，下同），LH浓度显著低于未开产绍兴鸭（P0.05），与转录组测序结果一致。【结论】从绍兴鸭下丘脑组织筛选到的NPY、GnIH、TRH和HSP70等DEGs通过神经活性配体受体相互作用和内吞作用等信号通路，作用于下丘脑垂体性腺轴，影响E2、FSH和LH等生殖激素的分泌与释放，进而调控绍兴鸭的开产时间。关键词：绍兴鸭；生殖激素；下丘脑；性成熟；转录组测序中图分类号：S834.89文献标志码：A文章编号：2095-1191（2023）03-0755-09收稿日期：2023-01-02基金项目：国家自然科学基金项目（32160786）；国家水禽产业技术体系建设专项（CARS-42）；江西省重点研发计划项目（20192BBF60028）；江西省家禽产业技术体系建设专项（JXRS-09）通讯作者：韦启鹏（1966-），https:/orcid.org/0000-0001-7840-6017，研究员，主要从事畜禽健康养殖研究工作，E-mail：；黄江南（1984-），https:/orcid.org/0000-0002-1588-342X，博士，副研究员，主要从事家禽遗传育种与繁殖研究工作，E-mail：第一作者：饶琳洁（1996-），https:/orcid.org/0000-0002-2039-1796，研究方向为家禽遗传育种与繁殖，E-mail：南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023，54（3）：755-763ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.03.011Identification and analysis of serum reproductive hormones andgenes related to laying in hypothalamus of Shaoxing DucksRAO Lin-jie1，ZHANG Wei-hong2，WEI Yue2，LI Guan-hong1，XIE Jin-fang2，WEI Qi-peng2*，HUANG Jiang-nan2*（1College ofAnimal Science and Technology，JiangxiAgricultural University，Nanchang，Jiangxi 330045，China；2Insti-tute ofAnimal Husbandry and Veterinary，JiangxiAcademy ofAgricultural Science，Nanchang，Jiangxi 330299，China）Abstract：【Objective】The purpose of the study was to compare the levles of reproductive hormone in serum oflaying and pre-laying Shaoxing Ducks and to screen the candidate genes related to laying traits in the hypothalamic tissue，so as to provide a theoretical basis for use of molecular markers for the selection of laying performance of ducks.【Method】The 105-day-old and 128-day-old laying and pre-laying Shaoxing Ducks were selected as the research subjects.The con-centrations of estrogen（E2），follicle stimulating hormone（FSH）and luteinizing hormone（LH）in serum were deter-mined by radioimmunoassay（RIA）.Differentially expressed genes（DEGs）of 105-day-old laying and pre-laying Shao-xing Ducks in the hypothalamus tissues were screened by transcriptome sequencing.GO functional annotation and KEGGsignaling pathway enrichment analysis were performed on DEGs through GO and KEGG databases，and the accuracy of54卷南 方 农 业 学 报 7560引言【研究意义】绍兴鸭是我国著名的蛋鸭品种，具有性成熟早、产蛋量高、适应性强等优良特性，是笼养的最佳蛋鸭品种（陈海燕等，2003）。开产日龄不仅影响鸭群开产后产蛋率的增长速度、产蛋高峰值及其持续时间，还影响总产蛋量、蛋重和产蛋期的成活率（徐文芳和钟仙龙，2014；张少伟等，2018；操勇清等，2020b）。因此，开展鸭性成熟调控机制研究可为解决蛋鸭开产晚甚至不产蛋提供新的解决方案，对推进高产蛋鸭育种具有重要意义。【前人研究进展】性成熟启动早晚是衡量家禽产蛋性能的重要指标之一，而决定性成熟启动的关键性事件是下丘脑脉冲式释放促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）的增加（Bdcarrats et al.，2009；梁薇和陈忠，2016）。下丘脑分泌的GnRH经垂体门脉系统作用于垂体腺细胞，促进垂体前叶促性腺激素细胞释放卵泡刺激素（Follicle stimulatinghormone，FSH）和黄体生成素（Luteinizing hormone，LH），FSH和LH通过血液循环作用于性腺，从而促使动物性成熟（叶丹等，2003）。大量研究表明，家禽下丘脑垂体性腺轴中诸多通路和基因参与调控产蛋性能。Liu等（2018）发现下丘脑泌素和前阿片黑素细胞皮质激素是鹅就巢的先决条件，垂体中原癌基因c-Fos、热休克蛋白90-、细胞周期蛋白依赖性激酶1等可传导鹅繁殖轴的就巢信号；黄丽华（2019）研究发现，在高产和低产的白羽番鸭卵巢中POSTN、COL4A1、SMOC1和SDC4等个差异表达基因（Diffe-rentially expressed genes，DEGs）在PI3K-Akt信号通路中调控卵巢生理功能；操勇清等（2020a）通过研究金定鸭卵抑制剂基因（OIH）和促性腺激素抑制激素基因（GnIH）多态性与其产蛋量、开产日龄的相关性，确定OIH和GnIH基因可作为金定鸭分子标记辅助育种的候选基因；Mishra等（2020）从高、低产蛋鸡群的下丘脑、垂体、卵巢组织中分别鉴定出10、414和356个DEGs，且证实DEGs主要参与调节mTOR信号通路、JAK/STAT信号通路及PI3K/Akt信号通路；高广亮等（2021）研究发现，GnIH基因上有11个SNPs位点与四川白鹅的初产蛋数量性状呈显著相关；唐现文等（2021）对高邮鸭双黄蛋高、低产组卵巢组织进行转录组测序分析，筛选出18个差异表达lncRNA及对应的靶基因，可能参与高邮鸭双黄蛋性状调控。【本研究切入点】目前，针对蛋鸭开产性状相关基因的研究较少，有关蛋鸭开产和未开产下丘脑组织基因表达变化的研究尚无文献报道。【拟解决的关键问题】通过测定开产和未开产绍兴鸭血清生殖激素水平，筛选下丘脑中的DEGs，鉴定与开产性状相关的候选基因，以期为利用分子标记进行鸭开产性状选育打下理论基础。1材料与方法1.1试验动物及样品采集试验选取的绍兴鸭由浙江省诸暨市国家级绍兴鸭保种场提供。（1）选取105和128日龄开产与未开transcriptome data was verified by real-time fluorescence quantitative PCR.【Result】At 105-day-old and 128-day-old，theconcentrations of E2in the serum of laying Shaoxing Ducks were extremely significantly higher than those of pre-layingShaoxing Ducks（P0.01，the same below），and the concentrations of LH in the serum of laying Shaoxing Ducks weresignificantly lower than those of pre-laying Shaoxing Ducks（P0.05），whichwerebasicallyconsistentwiththetranscriptomesequencingresults.【Conclusion】The DEGs such asNPY，GnIH，TRHandHSP70screened from the hypothalamus of Shaoxing Ducks act on the hypotha-lamus-pituitary-gonadal axis through signaling pathways such as neuroactive ligand-receptor interaction and endocytosis，and affect the secretion and release of reproductive hormones such as E2，FSH and LH，and then regulate the time of layingin Shaoxing Ducks.Key words：Shaoxing Duck；reproductive hormone；hypothalamus；sexual maturity；transcriptome sequencingFoundation items：National Natural Science Foundation of China（3210786）；National Waterfowl Industry Techno-logy System（CARS-42）；Jiangxi Key Research and Development Project（20192BBF60028）；Jiangxi Waterfowl Indus-try Technology System Cobstruction Project（JXARS-09）3期757产的绍兴鸭，按照日龄和性成熟状态将其分为105日龄开产、105日龄未开产、128日龄开产和128日龄未开产4个处理组。翅下静脉采血，每组采集8羽。采集的血样室温静置2 h后2500 r/min离心10 min，收集血清，-80 冰箱保存备用。（2）选取105日龄开产和未开产的绍兴鸭各8羽，设4个处理组（开产I组和开产II组，未开产I组和未开产II组）。将采集的下丘脑组织放入冻存管，液氮速冻保存，用于后续的转录组测序。1.2生殖激素测定采用放射免疫测定法（RIA）测定血清中的雌二醇（Estrone，E2）、LH和FSH，其中，E2试剂盒购自美国ABRaxis公司，LH和FSH试剂盒购自北京北方生物技术研究所有限公司。1.3转录组测序按照TRIzol试剂盒 SK1311，生工生物工程（上海）股份有限公司 说明提取4组绍兴鸭下丘脑总RNA，以1.2%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。各样本取3 g总RNA，按NEBNextUltra RNA Library Prep Kit forIllumina操作说明，利用Illumina HiSeq 2000测序平台构建100 bp配对末端的cDNA文库。采用Cuf-flinks（http:/cufflinks.cbcb.umd.edu/）计算每个基因的表达量RPKM（Trapnell et al.，2012），以DESeq R（1.10.1）软件包筛选DEGs（Anders and Huber，2010），筛选标准为P0.05和|log2Fold Change|1，并通过GO和KEGG数据库对筛选获得的DEGs进行GO功能注释分析和KEGG信号通路富集分析（段修军等，2022a，2022b）。1.4实时荧光定量PCR验证通过实时荧光定量PCR检测NPY、WIF1、FASN、ITIH2、HSP70、Ret和GDF10等6个DEGs的相对表达量，以验证转录组测序结果的准确性（Higginson etal.，2022）。采用Primer 5.0设计引物（表1），其中HSP70引物序列参照Zeng等（2013）的研究方法，所有引物均委托上海英俊生物技术有限公司合成。以-actin为内参基因，采用2-Ct法换算目的基因相对表达量。1.5统计分析采用SPSS 22.0对试验数据进行统计整理，并以t检验进行差异显著性分析。2结果与分析2.1不同日龄绍兴鸭血清中的生殖激素浓度在105和128日龄，与未开产绍兴鸭相比，开产绍兴鸭血清中的E2浓度极显著升高（P0.01，下同），而LH浓度显著降低（P0.05），而WIF1、HSP70和Ret基因在开产绍兴鸭下丘脑中的相对表达量显著低于未开产绍兴鸭。实时荧光定量PCR验证结果与转录组测序结果一致，说明转录组测序结果可靠。3讨论禽类繁殖性能主要由下丘脑分泌的GnRH、垂体分泌的LH和FSH，以及卵巢分泌的孕酮和E2共同调节（陈习中等，2005；李晓坤等，2022）。由于测定下丘脑门脉血中的GnRH浓度较困难，通常选择多时处理组Treatment group未开产I组 Pre-laying I group未开产II组 Pre-laying II group开产I组 Laying I group开产II组 Laying II group原始序列（条）Raw reads31222407357287603323633131825762有效序列（条）Clean reads30067657344579563200422130674265有效碱基（Gb）Clean bases3.013.453.203.07错误率（%）Error rate0.030.040.030.03Q20（%）97.7996.4997.7197.81Q30（%）92.9189.0993.2693.00GC含量（%）GC content49.8449.8649.3649.53表 2转录组测序数据质量评估结果Table 2Sequencing data quality assessment of transcriptome图 1不同日龄开产与未开产绍兴鸭血清中生殖激素浓度的变化趋势Fig.1ChangesofreproductivehormoneconcentrationinserumoflayingShaoxingDucksandpre-layingShaoxingDucksat different days of age*表示差异显著（P0.05）；*表示差异极显著（P0.01）。图3同*represented significant difference（P0.05）；*represented extremelysignificant difference（P0.01）.The same was applied in Fig.32502001501005000.500.450.400.350.300.250.200.150.100.050.003.53.02.52.01.51.00.50.0*FSH浓度（mU/mL）FSH concentration105日龄未开产 105日龄开产 128日龄未开产 128日龄开产LH浓度（mU/mL）LH concentrationE2浓度（pg/mL）E2concentration处理组 Treatment group105日龄未开产 105日龄开产 128日龄未开产 128日龄开产处理组 Treatment group105日龄未开产 105日龄开产 128日龄未开产 128日龄开产处理组 Treatment group3期759基因GeneCALCNPYGALAGDF10CRIP1WIF1TTHYPmchISG15HLH13NEU2GnIHNEU1PTHRHA1FSC6A4TPH2SNX8HSP70HSP30SPP1RetHECD4TY3H基因定义Gene definitionCalcitoninPro-neuropeptide YGalanin peptidesGrowth differentiation factor 10Cysteine-rich protein 1Wnt inhibitory factor 1TransthyretinPro-melanin-concentrating hormoneISG15 ubiquitin-like modifierHelix-loop-helix protein 13Neurophysin 2Gonadotropin inhibitory hormone peptidesNeurophysin 1Parathyroid hormone-related proteinClass I histocompatibility antigenSodium-dependent serotonin transporterTryptophan 5-hydroxylase 2Sorting nexin 8Heat shock protein 70Heat shock protein 30Secreted phosphoprotein 1Ret proto-oncogeneProbable E3 ubiquitin-protein ligaseTyrosine 3-monooxygenaseP0.0010.0010.0010.050.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.050.0010.0010.0010.0010.0010.001差异倍数（开产/未开产）Fold change（laying/pre-laying）2.582.753.032.534.094.716.046.316.457.3116.9219.2823.7723.780.0090.040.060.360.2130.230.180.400.290.29表 3105日龄开产与未开产绍兴鸭下丘脑组织中的部分DEGsTable 3Partial DEGs in hypothalamus tissue of 105-day-old laying and pre-laying Shaoxing ducks图 2DEGs富集分析结果Fig.2Enrichment analysis of DEGsA：DEGs的GO功能注释分析；B：DEGs的KEGG信号通路富集分析A：GO functional annotation analysis of DEGs；B：KEGG signal pathway enrichment analysis of DEGsCell motilityTransmembrane receptor protein kinase.Maintenance of cell polarityNitic-oxide synthase bindingApoptotic signaling pathwayEmbryonic eye morphogenesisHeat shock protein bindingNervous system developmentAronatic amino acid family metabolic.Pyridoxal phosphate bindingHormone activityCentral nervous system development01234567DEGs数量 Number of DEGs02468Metabolic patlrwaysMAPK signaling pathwayCardiac muscle contractionAlanine，aspartate and glutamate.Vascular smooth muscle contractionTaurine and hypotaurine metabolismTryptophan metabolismEndocytosisTyrosine metabolismNeuroactive ligand-receptor interactionABDEGs数量 Number of DEGsGO功能条目 GO termKEGG信号通路 KEGG pathway饶琳洁等：绍兴鸭血清生殖激素及下丘脑开产相关基因的鉴定分析54卷南 方 农 业 学 报 760图 3105日龄开产与未开产绍兴鸭下丘脑中DEGs的实时荧光定量PCR检测结果Fig.3Real-time fluorescence quantitative PCR assay resultsof DEGs in the hypothalamus of 105-day-age layingand pre-laying Shaoxing Ducks表 4DEGs在GO功能条目（排名前12）中的注释情况Table 4DEGs annotation in GO functional items（top 12）表 5差DEGs在KEGG信号通路（排名前10）上的富集情况Table 5Enrichment of DEGs in KEGG signal pathway（top 10）GO功能条目 GO functional item中枢神经系统发育Central nervous system development激素活性 Hormone activity磷酸吡哆醛结合Pyridoxal phosphate binding芳香氨基酸族代谢过程Aromatic amino acid family metabolic process神经系统发育 Nervous system development热休克蛋白结合 Heat shock protein binding胚胎眼形态发生 Embryonic eye morphogenesis凋亡信号通路Apoptotic signaling pathway一氧化氮合酶结合 Nitric-oxide synthase binding细胞极性维持 Maintenance of cell polarity跨膜受体蛋白激酶活性Transmembrane receptor protein kinase activity细胞迁移 Cell motility基因数量 Gene number444272231125P0.0410.0010.0010.0010.0020.0070.0030.0350.0350.0350.0350.035DEGsNPY、SLC1a2、ZBTB16、ERBB2SACS、GAL、CALCA、NPYGAD1、RET、DDC、PDXKTH、TH2NPY、RET、TH、ZBTB16、TAT、Hipk2、GALSacsin、CHORDTH、Hipk2RET、BAG3、Hipk2SLC6a4DSTBMPR2、ERBB2SPECC1L、BMPR2、DST、RET、ERBB2KEGG信号通路 KEGG signal pathway神经活性配体受体相互作用Neuroactive ligand-receptor interaction酪氨酸代谢 Tyrosine metabolism内吞作用 Endocytosis色氨酸代谢 Tryptophan metabolism牛磺酸和亚牛磺酸代谢Taurine and hypotaurine metabolism血管平滑肌收缩Vascular smooth muscle contraction丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢Alanine，aspartate and glutamate metabolism心肌收缩 Cardiac muscle contractionMAPK信号通路 MAPK signal pathway代谢途径 Metabolic pathways基因数量 Gene number6232242115P0.010.010.010.010.040.030.030.040.070.05DEGsAVP、GAL、OX、NPY、GABRB2、GABARBDDC、THRET、ERBB4、BF1DDC、TPH2GAD1、GAD67AVP、CALCA、CALC、calcitoninGAD1、GAD67CACNA2D1CACNA2D1DDC、TPH2、TH、GAD1、GAD67相对表达量Relative expression20181614121086420NPY WIFIFASN ITIH2 GDF10 HSP70Ret*未开产 Pre-laying开产 Laying段监测外周血中的LH浓度来反映GnRH分泌情况。E2的生理功能是促进雌性动物性成熟和第二性征表现（刘凌斌，2013），还能增加血液中的钙、磷和脂肪含量，从而促进蛋黄合成、蛋清分泌及蛋壳形成（Ojeda et al.，1980）。本研究结果表明，在相同日龄下，开产绍兴鸭血清中的E2浓度极显著高于未开产绍兴鸭，故推测血清E2浓度的升高与蛋鸭开产时间密切相关。动物在性成熟前，E2不仅对GnRH的分泌起抑制作用，还能抑制GnRH对FSH的诱导作用，但GnRH对LH的诱导受E2的影响作用较弱（关洪斌和李庆章，2002；曹晓涵，2013）。在FSH和LH的协同作用下，能启动产蛋并维持产蛋高峰（傅启高，2000）。同时，有研究证实母鸭血清中的LH浓度在开产前先直线上升，但从开产前1周到产第1个蛋时迅速下降（Tao et al.，2017）。本研究中，105和128日龄开产与未开产绍兴鸭血清中的生殖激素浓度变化趋势与Tao等（2017）的研究结果一致，即开产绍兴鸭血清中的E2浓度极显著高于未开产绍兴鸭，而FSH和LH的浓度著低于未开产绍兴鸭。本研究从105日龄开产和未开产绍兴鸭的下丘脑组织共筛选出617个DEGs，GO功能注释分析发现注释到神经系统发育功能条目的DEGs数量最多（NPY、RET、TH、ZBTB16、TAT、Hipk2和GAL基因），基因 Gene3期761KEGG信号通路富集分析显示富集到神经活性配体受体相互作用信号通路的DEGs数量最多（AVP、GAL、OX、NPY、GABRB2和GABARB基因）。神经活性配体受体相互作用信号通路在鸭的卵泡发育过程中发挥重要调控作用（Tao et al.，2017）。NPY广泛存在于无脊椎动物及所有脊椎动物体内，是下丘脑分泌的一种多肽（马永华和李南方，2007），可直接作用于下丘脑垂体性腺轴，影响生殖激素的分泌与释放。NPY对繁殖性能的调节作用具有性腺激素依赖性，即正常或高性激素环境下，NPY能促进GnRH分泌，低雌激素水平时则抑制GnRH分泌（倪迎冬等，2005）。周璇等（2020）研究表明天柱番鸭NPY基因多态性与其开产日龄显著相关；曾繁源等（2021）研究发现东兰乌鸡产蛋组下丘脑的NPY基因表达量显著高于未产蛋组。本研究发现，开产绍兴鸭血清中的E2浓度及下丘脑NPY基因相对表达量均显著高于未开产绍兴鸭，与高志浩（2021）的研究结果一致，表明NPY基因在高浓度雌激素环境下对鸭的性成熟启动有促进作用。GnIH可抑制促性腺激素表达及FSH和LH的合成与释放，从而抑制繁殖性能（Pralong，2010）；且能通过其受体直接作用于下丘脑GnRH神经元并抑制GnRH的合成与释放（王坤等，2017）。本研究结果表明，GnIH基因在开产绍兴鸭下丘脑的相对表达量显著高于未开产绍兴鸭，且与FSH和LH的浓度变化趋势相反，说明下丘脑GnIH基因可通过调节FSH和LH的分泌而影响绍兴鸭的开产时间。下丘脑分泌的促甲状腺激素释放激素（TRH）与腺垂体促甲状腺激素细胞膜上的TRH受体（TRHR）结合后，促进垂体催乳素（PRL）和生长激素（GH）的释放（Peeters et al.，2006）。在本研究中，TRH基因在开产绍兴鸭下丘脑的相对表达量显著高于未开产绍兴鸭，与张燕燕（2022）的研究结果相似，暗示着下丘脑中TRH基因高表达能提早蛋鸭的性成熟时间。HSP70是一个抗氧化应激的标志物，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡特性（杨亦青等，2021）。HSP70基因在胚胎的正常发育过程中起正向调节作用（Neuer et al.，1998）。Maak等（2003）研究发现产蛋期鹅卵巢HSP70基因的表达量与就巢期鹅相比显著降低；曾涛等（2013）研究证实HSP70基因多态位性与夏季蛋鸭产蛋性能显著相关；Meng等（2020）研究表明，在猪卵巢颗粒细胞中HSP70基因可降低FSHR和CYP19A1启动子的活性，同时抑制E2合成。本研究中，HSP70基因在开产绍兴鸭下丘脑组织中的表达呈下调趋势，与E2的浓度变化趋势相反，表明HSP70基因可能通过抑制机体E2合成而影响蛋鸭的开产时间。4结论从绍兴鸭下丘脑组织筛选到的NPY、GnIH、TRH和HSP70等DEGs通过神经活性配体受体相互作用和内吞作用等信号通路，作用于下丘脑垂体性腺轴，影响E2、FSH和LH等生殖激素的分泌与释放，进而调控绍兴鸭的开产时间。参考文献：操勇清，曾涛，刘国发，周玮，石放雄，卢立志.2020a.金定鸭卵抑制剂基因（OIH）和促性腺激素抑制激素基因（GnIH）多态性与产蛋性能的相关性研究 J.农业生物技术学报，28（2）：282-290.Cao Y Q，Zeng T，Liu G F，Zhou W，Shi F X，Lu L Z.2020a.Correlation study onpolymorphism of Ovoinhibitor（OIH）and Gonadotropin-inhibitor hormone（GnIH）with laying performance inJinding duck（Anas platyrhynchos domestica）J.Jour-nal of Agricultural Biotechnology，28（2）：282-290.doi：10.3969/j.issn.1674-7968.2020.02.010.操勇清，曾涛，沈军达，陈黎，刘国发，周玮，石放雄，卢立志.2020b.6个蛋鸭品种产蛋性能比较分析 J.中国畜牧杂志，56（4）：41-45.Cao Y Q，Zeng T，Sheng J D，Chen L，Liu G F，Zhou W，Shi F X，Liu L Z.2020b.Comparisionand analysis of egg production performance in six lauingduck breedsJ.Chinese Journal of 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